綠色木霉Tv-1511對黃瓜的促生增產(chǎn)作用及防病效果

霍雪雪,王慶玲,張豪,李哲,鄭澤慧,李榮,黃艷華*,郭凱

(1.齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院)生物研究所,山東 濟南 250014;2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院,江蘇 南京 210095)

生物有機肥作為一種環(huán)保、高效的新型肥料,兼具復(fù)合微生物肥料及有機肥的優(yōu)勢。施用生物有機肥可以改善土壤的理化性質(zhì)[1],并通過其所含特定功能微生物的生命活動促進植物對營養(yǎng)元素的吸收、利用,減輕病蟲害,顯著提高農(nóng)作物產(chǎn)量和品質(zhì)[2-3]。此外,生物有機肥主要以動植物殘體(如畜禽糞便、農(nóng)作物秸稈等)為原料,不僅實現(xiàn)了農(nóng)業(yè)廢棄物的資源化利用,還可以有效解決環(huán)境污染問題,是對人、畜、環(huán)境安全無毒的環(huán)保型肥料[4]。生物有機肥發(fā)揮作用的核心是具有特定功能的微生物,因此微生物菌種的篩選是生物有機肥料應(yīng)用中的關(guān)鍵。

木霉是一種重要的多功能絲狀真菌,其產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物種類豐富,生物活性多樣,在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域及環(huán)境保護領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用[5]。常見木霉有綠色木霉(Trichodermaviride)、哈茨木霉(T.harzianum)、康氏木霉(T.koningii)、長枝木霉(T.longibrachiatum)等。其中綠色木霉是兼具促生和生防功能的有益真菌,是土壤環(huán)境中有毒物質(zhì)的降解菌株,也是生物有機肥中重要的微生物菌種之一。研究發(fā)現(xiàn),綠色木霉可以顯著促進植物種子萌發(fā)、幼苗生長和產(chǎn)量增加[6-7]。在生物防治方面,綠色木霉主要通過競爭、重寄生和分泌次生代謝產(chǎn)物等方式,來抑制病原菌的生長[8-9]。此外,綠色木霉含有漆酶、水解酶、纖維素酶等,可用于環(huán)境污染物的生物降解[10]。

以木霉為功能微生物制成生物有機肥,具有促生、增產(chǎn)、防病等多重作用[2,11-12]。目前公開應(yīng)用于生物有機肥生產(chǎn)的綠色木霉菌種類有限,進一步篩選出具有防病、促生和增產(chǎn)等多功能的綠色木霉具有重要意義。因此,本研究擬篩選獲得一株具有良好的抑菌及促生效果的綠色木霉,并對其研制的生物有機肥的促生增產(chǎn)效果進行評估,以期為木霉類生物有機肥的推廣應(yīng)用和農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

篩選獲得的木霉菌由齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院)生物研究所保存。培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)固體培養(yǎng)基和馬鈴薯葡萄糖(PD)液體培養(yǎng)基。黃瓜品種‘津研四號’,由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所選育。

示范試驗在金星(日照)農(nóng)業(yè)科技有限公司試驗基地進行。土壤基本性質(zhì):有機質(zhì)含量31.2 g·kg-1,全氮含量 2.6 g·kg-1,全磷含量 1.6 g·kg-1,全鉀含量 14.4 g·kg-1,銨態(tài)氮含量16.8 mg·kg-1,硝態(tài)氮含量43.5 mg·kg-1,速效磷含量 36.9 mg·kg-1,速效鉀含量64.3 mg·kg-1。供試有機肥由金星(日照)農(nóng)業(yè)科技有限公司提供,以玉米秸稈和尾菜為原料,經(jīng)過高溫發(fā)酵生產(chǎn)有機肥,徹底腐熟后,含水量≤30%,有機質(zhì)含量≥450 mg·g-1、全氮40 mg·g-1、全磷(P2O5)40 mg·g-1、全鉀(K2O)20 mg·g-1、硫酸鋅(ZnSO4)0.5 mg·g-1、游離氨基酸10 mg·g-1。供試木霉型生物有機肥由金星(日照)農(nóng)業(yè)科技有限公司提供,按生物有機肥干重的5%添加木霉固體發(fā)酵物制成木霉生物有機肥,每克木霉孢子數(shù)量為2×108。

