高溫脅迫誘導水稻白葉枯病菌在病葉中進入存活但不可培養(yǎng)狀態(tài)的研究

張含,王冰倩,杜逸晨,宋康麗,李佳楊,聶婧源,宋從鳳

(南京農業(yè)大學植物保護學院/農作物生物災害綜合治理教育部重點實驗室,江蘇 南京 210095)

在自然環(huán)境中,當植物病原細菌受到一定的壓力脅迫時,其代謝發(fā)生改變,從而影響其在培養(yǎng)條件下的活力狀態(tài)。VBNC(viable but non-culturable),即存活但不可培養(yǎng)狀態(tài),是微生物應對不良環(huán)境條件進化出的一種生存策略[1-2]。細菌進入VBNC狀態(tài)后,細胞不再分裂,但仍然具有代謝活性。具有生物危害性的細菌在進入VBNC狀態(tài)后,由于不能通過常規(guī)的分離培養(yǎng)方法檢出,對于公共衛(wèi)生或者農業(yè)生產會存在一定的潛在風險。VBNC狀態(tài)最先于1982年在霍亂弧菌(Vibriocholera)以及大腸桿菌(Escherichiacoli)中首次發(fā)現(xiàn)[3],目前已經有80多種細菌被報道可以進入VBNC狀態(tài)[1,4-5],但研究對象大多集中在與食品、環(huán)境以及醫(yī)學領域相關的微生物上。植物病原細菌中已經報道可以進入VBNC狀態(tài)的有Xanthomonascampestrispv.campestris、Agrobacteriumtumefaciens、Burkholderiacepacia、Pseudomonassyringaepv.syringae、Erwiniaamylovora、X.axonopodispv.citri、X.campestrispv.vesicatoria和Ralstoniasolanacearum[6-14]。誘導細菌進入VBNC狀態(tài)的因子有化學和環(huán)境因素,包括溫度、pH值、滲透壓、鹽度、營養(yǎng)等[15-16]。對于植物病原細菌VBNC現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)以及誘導因子的探究將有助于全面了解其生態(tài)學和生物學特點,對于病害的防治有重要的指導作用。

水稻白葉枯病是水稻上一種重要的細菌性病害,全生育期都可以發(fā)生,主要危害維管束,可引起葉枯型、急性型、凋萎型、黃葉型以及中脈型等不同類型的癥狀。病害一旦發(fā)生,水稻產量輕則下降10%～30%,嚴重時可達50% 以上,甚至顆粒無收[17]。水稻白葉枯病是由稻黃單胞菌稻致病變種Xanthomonasoryzaepv.oryzae(Xoo)引起。對于Xoo是否進入VBNC狀態(tài)目前尚未見有報道。在20世紀70年代對水稻白葉枯病的病害循環(huán)進行了大量的實踐研究,逐步探明了病害的初侵染來源為病稻草和稻樁、帶菌稻種、再生稻、雜草及其他寄主植物[18]。但研究發(fā)現(xiàn),白葉枯病植物中病菌存活的時間長短與采集時和以后保存的溫度關系較大。7月份采集的標本經過一個炎熱的夏季,4個月后極少能成功分離出病原菌,9—10月隨著氣溫的降低,在各地采集的標本分離成功率都很高(參考1975年未出版的全國水稻白葉枯病防治研究資料選編)。病樣中病原菌不能分離是由于病原菌死亡,還是由于病原菌進入了不能培養(yǎng)但仍然活著的狀態(tài)尚未見有報道。另外,由于Xoo的生長相對于常見植物腐生菌的生長較慢,傳統(tǒng)的病原菌分離培養(yǎng)方法只能用于測定采集后妥善保存的病葉,暴露在外界雜菌多,且已腐爛的樣品不容易分離成功。本研究通過對采集自田間,保存在室溫和低溫下的樣品進行病原菌分離,確定了樣品保存的合適條件以及可能保存的時間,并利用細胞染色的方法研究了人工接種葉片中Xoo的存活狀態(tài),研究結果對于全面了解白葉枯病菌的侵染循環(huán)并制定有效防治白葉枯病的方法提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本研究所用的田間樣品的采集、保存信息見表1。

表1 用于分離的水稻白葉枯病葉樣品信息Table 1 Information of bacterial leaf blight samples of rice

菌株:PXO99A為菲律賓菌株6號小種的代表菌株,經氮胞苷處理過。人工接種的水稻白葉枯病葉:在苗齡為1個月的雜交水稻‘深兩優(yōu)871’上接種PXO99A,24 d 后采集發(fā)病葉片備用。

