微藻-真菌共生體凈化沼液效果研究

詹新同

(欽覃(上海)環(huán)境工程有限公司，上海 200030)

沼液是沼氣制備過程中常見的副產(chǎn)物之一，是一種具有高污染物負荷的污水，如不經(jīng)處理而直接排放會對周邊環(huán)境產(chǎn)生嚴重的危害[1-2]，因此沼液污染是限制沼氣事業(yè)可持續(xù)發(fā)展的一個重要因素。近年來，微藻應(yīng)用于污水處理的研究得到了越來越多的關(guān)注。Golueke等[3]在1957年就首次提出了將沼液應(yīng)用于培養(yǎng)微藻的相關(guān)研究。Collet等[4]認為沼液包含了微藻生長所須的營養(yǎng)元素，且碳氮比(C/N)和碳磷比(C/P)都較低，非常適合微藻的大規(guī)模增殖。隨后相關(guān)學(xué)者開展了利用微藻處理沼液的研究工作，如劉振強等開展了利用微綠球藻、小球藻和纖維藻在四種不同反應(yīng)器(槽式反應(yīng)器、直管式反應(yīng)器、鼓泡式反應(yīng)器和氣升式反應(yīng)器)中凈化沼液的研究工作[5]；劉偉等[6]開展了利用豬場沼液養(yǎng)殖微藻連續(xù)系統(tǒng)的設(shè)計和應(yīng)用研究。以上研究均表明微藻對沼液的生物凈化具有較好的處理效果。如研究發(fā)現(xiàn)沼液中氮、磷營養(yǎng)物去除率的高低與微藻的生長狀況呈正相關(guān)[7]。但深入研究發(fā)現(xiàn)利用單一微藻處理沼液仍存在一定的應(yīng)用局限性，具體表現(xiàn)為微藻個體微小，后期的藻體回收、分離困難，因藻體的分離回收而造成廢水處理成本較高[8-9]。

本研究利用前期篩選出的具有高耐污性的優(yōu)勢微藻(小球藻和斜生柵藻)及真菌菌種(靈芝菌)，研究確定了微藻和靈芝菌形成共生體的最佳形成條件；并對光生物反應(yīng)器中優(yōu)勢藻菌共生體凈化沼液的影響因素進行了探究，確定了最佳光照條件和光周期變化，實現(xiàn)了沼液污染物去除效果的最優(yōu)化。研究結(jié)論能為藻菌共生體在沼液生物凈化中的技術(shù)應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 實 驗

1.1 儀器和試劑

實驗涉及的儀器包括：XZ-21KT型高速冷凍離心機，長沙湘智離心機儀器有限公司；KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州國華電器有限公司；Unique-R20型多功能超純水機，廈門銳思捷水純化技術(shù)有限公司；FE28型pH計，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；YXQ-LS-75SⅡ型立式壓力蒸汽滅菌器，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；UV-1800PC型紫外分光光度計，翱藝儀器(上海)有限公司；HCA-102型標準COD消解器，泰州市國瑞分析儀器廠；HZ-9310KBG型臥式光照搖床，太倉市華利達實驗設(shè)備有限公司；GZP-250S型光照培養(yǎng)箱，上海精宏程控光照培養(yǎng)箱；SW-CJ-2D型超凈工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司；QL-866型旋渦混合器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；MS204TS型電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；GZX-9246MBE型電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；ZDDN-Ⅱ型自動型凱式定氮儀，浙江托普云農(nóng)科技股份有限公司；Primo Star型正置顯微鏡，卡爾蔡司股份公司。

實驗所用材料和試劑包括：二甲基亞砜、葡萄糖、尿素、二水合磷酸二氫鈉、三水合磷酸氫二鉀、二水合氯化鈣、七水合硫酸鎂、重鉻酸鉀、鄰菲啰啉、硫酸亞鐵銨、濃硫酸、硫酸銀、氫氧化鈉、過硫酸鉀、硝酸鉀、抗壞血酸、鉬酸銨、酒石酸銻鉀(半水)、硝酸鈉、丙酮、戊二醛、濃鹽酸、冰乙酸、無水乙醇、乙二胺四乙酸二鈉、苯酚、磷酸緩沖液、BG11培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基。以上試劑均為分析純，均購于上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 藻種培養(yǎng)