1.2 試驗方法

1.2.1 木霉的篩選與鑒定采集樣品為煙草田土,地點為山東省濰坊市。去掉表層浮土,直至露出有植物根系的土層,采集土樣;將土樣碾碎制成土壤懸濁液,用無菌生理鹽水進行梯度稀釋;挑選單菌落轉(zhuǎn)接到PDA平板上培養(yǎng)長出菌落,采用單孢分離法進行分離純化,保存?zhèn)溆?。利用顯微鏡觀察該菌株的形態(tài)學(xué)特征;提取DNA,采用通用引物ITS1/ITS2進行PCR擴增、測序;在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行同源性比對,運用Mega 6.0軟件以Neighbor-Joining法建立系統(tǒng)發(fā)育樹,對該菌株親緣關(guān)系進行分析。

木霉孢子液的制備與檢測:將木霉接種到PDA固體培養(yǎng)基上,于28 ℃培養(yǎng)10 d,用無菌水沖洗分生孢子,收集孢子液,用血球計數(shù)板計數(shù)。稱取10 g木霉發(fā)酵產(chǎn)物,加入無菌水和玻璃珠,于28 ℃振蕩培養(yǎng)30 min,用4層滅菌紗布過濾,采用梯度稀釋涂布平板計數(shù)方法進行計數(shù),測定發(fā)酵物的含水量,得到每克干物質(zhì)孢子量。

1.2.2 木霉對病原真菌的拮抗試驗選用6種植物病原真菌,包括尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)、層生鐮刀菌(F.proliferatum)、白絹病菌(Sclerotiumrolfsii)、串珠鐮孢菌(F.moniliforme)、葡萄座腔菌(Botryosphaeriadothidea)和灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)。用打孔器在菌落邊緣取直徑為5 mm的菌塊,在直徑線上距兩側(cè)皿緣1.5 cm的對稱位置分別接種植物病原真菌和綠色木霉Tv-1511,同時,以只接病原菌的平板作為對照。置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),拍照記錄真菌對峙情況。在對峙培養(yǎng)的PDA平板上,挑取Tv-1511與病原菌混合生長處的菌絲制成玻片,在光學(xué)顯微鏡下觀察。計算抑菌率:

抑菌率=(對照病原菌菌落半徑-處理病原菌菌落半徑)/對照病原菌菌落半徑×100%。

1.2.3 黃瓜種子發(fā)芽試驗挑選健康飽滿的黃瓜種子先用75%(體積分數(shù))乙醇消毒30 s,再用2%NaClO表面消毒3 min,無菌水沖洗4～5次,于超凈工作臺中風(fēng)干至種子表面無水。選用直徑為13 cm的培養(yǎng)皿,3層滅菌濾紙,每皿20粒種子,10 mL發(fā)芽溶液。以無菌水為發(fā)芽溶液的為對照組(CK),以加入木霉孢子液(濃度為103、104、105、106CFU·mL-1)為處理組(T),每個處理設(shè)置4個重復(fù)。統(tǒng)計種子的發(fā)芽率和側(cè)根數(shù),并測定胚根長、胚芽長等指標。

1.2.4 黃瓜促生試驗挑選飽滿一致的種子進行消毒處理,于25 ℃培養(yǎng)箱中遮光催芽至露白,然后于光照/黑暗(16 h/8 h)條件下培育一定時間后,挑選長勢一致的幼苗移至水培裝置進行處理。以1/2 Hoagland營養(yǎng)液為水培溶液的為對照組(CK),以加入木霉孢子液(濃度為104、105和106CFU·mL-1)為處理組(T),每個處理設(shè)置4個重復(fù),分別在處理0、7和14 d時進行根長、株高、葉寬、葉長、鮮重、干重等指標的測定。