染料:MycoLightTMGreen JJ98 and JJ99(AAT Bioquest?,Canada),碘化丙啶(PI)(AAT Bioquest?,Canada)。抗生素利福平(Rifampicin,Rif)的工作濃度為 50 μg·mL-1。

1.2 病葉組織中病原菌的分離和菌量計測

田間病葉組織中病原物的分離:在載玻片上滴加1滴滅菌水,選取具有典型病害癥狀的水稻葉片,在病斑靠近基部剪取長寬約為1～2 mm 的組織塊放入滅菌水中,蓋上蓋玻片,在顯微鏡下觀察切口處是否有溢菌出現(xiàn)。選取出現(xiàn)溢菌的原初葉片,用75%乙醇棉片對剪口附近組織進行表面消毒,在剪口處向葉片基部組織方向剪取5～10 mm 長的組織塊插入裝有50 μL滅菌水的EP管中,靜置5～10 min。然后取5 μL 浸出液,在NA平板上劃線涂布開,然后轉動平板,從第一次劃線部分向約45度方向劃線,使第一次劃線區(qū)域的菌稀釋開,重復上述操作3～4次,直到將平板劃滿。我們將這個方法稱為劃線稀釋法(圖1-A)。將平板置于28 ℃ 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在傳統(tǒng)的末端劃線分離法[19](圖1-B)上用接種環(huán)劃線涂布開,轉動平板,在第一次劃線的末端部分向外劃線,然后再轉動平板在上一次的末端部分劃線,重復3～4次。病原菌分離試驗重復3次以上。

圖1 劃線稀釋分離法(A)和末端劃線分離法(B)示意圖Fig.1 Schematic diagram of streaking dilution separation method(A)and end streaking separation method(B)圖中數(shù)字表示劃線的次序。The numbers in the figure indicate the order of streaking.

人工接種白葉枯病葉中菌量計測:取發(fā)病癥狀典型的病葉若干片,將病斑部分剪成0.5 cm小段,充分混合后平均分成3份,分別置于4、28和37 ℃ 恒溫保存。每隔30 d取6個葉片段,用75% 乙醇擦拭葉片表面消毒,切取微小組織塊在顯微鏡下觀察,確保每張葉片都有噴菌現(xiàn)象。將6片葉段加入200 μL 0.9% 生理鹽水中,使其噴菌1 h 后,按10倍梯度稀釋,吸取5 μL 原液以及各稀釋倍數(shù)菌液點于NA+Rif平板上,28 ℃培養(yǎng),統(tǒng)計菌落數(shù)以計算菌含量值。每個樣品設3次重復。試驗重復2次。

1.3 菌落PCR驗證和噴菌液的熒光定量PCR

1.3.1 菌落PCR用牙簽挑取少許單菌落菌苔放入盛有100 μL無菌水的PCR管中,利用PCR儀加熱變性5 min 釋放菌體中的基因組DNA到水中,然后10 000 r·min-1離心1 min,取1 μL 上清液作為PCR的模板。Xoo特異性引物為Xoo4009F/R:CCTTCATTTCCGTCGTCATC/ATGCATGAAGAACCACCACA[20],PCR反應程序為94 ℃ 3 min;94 ℃ 30 s,64 ℃ 30 s,72 ℃ 90 s,34個循環(huán);72 ℃ 7 min。

1.3.2 噴菌液的熒光定量PCR取沒有分離到白葉枯病原菌的葉片段10個,加入1 mL滅菌水,噴菌3 h后將噴菌液在PCR儀上加熱變性5 min,釋放菌體中的基因組DNA到水中,再在10 000 r·min-1離心1 min,取1 μL 上清液作PCR的模板。分別用細菌通用性引物16SF/R:TGGTAGTCCACGCCCTAAACG/CTGGAAAGTTCCGTGGATGTC以及Xoo的特異性引物Xoo4009F/R進行熒光定量PCR,每組設置4個重復,通過CT值的比較來初步檢測噴菌液中Xoo的含量在整體細菌中的比例。熒光定量PCR采用ChamQ SYBR qPCR Master Mix 試劑盒(Vazyme),ABI PRISM 7500 quantitative PCR system(Applied Biosystems,USA)。反應程序為:95 ℃ 30 s;95 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s,40個循環(huán)。計算每個反應的CT值。試驗重復2次。

