牛奶蛋白過(guò)敏患兒維生素D代謝酶和其受體水平

李傳應(yīng) 吳 成

牛奶蛋白過(guò)敏(cow’s milk protein allergy, CMPA)是由牛奶蛋白引起的一種變態(tài)反應(yīng)，多見(jiàn)于嬰幼兒[1]。CMPA可影響全身多個(gè)系統(tǒng)，并以消化系統(tǒng)癥狀和皮膚癥狀為主要表現(xiàn)[1-2]。CMPA若沒(méi)有得到及時(shí)、正確的診斷和治療，可導(dǎo)致遷延性腹瀉、嘔吐、食欲低下，引起患兒生長(zhǎng)發(fā)育障礙、缺鐵性貧血、低蛋白血癥等危害，嚴(yán)重影響患兒生活質(zhì)量[1-3]。

維生素D是一種脂溶性維生素，可以促進(jìn)皮膚細(xì)胞生長(zhǎng)、分化及調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能[4]。維生素D代謝物25 羥維生素D [25-hydroxy vitamin D, 25(OH)D]在CMPA患者體內(nèi)水平顯著降低[5]，前期研究[3]也發(fā)現(xiàn)維生素 D 聯(lián)合游離氨基酸治療CMPA 患兒效果優(yōu)于單一游離氨基酸 。維生素D生物學(xué)效應(yīng)主要是通過(guò)其受體(vitamin D receptor, VDR)發(fā)揮[4]。此外，維生素D在機(jī)體內(nèi)活化以及代謝滅活過(guò)程受多種代謝酶的影響[6]。CMPA中25(OH)D水平低下和生物學(xué)功能異常是否與上述調(diào)控因素有關(guān)尚未明確。本研究旨在明確CMPA中VDR和維生素D代謝酶水平變化，研究其與CMPA病情程度聯(lián)系為臨床CMPA診斷和治療提供潛在的生物學(xué)靶點(diǎn)，也為進(jìn)一步揭示CMPA發(fā)病機(jī)理提供一定的參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集安徽省兒童醫(yī)院2018年5月至2020年5月診治的32例CMPA患兒為研究對(duì)象(試驗(yàn)組)，其中男性13例，女性19 例；月齡2～5個(gè)月。根據(jù)其過(guò)敏癥狀輕重程度，將試驗(yàn)組患兒分為輕中度組(20例)和重度組(12例)。CMPA判斷標(biāo)準(zhǔn)[7]：輕度具有以下一種癥狀，①嘔吐、便秘、便血、腹瀉等胃腸道反應(yīng)；②慢性咳嗽、非感染性流涕及喘息等呼吸系統(tǒng)表現(xiàn)；③皮膚出現(xiàn)紅斑、血管性水腫、濕疹樣表現(xiàn)等；④持續(xù)腸痙攣≥3 h/d，≥3次/周，持續(xù)≥3周。中度具有上述胃腸道反應(yīng)、呼吸系統(tǒng)、皮膚等多種表現(xiàn)。重度為上述表現(xiàn)加重，且出現(xiàn)嚴(yán)重過(guò)敏反應(yīng)、呼吸困難、血壓下降等。此外選取同期于本院進(jìn)行健康體檢的17例健康嬰幼兒作為對(duì)照組，其中男性5例，女性12例，月齡2～6個(gè)月。

試驗(yàn)組和對(duì)照組對(duì)象性別構(gòu)成、月齡、體質(zhì)量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05) ，具有可比性。見(jiàn)表1。輕中度組和重度組患兒性別構(gòu)成、幼兒月齡、喂養(yǎng)方式及體質(zhì)量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05) ，具有可比性。見(jiàn)表2。試驗(yàn)組和對(duì)照組對(duì)象均進(jìn)行常規(guī)性維生素D補(bǔ)充(伊可新，每粒含維生素D3 500 IU)，1次1粒，1天1次。兩組嬰幼兒均無(wú)黃疸，也未行光照療法。試驗(yàn)組和對(duì)照組資料和樣本獲取均獲得知情同意。本研究已獲安徽省兒童醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理批文號(hào)：EYLL-2019-029)。

