裸腳菇0612-9提取物對柑橘青、綠霉的抑菌活性及作用機(jī)制

霍光華 張先吉 顏俊清 崔朝宇 龍昊知 張林平 胡殿明 彭文文

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué)， 江西省菌物資源保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗室， 江西 南昌 330045)

由意大利青霉(Penicilliumitalicum)和指狀青霉(P.digitatum)引起的柑橘青、綠霉病是目前柑橘貯運(yùn)、保藏過程中最常見的病害[1]。這兩種病原菌引起貯藏期柑橘果實(shí)腐爛變質(zhì)，嚴(yán)重影響柑橘品質(zhì)[2]。目前，柑橘采后保鮮、防病的主要手段仍是采用甲基托布津、多菌靈、噻菌靈、咪鮮胺、抑霉唑等化學(xué)殺菌劑進(jìn)行浸果處理[3]，長期使用化學(xué)殺菌劑，不僅容易導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生耐藥性，影響病害防治效果，還會造成農(nóng)藥殘留等問題，對消費(fèi)者健康和安全造成威脅[4]。因此，開發(fā)新型安全、高效的防治藥劑來替代化學(xué)殺菌劑具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

2014年，江西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院制藥工程與霍光華課題組在江西省南昌市梅嶺山區(qū)林地木材上采集到一株野生大型真菌0612-9，鑒定為祼腳菇屬種，命名為裸腳菇(Gymnopussp.)0612-9[5-6]。吳勝等[7]對該菌株發(fā)酵液的抑菌活性進(jìn)行了研究，表明該菌種發(fā)酵液對意大利青霉(P.italicum)、指狀青霉(P.digitatum)、水稻紋枯病菌(Rhizoctoniasolani)、灰葡萄孢(Botrytiscinerea)等13種植物病原真菌均具有抑制活性，其中對意大利青霉和指狀青霉的抑制效果最佳。隨后，吳天福等[8]對菌株0612-9發(fā)酵液中活性物質(zhì)的穩(wěn)定性進(jìn)行了系統(tǒng)分析，證實(shí)分離獲得的活性物質(zhì)I在高溫、紫外光、氧化和極端pH等條件下均較穩(wěn)定；花紀(jì)等[9]系統(tǒng)研究了該菌株代謝產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)的液體發(fā)酵條件，其最佳液體菌種培養(yǎng)基組成為玉米粉30 g·L-1、麥芽糖10 g·L-1、蛋白胨15 g·L-1、KH2PO42 g·L-1、 MgSO4·7H2O 1 g·L-1，最佳培養(yǎng)條件為起始pH值5、接種3×Ф7 mm菌塊、裝液量100 mL/250 mL三角瓶、溫度28℃、轉(zhuǎn)速160 r·min-1。但目前關(guān)于裸腳菇0612-9發(fā)酵液中活性物質(zhì)抑制意大利青霉和指狀青霉的作用機(jī)制尚鮮見研究報道。

本研究以意大利青霉和指狀青霉菌絲體為試驗對象，采用菌絲生長速率法測定裸腳菇0612-9提取物(extract of fermentation broth fromGymnopussp. 0612-9, GSFE)對病原菌的抑菌活性；利用掃描電鏡和透射電鏡觀察GSFE對病原菌菌絲形態(tài)和細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響；并測定GSFE對病原菌菌絲相對電導(dǎo)率，核酸、可溶性蛋白含量和麥角固醇合成的影響；揭示GSFE拮抗意大利青霉和指狀青霉的作用機(jī)制，以期為新型微生物源柑橘采后保鮮劑的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株 裸腳菇0612-9，保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，編號CGMCC15375；意大利青霉和指狀青霉由江西省果蔬保鮮與無損檢測重點(diǎn)實(shí)驗室提供。

1.1.2 培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(potato dextrose agar, PDA)：去皮馬鈴薯200 g·L-1、葡萄糖20 g·L-1、瓊脂粉15 g·L-1；馬鈴薯葡萄糖肉湯培養(yǎng)基(potato dextrose broth, PDB)：PDA培養(yǎng)基中不加瓊脂粉；種子培養(yǎng)液：玉米粉30 g·L-1、麥芽糖10 g·L-1、蛋白胨15 g·L-1、磷酸二氫鉀2 g·L-1、硫酸鎂1 g·L-1，pH值7.0；發(fā)酵培養(yǎng)液：去皮馬鈴薯280 g·L-1、葡萄糖30 g·L-1、 麩皮8.25 g·L-1、磷酸二氫鉀2 g·L-1、硫酸鎂0.41 g·L-1，pH值7.0。