小球藻(Chlorellavulgaris)和斜生柵藻(Scenedesmusobliquus)均購于中國科學(xué)院武漢水生生物研究所。選取標準BG11培養(yǎng)基，在光照培養(yǎng)箱中對藻種進行培養(yǎng)及擴培，培養(yǎng)及擴培條件：溫度為(25±0.5)℃，pH為6.95±0.18，光強度為200 μmol/m2·s，光周期為12 h晝/12 h夜[12]。實驗所用靈芝菌真菌菌種購于中國普通微生物菌種保藏管理中心。菌株經(jīng)PDA斜面培養(yǎng)基活化后，接入液體PDA培養(yǎng)基中，在28 ℃條件下?lián)u床(160 rpm)培養(yǎng)3天，備用。

藻菌共生體的培養(yǎng)及擴培同樣在光照培養(yǎng)箱中進行，溫度為(25±0.5)℃，光照強度為200 μmol/(m2·s)，選擇在馴化BG11培養(yǎng)基(BG11培養(yǎng)基+2%麥芽糖+0.5%酵母膏)中進行。取預(yù)先擴培后的小球藻培養(yǎng)液20 mL經(jīng)離心后去除上清液，離心沉淀利用馴化培養(yǎng)基洗滌2次，然后接種于100 mL馴化BG11液體培養(yǎng)基中(計數(shù))，同時接種不同的真菌菌液(計數(shù))。保持12 h晝/12 h夜的光周期，到對數(shù)生長期再擴大培養(yǎng)，然后保存于儲備液中備用。

1.3 沼液來源、預(yù)處理與理化特性

原沼液是來自江蘇“宏茂農(nóng)場”其發(fā)酵裝置是利用豬糞和農(nóng)業(yè)秸稈混合厭氧發(fā)酵產(chǎn)沼氣。厭氧發(fā)酵裝置所產(chǎn)沼液全部儲存于池中，取沼液時利用塑料桶和麻繩將沼液從沼液池中分多次取出，然后裝到塑料化工壺內(nèi)帶回實驗室備用。

原沼液先過濾，以去除其中的沉積物及懸浮顆粒物，濾出沼液收集后再經(jīng)過紫外線殺菌器處理5 min。經(jīng)實驗室分析測定，備用沼液水質(zhì)指標如下：pH 6.83±0.22，COD(1212.24±37.65)mg/L，TN(96.38±6.31)mg/L，TP(21.05±1.98)mg/L。

1.4 實驗設(shè)計

1.4.1 藻菌共生體的形成研究

在藻菌共生體的構(gòu)建實驗過程中，藻細胞(小球藻或斜生柵藻)接種量為2.0×107cell/mL，培養(yǎng)量50 mL，160 rmp，培養(yǎng)溫度(25±0.5)℃，光照強度為200 μmol/m2·s，光周期設(shè)置12h晝/12h夜，藻-靈芝菌的比例(細胞數(shù)比例)設(shè)置為1:1、1:10、1:20、1:30，共培養(yǎng)7 d后借助顯微鏡考察不同藻菌配比條件下構(gòu)建的藻菌共生體的大小與數(shù)量。隨后，在最優(yōu)藻菌比例的條件下，分別在轉(zhuǎn)速100 rpm、160 rpm、220 rpm的條件下共培養(yǎng)7 d，考察共培轉(zhuǎn)速對構(gòu)建藻菌共生體的影響。

1.4.2 藻菌共生體凈化沼液效果研究

實驗在自主設(shè)計的罐式光生物反應(yīng)器(圖1)中進行，光照培養(yǎng)條件：溫度(25±0.5)℃，速度160 rpm，光強度為200 μmol/(m2·s)。藻菌共生體(接種量為20%)由接種口引入光生物反應(yīng)器，沼液經(jīng)預(yù)處理后由沼液處理器泵入光生物反應(yīng)器。

圖1 實驗光生物反應(yīng)器裝置

(1)不同混合光質(zhì)對藻菌共生體處理沼液的影響

改變光生物反應(yīng)器LED光源設(shè)置，選擇單色紅光、單色藍光、紅光：藍光(3:7、5:5和7:3)五種光質(zhì)，時間設(shè)置 12 h晝/12 h夜，實驗處理7 d后測定處理后沼液中化學(xué)需氧量(COD)、總氮(TN)和總磷(TP)的濃度并計算去除率，每個實驗重復(fù)三次。

(2)不同光周期對藻菌共生體處理沼液的影響

按照(1)優(yōu)選的LED混合光質(zhì)和藻菌共生體，光周期選擇12 h晝/12 h夜、14 h晝/10 h夜、16 h晝/8 h夜，實驗處理 7 d后測定處理后沼液中COD、TN、TP的濃度并計算去除率，每個實驗重復(fù)三次。