1.2.5 生物有機肥大田試驗試驗在金星(日照)農(nóng)業(yè)科技有限公司試驗基地進行。以不施肥(CK)和常規(guī)施肥(CF)為對照,以綠色木霉Tv-1511生物有機肥替代30%化肥為處理組(T)。試驗隨機區(qū)組設(shè)計,4個重復(fù),小區(qū)面積100 m2,高畦栽培,株距25 cm。所有處理按當?shù)氐氖┓史绞剿桊B(yǎng)分統(tǒng)一施肥,常規(guī)管理。

1.3 測定項目與方法

1.3.1 種子萌發(fā)指標每隔1 d觀察1次種子發(fā)芽情況,并記錄種子發(fā)芽數(shù),以胚根長度達到其種粒長度的一半時作為種子發(fā)芽的標志,根據(jù)《農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程:GB/T 3543.4—1995》發(fā)芽試驗的要求測定黃瓜種子發(fā)芽率。萌發(fā)第7 天,用直尺測定黃瓜的胚根長和胚芽長,并統(tǒng)計側(cè)根數(shù)目。

1.3.2 黃瓜生長指標黃瓜促生試驗中,分別在處理的0、7和14 d測量黃瓜幼苗的根長、株高、葉寬、葉長;多功能生物有機肥田間示范試驗中,分別于幼苗期、初花期和結(jié)果期測量黃瓜株高、葉寬和葉長。其中株高是葉下端至生長點的高度,葉長是第1片真葉的長度,葉寬是第1片真葉的寬度。

1.3.3 黃瓜生物量黃瓜促生試驗結(jié)束后,取單株先用自來水沖洗2次,再用蒸餾水沖洗1次,用吸水紙吸干后,將地上部分和地下部分分離,分別稱其鮮重;將地上部分和地下部分分別放入培養(yǎng)皿中,105 ℃殺青15 min,65 ℃烘干至恒重,分別稱其干重。

1.3.4 黃瓜產(chǎn)量多功能生物有機肥示范試驗中,按商品瓜生產(chǎn)標準進行采收,第4次采收時,每小區(qū)隨機采摘10個黃瓜,測定果實直徑、果實長度和單果重。待采收結(jié)束后統(tǒng)計產(chǎn)量。

1.4 數(shù)據(jù)分析與處理

所有試驗數(shù)據(jù)使用 Excel 2010軟件進行統(tǒng)計,采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析及顯著性分析。結(jié)果用平均值±標準差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定

篩選獲得的菌株在PDA培養(yǎng)基上生長迅速,菌落初期呈白色絨狀,致密,圓形;后期菌落開始產(chǎn)分生孢子,出現(xiàn)同心輪紋狀的產(chǎn)孢區(qū),顏色為綠色至深綠色(圖1-A);菌絲透明,直立生出分生孢子梗,對稱或互生分枝,形成二級和三級分枝,整體像樹枝,分生孢子無色,多為球形(圖1-B);構(gòu)建系統(tǒng)進化樹發(fā)現(xiàn),該菌株與綠色木霉(Trichodermaviride)同屬一個遺傳分枝,親緣關(guān)系最近(圖1-C)。因此,篩選獲得的菌株為綠色木霉菌,命名為Tv-1511,將其保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物管理中心,保藏編號為CGMCC No.16800。

圖1 菌株的形態(tài)特征和系統(tǒng)進化分析Fig.1 Strain morphological characteristics and phylogenetic tree analysis A. 菌株的形態(tài)學(xué)特征 Strain morphological characteristics;B.菌絲與分生孢子顯微形態(tài) Microscopic morphology of hyphae and conidia;C.菌株的系統(tǒng)進化樹分析 Phylogenetic tree analysis of strain.