表1 試驗(yàn)組和對(duì)照組對(duì)象一般資料對(duì)比

表2 輕中度組和重度組患兒一般資料對(duì)比

納入標(biāo)準(zhǔn)：①患兒符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)2013版《中國(guó)嬰幼兒牛奶蛋白過(guò)敏診治循證建議》[7]CMPA 診斷標(biāo)準(zhǔn)；②患兒無(wú)先天性疾??；③患兒均為牛奶人工喂養(yǎng)的正常足月兒；④患兒親屬對(duì)本研究知情同意并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn): ①患兒在確診CMPA前2周內(nèi)有抗組胺使用史; ② 伴有細(xì)菌或者病毒感染者；③合并高鈣血癥、高磷血癥、維生素D增多癥等其他影響維生素D水平的疾病；④合并自身免疫缺陷性疾病的嬰幼兒。

1.2 方法

1.2.1 ELISA法檢測(cè)25(OH)D水平 試驗(yàn)組和對(duì)照組對(duì)象在被納入研究后清晨空腹收集肘靜脈血2 mL置于EP管內(nèi)，常溫靜置后，離心分離出血清，-80℃保存待測(cè)。酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immumosorbent assay，ELISA)檢測(cè)血清25(OH)D水平，ELISA試劑盒由上海將來(lái)實(shí)業(yè)股份有限公司提供。

1.2.2 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)VDR、CYP24A1、CYP27B1基因水平 試驗(yàn)組和對(duì)照組對(duì)象在被納入研究后，空腹收集肘靜脈血2 mL，置于離心管中，密度梯度離心法分離出外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)，加入2 mL含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液，重懸細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)。采用Trizol試劑(TaKaRa大連寶生物)提取細(xì)胞中總RNA，后反轉(zhuǎn)錄為cDNA，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction, PCR)對(duì)細(xì)胞中VDR、CYP24A1、CYP27B1基因水平進(jìn)行檢測(cè)。以三磷酸甘油醛脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)為內(nèi)參基因, 用2-ΔΔCT法分析相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 試驗(yàn)組和對(duì)照組實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較 試驗(yàn)組血清25(OH)D水平低于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 試驗(yàn)組CYP24A1 mRNA相對(duì)表達(dá)量試驗(yàn)組高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。VDR mRNA和CYP27B1 mRNA相對(duì)表達(dá)量?jī)山M間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3。

表3 試驗(yàn)組和對(duì)照組25(OH)D及其受體、代謝酶指標(biāo)比較

2.2 輕中度組和重度組患兒實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較 輕中度組血清25(OH)D水平低于重度組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；輕中度組CYP24A1 mRNA水平低于重度組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。VDR mRNA和CYP27B1 mRNA相對(duì)表達(dá)量?jī)山M之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表4。

表4 輕中度組和重度組25(OH)D及其受體、代謝酶指標(biāo)比較

2.3 相關(guān)性分析 CMPA患者血清25(OH)D水平與住院天數(shù)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.470,P=0.007), CYP24A1 mRNA相對(duì)表達(dá)量與住院天數(shù)呈正相關(guān)(r=0.806,P<0.001)，25(OH)D水平與CYP24A1 mRNA相對(duì)表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)(r=-0.397,P=0.024)。見(jiàn)圖1。