1.5 實驗分析方法及數(shù)據(jù)處理

在實驗處理的不同階段，從反應(yīng)體系中取15 mL混合液樣品，做離心處理(6000 rpm，10 min)。隨后用一次性PES濾膜過濾上清液，濾液放入棕色玻璃容器中保存?zhèn)溆谩Ｒ罁?jù)標準方法測定COD、TN、TP[13]。

沼液處理前后COD、TN和TP的去除率利用公式(1)進行計算：

(1)

式中：R是沼液中污染物(COD、TN和TP)的去除率，%；CI為沼液處理前污染物濃度，mg/L；CF為實驗處理不同階段沼液中污染物的濃度，mg/L。

實驗最終數(shù)據(jù)均為三個平行實驗結(jié)果數(shù)據(jù)的平均值，運用Microsoft Excel 2011進行數(shù)據(jù)分析與處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 微藻-真菌共生體系的建立

2.1.1 藻菌比例變化對藻菌共生體形成的影響

藻菌共生體是藻和菌共同生長及結(jié)合在一起的共生體，在共生環(huán)境下菌和藻會存在相互制約，相互影響[14]。藻-菌體系共生培養(yǎng)7 d后，不同培養(yǎng)條件下構(gòu)建的藻菌共生體的大小與數(shù)量結(jié)果見表1。

表1 不同比例下形成藻菌共生體的情況

從表1描述結(jié)果可以看出，當(dāng)藻菌比例為1:1時，共生體系中真菌生長迅速，抑制了藻種的生長(體系顯現(xiàn)黃色)，且不能形成藻菌球。隨著菌種密度的提高，當(dāng)藻菌比列為1:10時可形成相對大的菌絲球，但微藻的生長仍較弱(體系顯現(xiàn)黃色)；隨著菌種密度的進一步提高，藻、菌在共生體系中形成了同步生長現(xiàn)象(體系顯現(xiàn)深綠色)，當(dāng)藻菌比列為1:20時形成了大小均勻藻菌球；當(dāng)藻菌比列為1:30，會造成共生體系中微藻密度過大從而抑制真菌生長，共生體系中無法形成藻菌球。綜合考慮，1:20是藻菌共生體形成的較優(yōu)比例，且成球效果最佳。

2.1.2 共培轉(zhuǎn)速變化對藻菌共生體形成的影響

按照上述優(yōu)選條件(藻菌比列為1:20)，選擇了小球藻或斜生柵藻與靈芝菌分別在轉(zhuǎn)速100 rpm、160 rpm、220 rpm條件下進行藻菌共生體的培養(yǎng)，實驗結(jié)果如表2所示。

從表2描述結(jié)果可以看出，當(dāng)共生體培養(yǎng)轉(zhuǎn)速為100 rpm時，共生體系能形成藻菌球，但大小不均勻(3～10 mm)；當(dāng)共生體培養(yǎng)轉(zhuǎn)速為160 rpm時，藻、菌共生體系生長良好(體系顯現(xiàn)深綠色)，且形成的藻菌共生球更加均勻(3～4 mm)；當(dāng)共生體培養(yǎng)轉(zhuǎn)速為220 rpm時，培養(yǎng)體系中真菌的生長受到抑制，共生體系中無法形成藻菌球。由此可見，共培時最優(yōu)轉(zhuǎn)速應(yīng)控制在160 rpm，此時小球藻或斜生柵藻與靈芝菌均能很好的形成藻菌共生體，且藻菌球的大小均勻，顏色深綠。

表2 不同轉(zhuǎn)速下形成藻菌共生體的情況

2.2 藻菌共生體凈化沼液結(jié)果分析

2.2.1 光質(zhì)變化對藻菌共生體處理沼液的影響

改變光生物反應(yīng)器LED光源設(shè)置，選擇單色紅光、單色藍光、紅光：藍光(3:7、5:5和7:3)五種光質(zhì)，時間設(shè)置 12 h晝/12 h夜。在光生物反應(yīng)器中通過接種藻菌共生體處理沼液，實驗處理7 d后測定處理前、后沼液中COD、TN和TP的濃度并計算去除率(每個實驗重復(fù)三次)，實驗結(jié)果見表3。

表3 不同混合光質(zhì)對藻菌共生體處理沼液的影響

微藻的繁殖能力在很大程度上取決于光的波長特性，Kim等[15]的研究認為選擇合適的光源混合波長可以促進微藻的生長從而提高沼液中營養(yǎng)物質(zhì)(COD、TN和TP)的消耗去除能力。