2.2 綠色木霉Tv-1511在拮抗病原真菌中的應(yīng)用

綠色木霉Tv-1511對6種植物病原菌具有明顯的拮抗作用。接種2 d時,Tv-1511對各病原菌均表現(xiàn)出一定的抑菌效果,之后隨著接種時間的延長抑菌效果逐漸增強直至相對穩(wěn)定。接種8 d時,Tv-1511覆蓋或侵入病原菌菌落,并形成大量的綠色分生孢子堆,對峙作用基本停止。在與尖孢鐮刀菌、層生鐮孢菌、串珠鐮孢菌和灰葡萄孢菌的對峙平板上,Tv-1511菌落已占據(jù)3/4的平皿,侵入、覆蓋或包圍了病原菌菌落,抑菌率分別為68.50%、66.65%、68.96%和59.81%;在與白絹病菌和葡萄座腔菌的對峙平板上,Tv-1511占據(jù)大半個平皿,對病原菌形成明顯的抑菌帶或拮抗圈,病原菌落周圍萎縮或出現(xiàn)菌絲消解痕跡,抑菌率分別為71.73%和59.87%(圖2,表1)。在光學(xué)顯微鏡下觀察到綠色木霉Tv-1511的菌絲可附著或纏繞于尖孢鐮刀菌、串珠鐮孢菌和灰葡萄孢菌的菌絲上,致使病原菌菌絲發(fā)生變形、斷裂和消解等現(xiàn)象,生長受到明顯抑制。以上結(jié)果表明,綠色木霉Tv-1511可通過占領(lǐng)生態(tài)位、菌絲纏繞等重寄生作用和產(chǎn)生抑菌圈等方式來有效抑制病原菌的生長。

表1 Tv-1511對6種病原真菌的抑菌率Table 1 Inhibitory rate of Tv-1511 against six pathogenic fungi

2.3 綠色木霉Tv-1511對黃瓜種子萌發(fā)的影響

從圖3可知:與對照相比,各濃度Tv-1511孢子液處理均能有效促進黃瓜種子的胚根長、胚芽長、側(cè)根數(shù)和發(fā)芽率,且隨著孢子液濃度的增加,促進作用呈先升高后下降的趨勢,均在濃度為105CFU·mL-1達到峰值。與對照組相比,105CFU·mL-1處理組黃瓜的胚根長、胚芽長、側(cè)根數(shù)和發(fā)芽率分別增加了35.70%、35.35%、57.5%和10.6%,且差異顯著(P<0.05)。以上結(jié)果表明,綠色木霉Tv-1511可以促進黃瓜種子的萌發(fā),且以孢子液濃度為105CFU·mL-1促進效果最顯著。

圖3 不同濃度Tv-1511孢子液對黃瓜種子發(fā)芽的影響Fig.3 Effects of different concentrations of Tv-1511 spore on cucumber seed germination 柱上不同字母代表不同處理間差異顯著(P<0.05)。下同。Different letters on the column represent significant differences between different treatments(P<0.05). The same as follows.

2.4 綠色木霉Tv-1511對黃瓜幼苗生長的影響

從圖4可知:與對照相比,不同濃度Tv-1511孢子液處理的黃瓜均呈現(xiàn)一定的生長優(yōu)勢,且以 105CFU·mL-1處理的生長優(yōu)勢最為明顯。處理7 和14 d后根長、株高、葉寬、葉長差異顯著(P<0.05),且變化趨勢與種子萌發(fā)相關(guān)指標一致,均在105CFU·mL-1時達到峰值,其中處理7 d時的黃瓜根長、株高、葉長和葉寬分別是對照的1.28、1.34、1.16和1.16倍,處理14 d時相應(yīng)的生長指標是對照的1.46、1.49、1.20和1.22倍(圖5)。因此,綠色木霉Tv-1511可以促進黃瓜幼苗的生長,且以綠色木霉孢子濃度為 105CFU·mL-1時,對黃瓜幼苗生長的促生效果最顯著。

圖4 黃瓜在不同濃度Tv-1511孢子液處理下的表型分析Fig.4 Phenotypic analysis of cucumber under different concentrations of Tv-1511 spore liquid treatments

圖5 不同濃度Tv-1511孢子液對黃瓜幼苗生長的影響Fig.5 Effects of different concentrations of Tv-1511 spore liquid on cucumber seedling growthCK、104、105和106分別代表Tv-1511孢子液濃度為0、104、105和106CFU·mL-1。下同。CK,104,105 and 106 represent treatment with 0,104,105 and 106CFU·mL-1 Tv-1511 spore liquid,respectively. The same as follows.