1.4 噴菌液中活、死細胞染色及細胞數(shù)目統(tǒng)計

將MycoLightTMGreen JJ98 and JJ99和碘化丙啶(PI)2種染料先用0.9% 生理鹽水稀釋,再與噴菌液混合使其終濃度分別為20和5 μmol·L-1,混勻后避光常溫放置15～30 min,在倒置熒光顯微鏡下觀察細胞染色情況。MycoLightTMGreen JJ98 and JJ99染色后死細胞和活細胞均染色并發(fā)出綠色熒光,PI染色后只有死細胞染色發(fā)出紅色熒光。選擇蓋玻片上的左上、右上、中央、左下及右下5個視野,分別統(tǒng)計發(fā)出綠色熒光的總細胞數(shù)以及發(fā)出紅色熒光的死細胞數(shù),再根據(jù)整合后的圖片,統(tǒng)計僅發(fā)出綠色熒光的活細胞數(shù)。試驗重復2次。

1.5 統(tǒng)計與分析

統(tǒng)計分析采用單因素隨機區(qū)組分析。

2 結果與分析

2.1 不同保存條件下水稻白葉枯病葉中病原菌的分離

在2019年,14個樣品在分離前都先取具有典型癥狀的葉片的病健交界處檢查噴菌現(xiàn)象,結果發(fā)現(xiàn) 14個樣品都有明顯的噴菌現(xiàn)象,不同樣品間噴菌現(xiàn)象沒有明顯差異。從8個保存于4 ℃ 的樣品中都分離到典型黃單胞的菌落,而從6個保存在室溫的樣品中都沒有分離到病原菌,并且這些樣品在平板上也很少有其他微生物生長。8個低溫保存的樣品中,B1和B4的分離物中雜菌較多(圖2-A),其他樣品的分離物相對較單一,為白葉枯病菌(圖2-B)。在分離時,雜菌的生長速度相對較快,在培養(yǎng)后1～2 d就有生長,而白葉枯病菌的生長速度則相對較慢,一般在培養(yǎng)后的3～4 d或者更久時間才有菌落出現(xiàn)。當樣品內雜菌多時,培養(yǎng)前2 d生長出來的雜菌生長較快,很快覆蓋了平板較早劃線的部分,有些雜菌菌落多糖較多,會成流淌樣。對于這樣的樣品,應當采用劃線稀釋分離的方法,水稻白葉枯病菌雖然生長較慢,但從圖1-A可見,在后幾次的劃線區(qū)域,生長較慢的白葉枯病菌的菌落在生長較快的雜菌菌落之間出現(xiàn)。對于該樣本,采用傳統(tǒng)的末端劃線的方法則很難獲得白葉枯病菌菌落(圖2-C)。由此可以看出平板劃線稀釋法相對于傳統(tǒng)的末端劃線法在分離含腐生或內生菌多的樣品時具有顯著的優(yōu)點。

圖2 田間水稻白葉枯病樣品的劃線分離Fig.2 Xanthomonas oryzae pv. oryzae(Xoo) isolation of the field rice bacterial leaf blight samples by streaking seperation methods A. B4樣本的劃線稀釋分離 B4 sample by streaking dilution separation;B. B8樣本的劃線稀釋分離 B8 sample by streaking dilution separation;C. B4樣本的末端劃線分離 B4 sample by end streaking separation.圖中箭頭表示生長較慢的水稻白葉枯病菌菌落。The arrows in the figure show the slower growing Xoo colonies.

用Xoo特異性引物Xoo4009F/R對已經分離到的菌進行PCR檢測,結果如圖3所示。無論是以分離菌株的單菌落為模板(圖3的16～23),還是以噴菌液(圖3的2～15)為模板,都獲得了1條大小為300 bp 左右的白葉枯病菌特異性條帶。表明田間采集的水稻白葉枯病樣保存在4 ℃下4年仍可以分離到病原菌。而保存在非恒定的室溫條件下2年內就不能分離到病原菌。

圖3 噴菌液和分離菌株的PCR驗證Fig.3 PCR verification of bacterial exudation liquid and isolated strains M. DL2000分子量標準;1.菜豆葉斑病樣品噴菌液(對照);2～15. 樣品B1—B14的噴菌液;16～23. 樣品B1—B8分離獲得的單菌落;24. PXO99A基因組DNA的陽性對照;25. 無菌水的陰性對照。M. DL2000 molecular standard;1. Bacterial exudation of bean bacterial leaf spot sample as a control;2-15. Bacterial exudation of sample B1-B14 respectively;16-23. Single colony isolated from sample B1-B8 respectively;24. PXO99A genomic DNA as positive control;25.Sterile water as negative control.