從表3數(shù)據(jù)可以看出，在兩種藻-菌共生體系中光質(zhì)變化對沼液的處理效果會產(chǎn)生顯著的影響，其中混合光源的效果要好于單色光源，單色光源中單色紅光的效果又好于單色藍光。這主要是因為葉綠素和藻膽蛋白對混合光波的吸收效果更好[16]。采用柵藻-靈芝菌共生體處理沼液的體系中，沼液中COD、TN和TP的去除率均表現(xiàn)為紅(5):藍(5)>紅(3):藍(7)>紅(7):藍(3)>單色紅光>單色藍光；采用紅(5):藍(5)光源時，沼液中COD、TN和TP的去除率最高，分別為66.54%±5.69%、72.37%±6.11%、77.61%±6.21%。采用小球藻-靈芝菌共生體處理沼液的體系中，光質(zhì)變化對沼液的處理效果(COD、TN)表現(xiàn)為紅(5):藍(5)>紅(7):藍(3)>紅(3):藍(7)>單色紅光>單色藍光；TP的去除率則表現(xiàn)為紅(5):藍(5)>紅(3):藍(7)>紅(7):藍(3)>單色紅光>單色藍光；采用紅(5):藍(5)光源時，沼液中COD、TN和TP的去除率最高，分別為71.36%±6.44%、76.24%±6.64%、79.25%±6.12%。相關(guān)研究認為微藻光系統(tǒng)I可以被藍光激發(fā)，而與光系統(tǒng)I緊密相連的光系統(tǒng)II則主要被紅光激發(fā)[16]。還有學(xué)者認為紅光與微藻細胞固碳有關(guān)，藍光與光合作用中甘油三酯積累酶的活性有關(guān)[17-18]。所以，當(dāng)紅光與藍光的比例不合適時則會影響共生體系中微藻的光合速率，進而影響微藻的生物量[19]。而本研究結(jié)果表明，在采用不同比例的紅藍混合光源時，紅(5):藍(5)的效果最佳。此外，相比較而言小球藻-靈芝菌共生體處理沼液的效果優(yōu)于柵藻-靈芝菌共生體。

2.2.2 光周期變化對藻菌共生體處理沼液的影響

選擇小球藻-靈芝菌為優(yōu)勢藻菌共生體，在紅光:藍光=5:5時，光周期選擇12 h晝/12 h夜、14 h晝/10 h夜、16 h晝/8 h夜，實驗處理7 d后測定處理前、后沼液中COD、TN、TP的濃度并計算去除率(每個實驗重復(fù)三次)，實驗結(jié)果見表4。

表4 不同光周期對藻菌共生體處理沼液的影響

從表4數(shù)據(jù)可以看出，采用小球藻-靈芝菌共生體處理沼液的體系中，光周期變化對沼液的處理效果會產(chǎn)生顯著影響，沼液中COD、TN和TP的去除率均表現(xiàn)為16 h晝/8 h夜>14 h晝/10 h夜>12 h晝/12 h夜>；其中當(dāng)光周期為16 h晝/8 h夜時，沼液中COD、TN和TP的去除率最高，分別為73.68%±5.32%、77.05%±6.25%、79.36%±5.08%。這可能主要是因為充足的光照時間能促進共生體系的繁殖，從而促進沼液中污染物質(zhì)的去除。

3 結(jié) 論

藻菌共生體在沼液凈化方面展現(xiàn)出很好的發(fā)展前景。因此，本文圍繞藻菌共生體的構(gòu)建、優(yōu)勢藻菌共生體的篩選，以及藻菌共生體光生物反應(yīng)器系統(tǒng)的調(diào)控與優(yōu)化等方面進行了研究，研究結(jié)論如下：

(1)小球藻或斜生柵藻與靈芝菌的比例變化對藻菌共生體的形成會產(chǎn)生影響，從藻菌共生體的顏色、大小、形態(tài)看，1:20是藻菌共生體形成的最優(yōu)比例；對于共生體培養(yǎng)轉(zhuǎn)速的影響，160 rpm下小球藻或斜生柵藻與靈芝菌均能很好的形成藻菌共生體，且形成的藻菌球大小均勻，顏色深綠。

(2)在紅光和藍光的最佳光照波長比為5:5、光周期為14 h晝/10 h夜時，小球藻-靈芝菌形成的共生體對沼液的凈化效果最佳，COD、TN和TP的去除率分別達到73.68%±5.32%、77.05%±6.25%、79.36%±5.08%。