分析不同濃度Tv-1511孢子液對黃瓜生物量的影響,結(jié)果(表2)表明,不同濃度Tv-1511孢子液處理的黃瓜地上部和地下部的鮮重和干重均顯著高于對照(P<0.05),且變化趨勢與幼苗生長指標一致,隨 Tv-1511 孢子液濃度的增加呈先增加后降低的趨勢,在濃度為105CFU·mL-1達到峰值。當Tv-1511為 105CFU·mL-1時,處理組的地上部鮮重、地下部鮮重、地上部干重、地下部干重分別為對照組的1.41、1.29、1.39和2.05倍。以上結(jié)果表明,綠色木霉Tv-1511可以促進黃瓜生物量的增加,且以孢子濃度為105CFU·mL-1時促進效果最顯著。

表2 不同濃度Tv-1511孢子液對黃瓜生物量的影響Table 2 Effects of different concentrations of Tv-1511 spore liquid on cucumber biomass g

2.5 綠色木霉Tv-1511制備的生物有機肥對黃瓜生長和產(chǎn)量的影響

2.5.1 對黃瓜生長的影響對不同生長時期(幼苗期、初花期、結(jié)果期)的株高、葉長和葉寬進行測定(圖6)。與CK(不施肥)和CF(常規(guī)施肥)相比,T處理顯著促進黃瓜的生長(P<0.05)。其中,T處理黃瓜幼苗期、初花期、結(jié)果期的株高分別是CK的1.37、1.43和1.42倍,是CF的1.06、1.17和1.22倍。葉長和葉寬的變化趨勢與株高一致。與CK相比,結(jié)果期T處理黃瓜的葉長和葉寬分別增加了31.17%和47.31%;與CF相比,結(jié)果期T處理黃瓜的葉長和葉寬分別增加了18.04%和13.87%。因此,木霉Tv-1511生物有機肥替代30%化肥的施肥處理可以顯著促進黃瓜的生長。

圖6 不同施肥處理對黃瓜株高、葉長和葉寬的影響Fig.6 Effects of different fertilization treatments on plant height,leaf length and leaf width of cucumber CK. 不施肥 No fertilizer;CF. 常規(guī)施肥 Conventional fertilization;T. 綠色木霉 Tv-1511 生物有機肥替代30%化肥 Bio-organic fertilizer prepared from Trichoderma viride Tv-1511 instead of 30% of chemical fertilizer. 下同。The same as follows.

2.5.2 對黃瓜產(chǎn)量的影響從圖7可知:T處理可以顯著提高黃瓜的產(chǎn)量(P<0.05),其果實直徑、果實長度、單果重和產(chǎn)量分別是CK的1.19、1.35、1.28和1.59倍,是CF的1.08、1.09、1.28和1.20倍。以上結(jié)果表明,由綠色木霉Tv-1511制成的多功能生物有機肥可以顯著提高黃瓜的產(chǎn)量。

圖7 不同施肥處理對黃瓜果實直徑、果實長度和單果重及產(chǎn)量的影響Fig.7 Effects of different fertilization treatments on fruit diameter,fruit length, single fruit weight and yield of cucumber

3 討論與結(jié)論

綠色木霉是一種廣泛分布于自然界的生防真菌,對植物病原菌具有廣譜的拮抗作用,其生防機制主要包括競爭作用[13]、重寄生作用[14]、抗生作用[9]和誘導(dǎo)抗性作用[15]等。在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)綠色木霉Tv-1511菌株對環(huán)境具有較強的適應(yīng)性,在與病原菌的對峙培養(yǎng)中,能夠通過自身的快速生長和繁殖來競爭營養(yǎng)和空間,使病原菌菌落逐漸萎縮,說明Tv-1511可通過競爭作用來抑制病原菌的生長。在光學(xué)顯微鏡中觀察到Tv-1511以纏繞、附著和侵入等方式寄生于病原菌菌絲上,使病原菌發(fā)生菌絲縊縮和斷裂,說明它的拮抗機制包括重寄生作用。另外,在Tv-1511與白絹病菌和葡萄座腔菌的對峙培養(yǎng)中出現(xiàn)明顯的抑菌帶或拮抗圈,說明在與病原菌的對峙過程中產(chǎn)生了某種抗生性物質(zhì),有待進一步研究。