2.2 不同溫度保存條件下人工接種水稻病葉中的細菌可培養(yǎng)菌量測定

在水稻上人工接種利福平標記的Xoo獲得發(fā)病水稻葉片,然后放置在不同溫度下保存,在不同時間取樣分離病葉中的病原菌。從圖4可見:保存0、30和60 d 后,在4 ℃保存的葉片的菌量分別為1.41×106、2.59×105和2.03×104CFU·mL-1,在28 ℃保存的葉片的菌量分別為7.1×105、1.85×106和1.83×104CFU·mL-1,可見保存60 d的葉片中可培養(yǎng)菌量在和28 ℃下都有小幅度的下降。但在37 ℃ 保存0和30 d葉片的菌量分別為1.79×107和5.2×102CFU·mL-1,可培養(yǎng)菌量在30 d時下降了近5個數(shù)量級,保存60 d的樣品中則不能分離到可培養(yǎng)的細菌。但此時將3個溫度下不同保存時間的9個處理組樣品分別進行噴菌現(xiàn)象檢測,都觀察到明顯的噴菌現(xiàn)象,處理間噴菌的速度和菌量未見有明顯的差異。

圖4 不同溫度保存的水稻白葉枯病樣中PXO99A 在培養(yǎng)基上的計量Fig.4 The population of culturable PXO99A in samples of rice bacterial leaf blight stored at different temperatures

2.3 平板不能分離病菌的噴菌液中細胞染色

選用染料MycoLightTMGreen JJ98 and JJ99和碘化丙啶對在4、28和37 ℃保存60 d的樣品的噴菌液以及PXO99A的培養(yǎng)液(作為對照)進行染色,在顯微鏡下觀察細胞的熒光表達情況。結果如圖5所示,新鮮培養(yǎng)的PXO99A活力較好,死細胞相對較少,所以碘化丙啶染色后有極少量的散發(fā)紅色熒光的死細胞,而經MycoLightTMGreen JJ98 and JJ99染色后發(fā)出綠色熒光,2種熒光整合后看到視野中大部分是呈現(xiàn)綠色熒光的活細胞。說明利用MycoLightTMGreen JJ98 and JJ99和碘化丙啶可以檢測細胞的死活狀態(tài)。3個溫度處理組均有細胞發(fā)出紅色熒光,說明存在不同程度的細胞死亡現(xiàn)象,將綠色熒光和紅色熒光通道整合之后,均可以在3個處理組中發(fā)現(xiàn)有單獨發(fā)出綠色熒光的活細胞,在37 ℃ 處理中也發(fā)現(xiàn)有綠色熒光細胞。

圖5 不同處理下PXO99A的細胞染色情況Fig.5 The bacteria cell staining of PXO99A in different treatments

統(tǒng)計每個處理5個視野下活、死細胞占細胞總數(shù)的比例,發(fā)現(xiàn)在4 ℃ 保存的葉片噴菌中活細胞占52.51%,死細胞占47.49%;在28 ℃ 保存活細胞占32.17%,死細胞占67.83%;37 ℃ 保存的葉片噴菌液中活細胞占24.02%,死細胞占75.98%(圖6)。由以上數(shù)據(jù)可以看出,隨著病樣保存溫度的升高,活細胞比例逐漸減少。在37 ℃ 保存60 d病葉的噴菌液中沒有分離到能培養(yǎng)的病原菌,但細胞染色顯示,約有近1/4的活細胞存在,這說明這些細胞可能進入了VBNC的狀態(tài)。

圖7 37 ℃保存樣品噴菌液中總細菌(16S)和 水稻白葉枯病菌(Xoo)的定量Fig.7 Relative quantification of total bacteria(16S)and Xoo in bacterial exudations of 37 ℃ preserved bacterial leaf blight samples

為了進一步確定這些經過染色后顯示為活細胞的細菌是Xoo,還是植物中的腐生或內生菌,通過熒光定量PCR對37 ℃保存60 d的樣品中總細菌量和Xoo量分別進行了定量分析。16S引物是細菌的通用引物,可以用來確定噴菌液中的細菌總量,Xoo特異性的引物Xoo4009F/R被用來檢測Xoo的總量。通過比較定量PCR的CT值可以了解反應液中總細菌和Xoo菌的相對量。從圖7可見:用加熱裂解后的噴菌液作為模板進行定量PCR分析,16S引物和Xoo4009F/R引物擴增后的CT值沒有顯著差異。這說明在噴菌液中的細菌基本都是Xoo,而腐生或內生的細菌極少。由此可見37 ℃保存60 d的樣品中24.02%的活細胞應該是進入了VBNC狀態(tài)的Xoo。