圖1 CMPA患兒25(OH)D、CYP24A1mRNA、住院天數(shù)3者之間相關(guān)性分析

3 討論

維生素D可調(diào)控細(xì)胞增殖、分化和改變其他細(xì)胞生物學(xué)活性，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)、改善糖代謝、調(diào)控腎素血管緊張素水平等多種生物學(xué)效應(yīng)[4]。維生素D參與嬰幼兒多種疾病病理過(guò)程[8]。研究[9-10]發(fā)現(xiàn)，過(guò)敏性哮喘兒童血清中的維生素D代謝物水平低于正常兒童，外源性補(bǔ)充維生素D能有效預(yù)防過(guò)敏性哮喘發(fā)生。也有研究[11]發(fā)現(xiàn)，患兒體內(nèi)25(OH)D水平與過(guò)敏性癥狀持續(xù)時(shí)間具有密切的聯(lián)系，其中25(OH)D水平越低，過(guò)敏癥狀持續(xù)時(shí)間越長(zhǎng)。本研究發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)組患兒外周血25(OH)D水平低于對(duì)照組，輕中度組患兒的25(OH)D水平明顯高于重度組患兒，提示維生素D活性代謝物可能參與CMPA病理進(jìn)展過(guò)程。一般認(rèn)為25(OH)D活性代謝物1,25(OH)2D通過(guò)與VDR結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[4]。因?yàn)閂DR廣泛表達(dá)于機(jī)體組織和細(xì)胞中[12]，為了進(jìn)一步探討CMPA中維生素D活性代謝物生物學(xué)功能異常是否與VDR水平變化具有一定的聯(lián)系，本研究初步考察患兒外周血VDR水平變化。筆者發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)組患兒VDR基因表達(dá)水平與對(duì)照組相比無(wú)明顯差異，且輕中度組患兒VDR基因表達(dá)水平與重度組患兒相比也無(wú)明顯差異，提示25(OH)D可能是通過(guò)自身水平變化來(lái)參與和影響CMPA進(jìn)程。

維生素D沒(méi)有活性，在體內(nèi)經(jīng)2次羥基化生物代謝轉(zhuǎn)化為活性代謝物發(fā)揮生物活性。維生素D運(yùn)輸?shù)礁闻K中經(jīng)25-羥化酶CYP27A1作用, 可生成25(OH)D。隨后，在CYP27B1 1-α 羥化酶催化下，25(OH)D轉(zhuǎn)化為活性1,25(OH)2D。CYP24A1可催化1,25(OH)2D和25(OH)D生成無(wú)活性24位羥維生素D排除體外[6]。樹(shù)突狀細(xì)胞和淋巴細(xì)胞在內(nèi)的多種免疫細(xì)胞均大量表達(dá)CYP27B1和CYP24A1[13-14]。25(OH)D是維生素D代謝物在體內(nèi)最主要的存在形式，為進(jìn)一步探討CMPA中25(OH)D水平低下是否與維生素D代謝酶有關(guān)，并且初步考察25(OH)D相關(guān)代謝酶水平是否與CMPA疾病進(jìn)程存在聯(lián)系，本研究考察了維生素D體內(nèi)活化和失活主要代謝酶CYP27B1、CYP24A1在PBMC中表達(dá)變化情況，研究結(jié)果表明試驗(yàn)組患兒外周血CYP24A1水平高于對(duì)照組，輕中度組患兒CYP24A1水平低于重度組患兒。然而本研究未發(fā)現(xiàn)CYP27B1在上述各組之間有差異，提示CMPA狀態(tài)下異常高水平CYP24A1加速了25(OH)D代謝失活，抑制了維生素D活性代謝物對(duì)機(jī)體過(guò)敏反應(yīng)的保護(hù)作用。早先研究[15]發(fā)現(xiàn)，免疫細(xì)胞CYP24A1受到炎癥和免疫反應(yīng)調(diào)控，在炎癥因素刺激下，CYP24A1轉(zhuǎn)錄水平可顯著增加，這與本研究結(jié)果相一致，即CMPA中免疫失調(diào)導(dǎo)致CYP24A1水平增高，加速25(OH)D生物代謝，從而抑制25(OH)D的抗炎和抗過(guò)敏作用的發(fā)揮。

綜上所述，CMPA患兒外周血25(OH)D水平降低與CYP24A1水平升高有關(guān)。25(OH)D和CYP24A1水平與過(guò)敏癥狀嚴(yán)重程度存在一定的聯(lián)系，提示CYP24A1可能是CMPA潛在的治療靶點(diǎn)。