近年來研究發(fā)現(xiàn),綠色木霉還是一種植物促生劑,可以顯著提高種子萌發(fā)率,促進幼苗生長,增加作物產(chǎn)量[6-7]。其促生機制主要包括,分泌植物生長調(diào)節(jié)劑、抑制或降解根際有害物質(zhì)、增加養(yǎng)分利用率、誘導(dǎo)植物抗性等[16]。但木霉對植物的促生作用具有一定的濃度依賴性,在一定濃度范圍內(nèi),促生作用隨著木霉?jié)舛鹊脑黾佣鰪?當超過一定濃度后,促生效果會減弱,濃度過高時還有一定的抑制作用[6,17]。在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)不同含量的綠色木霉Tv-1511孢子液對黃瓜的種子萌發(fā)、幼苗生長和生物量均有一定的促進作用,且促進效果隨Tv-1511孢子液濃度的增加呈先增加后下降的趨勢,在濃度為105CFU·mL-1時促進作用最顯著。這主要與木霉產(chǎn)生的膠霉毒素、綠膠霉素、類植物生長素6-戊基-2H-吡喃-2-酮(6-PP)等次生代謝產(chǎn)物有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn),膠霉毒素和綠膠霉素在高濃度下會抑制植物的種子萌發(fā)和幼苗生長,且不同植物品種對2種活性成分的忍受度不同[18]。木霉產(chǎn)生的類植物生長素6-PP在高濃度時抑制小麥的生長,但在低濃度時促進生長[19]。因此,木霉用作生防劑或促生劑時需要對菌株的種類和使用劑量進行限制。

木霉對植物的促生作用與植物生長基質(zhì)有密切的關(guān)系。在缺少基質(zhì)的情況下,木霉會受到土壤理化性質(zhì)和有機質(zhì)含量的影響,很難成功定殖并大量繁殖,嚴重影響其防病促生效果。因此,選擇合適的基質(zhì)尤為重要。杜嬋娟等[20]研究發(fā)現(xiàn),單獨施用木霉菌肥對香蕉的促生作用和香蕉枯萎病的防治效果均不理想,而施用加入木霉孢子液的有機肥后對香蕉的促生防病作用顯著提高。有機肥中的有機質(zhì)既是肥力的基礎(chǔ),又是木霉的培養(yǎng)基質(zhì),木霉能夠以有機肥為載體,快速生長繁殖,占據(jù)優(yōu)勢生態(tài)位,增加植物根際有益微生物的數(shù)量。研究發(fā)現(xiàn),施用木霉生物有機肥可以顯著促進辣椒[11]、芥菜[12]、黃瓜[21]等植物的生長。木霉生物有機肥除了單獨施用外,還可以與化學(xué)肥料協(xié)同使用,在提高有機肥增產(chǎn)效果的同時,減少化肥的施用量,改善土壤及作物品質(zhì)[22]。在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)綠色木霉Tv-1511生物有機肥替代30%化肥處理可以顯著促進黃瓜在不同生長時期(幼苗期、初花期、結(jié)果期)的生長,并顯著增加果實直徑、長度、單果重和產(chǎn)量。李瑞霞等[23]研究發(fā)現(xiàn),減施25%的化肥同時配施貴州木霉NJAU4742制成的生物有機肥可以有效調(diào)控土壤養(yǎng)分和微生物區(qū)系,提高番茄的產(chǎn)量和品質(zhì)。王歡[24]研究發(fā)現(xiàn),減施30%的化肥同時配施木霉生物有機肥可以緩解土壤鹽脅迫,增加土壤有機質(zhì)和有效磷含量,促進黃瓜的生長和產(chǎn)量增加。因此,綠色木霉Tv-1511生物有機肥可以顯著促進植物的生長和產(chǎn)量的增加,具有重要的推廣應(yīng)用價值。