3 討論與結論

水稻白葉枯病是水稻上的維管束病害,病原菌Xoo在稻種、病稻草、稻樁或者雜草上越冬作為初侵染來源。研究環(huán)境條件對Xoo存活率和生活力的影響對于全面了解該病害的發(fā)生特點,制定有效的防病策略具有重要的意義。在本研究中,我們對田間采集的保存在不同條件下的水稻白葉枯病樣品中的Xoo利用不同方法進行了分離研究,結果顯示只要是發(fā)病的樣品,在室溫或4 ℃下保存1～5年都可以觀察到噴菌現(xiàn)象。噴菌現(xiàn)象只能是細菌侵染過的表征,不能說明其中菌體的活力狀況。從病葉中分離Xoo時,只有保存在4 ℃的樣品可以分離到Xoo,而且保存了4年的樣品仍然可以分離到Xoo,不同保存年代的樣品中分離到的Xoo之間的活力差異不顯著,一般平板生長3～4 d可見有菌落出現(xiàn)。保存在室溫(2～5年)的樣品中卻未能分離到Xoo,平板放置7～10 d未見有菌落出現(xiàn)。這個結果說明高溫對于病葉中Xoo的存活或活力是有影響的,這與過去報道的經過夏季高溫后采集的樣品分離Xoo較難是一致的(未出版資料選,1975)。從病植物上分離病原菌時,通常有組織塊分離法、稀釋分離法和劃線分離法[21-23],但在分離田間樣品時有的樣品狀態(tài)較差,尤其是水稻生長后期,病葉枯死厲害,腐生菌較多,如果用常規(guī)組織塊誘導菌膿,則大量的腐生菌菌膿會很快覆蓋組織塊,誘導菌膿相當于讓腐生菌得到了更多的富集,使得生長慢的病原菌的量占比更少,因此不利于分離病原菌。如果用磨碎病組織進行稀釋涂板分離,則需要對磨樣做一系列的稀釋,每個稀釋度都要進行涂板,這需要較多的平板。特別是在批量分離樣品時,費時費工成本高。本研究中介紹的劃線稀釋法通過直接收集噴菌液,腐生菌沒有經過富集,采用劃線的方法進行依次稀釋,在前面菌濃度高區(qū)域的腐生菌優(yōu)勢生長,經過幾次劃線稀釋后腐生菌和病原菌一起被稀釋,在腐生菌菌落之間給生長慢的病原菌提供足夠的生長空間,這樣在一塊平板上就可以獲得病原菌的單菌落。

對經過37 ℃高溫處理的水稻病葉的噴菌現(xiàn)象檢測顯示有大量的菌體存在,但卻很難分離到Xoo,此時的Xoo是死亡了,還是處于不可培養(yǎng)狀態(tài)(VBNC)尚不得而知。有文獻記載在自然條件下Xoo存在生長停滯現(xiàn)象[18],但未見試驗證據(jù)報道。細菌的VBNC現(xiàn)象是在1982年被發(fā)現(xiàn)的,目前,能進入VBNC狀態(tài)的黃單胞菌只有地毯草黃單胞菌(X.axonopodis)[11]以及野油菜黃單胞菌(X.campestris)[6,13]被報道。本研究利用平板分離法及活、死細菌檢測試劑盒[24]證實了PXO99A在37 ℃ 時不能分離的Xoo部分進入了VBNC狀態(tài)。有文獻記載,帶菌的稻種在干燥貯存條件下,病菌可存活8～10個月,在貯存期病菌會逐漸死亡,到播種時種子帶菌率很低,但由于播種量大,仍有足夠的傳病來源[25]。對于該記載,我們認為由于先前沒有對VBNC的認知,確定病菌存活或種子帶菌率一般是根據(jù)在培養(yǎng)基上分離Xoo的結果,不能分離到Xoo只能說明沒有可培養(yǎng)的病菌,但卻不能夠發(fā)現(xiàn)存活但不可培養(yǎng)的Xoo的存在。

根據(jù)本文對Xoo能夠進入VBNC狀態(tài)的研究結果,我們可以對自然條件下水稻白葉枯病病害循環(huán)進行下面的假設:在夏季高溫脅迫下,存在于稻種中或病殘體中的Xoo可部分進入VBNC狀態(tài)有助于其越冬,在水稻生長季開始的時候這些進入VBNC的Xoo隨種子萌發(fā),或水稻生長受到特定的刺激而復蘇,Xoo活化增殖后從特定途徑侵入水稻引起病害。至于對進入VBNC的Xoo在什么條件下受哪些因子的影響而復蘇仍需做進一步的研究。