1.2 儀器與設(shè)備

N-1200B型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，東京理化器械株式會社；BLK-FD-0.5型真空冷凍干燥機(jī)，江蘇博萊客冷凍科技發(fā)展有限公司；EMU C7型超薄切片機(jī)，德國Leica公司；H-3000 N型掃描電子顯微鏡、H-7650型透射電子顯微鏡，日本Hitachi公司；Ti-S倒置熒光顯微鏡，日本Nikon公司；E2695型高效液相色譜，美國Waters公司；UV759型紫外可見分光光度儀，上海奧譜勒儀器有限公司。

1.3 GSFE的制備

將斜面保存的裸腳菇0612-9接種至PDA平板中，28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，然后用5 mm打孔器沿菌落邊緣打孔，挑取菌餅接種于100 mL種子培養(yǎng)液中，于28℃、180 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)9 d；按10%比例將種子液接種至5 L發(fā)酵培養(yǎng)液中，振蕩培養(yǎng)5 d后即為裸腳菇發(fā)酵液。用濾紙濾除發(fā)酵液中的菌絲，隨后將發(fā)酵上清液濃縮至1 L左右，加入等體積的乙酸乙酯超聲萃取3次，取上層乙酸乙酯相，合并后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮成浸膏，取適量浸膏加入甲醇溶解，制成質(zhì)量濃度為2.5 mg·mL-1的GSFE母液，0.22 μm無菌微孔濾膜過濾，于4℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 GSFE抑菌活性的測定

1.4.1 室內(nèi)毒力測定 參考易磊等[10]的方法，采用菌絲生長速率法測定并計算毒力方程。將2.5 mg·mL-1的GSFE母液稀釋成1 250、625、312.5、156.3和78.2 μg·mL-1的不同質(zhì)量濃度的溶液，在無菌條件下，將不同濃度GSFE溶液和培養(yǎng)基按1∶9的比例混合分別制成250、125、62.5、31.25、15.63和7.82 μg·mL-1含藥培養(yǎng)基，用直徑6.5 mm的打孔器取活化好的病原菌邊緣菌塊，接種至含藥培養(yǎng)基中央，以添加等量甲醇溶液為空白對照。每個處理重復(fù)3次，28℃條件下培養(yǎng)7 d，用十字交叉法測量菌落直徑，計算抑菌率。將菌絲生長抑制率換算成機(jī)率值y，藥劑濃度換算成濃度對數(shù)x，求得毒力回歸方程y=a+bx，并由毒力方程計算出半最大效應(yīng)濃度(concentration for 50% of maximal effect, EC50)值和相關(guān)系數(shù)r值[11]。

1.4.2 最小抑菌濃度測定 參考Yahyazadeh等[12]的方法。首先配制125、150、175、200、225和250 μg·mL-1含藥PDA平板，用直徑6.5 mm的打孔器取活化好的病原菌邊緣菌塊，接種至含藥培養(yǎng)基中央。每個處理重復(fù)3次，28℃下培養(yǎng)2 d后觀察病原菌生長情況。以無病原菌生長的PDA平板的含藥濃度為最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration, MIC)。

1.5 GSFE對意大利青霉和指狀青霉菌絲和細(xì)胞形態(tài)的影響

1.5.1 菌絲培養(yǎng) 取0.5 mL病原菌孢子懸浮液(106個·mL-1) 接種至30 mL的PDB培養(yǎng)液中，于28℃、180 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)2 d，加入不同濃度的GSFE，共設(shè)置3個濃度梯度，分別為0、EC50、MIC，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)1 d后取樣，備用。

1.5.2 掃描電鏡觀察病原菌菌絲形態(tài)的變化 參考Palma-Guerrero等[13]的方法，取上述菌絲分別浸泡在2.5%的戊二醛溶液中，4℃冰箱內(nèi)固定過夜。然后將戊二醛吸出，用0.05 mol·L-1的PBS緩沖液(pH值7.0)清洗樣品3次，每次20 min。用1%的鋨酸溶液固定樣品2 h，將鋨酸溶液取出并回收，用0.05 mol·L-1的PBS緩沖液(pH值7.0)清洗樣品3次，每次20 min。用梯度濃度為30%、50%、70%、80%、90%和95%的乙醇溶液對樣品進(jìn)行脫水處理，每種濃度處理20 min，再用100%的乙醇脫水處理45 min，酒精脫水后將樣品置于真空冷凍干燥儀中進(jìn)行干燥處理，噴金處理后于掃描電鏡(scanning electron microscope, SEM)下觀察，并記錄不同處理條件下病原菌菌絲形態(tài)變化情況。

1.5.3 透射電鏡觀察病原菌細(xì)胞形態(tài)的變化 參考Zhou等[14]的方法，菌絲樣品固定、脫水步驟同1.4.2，經(jīng)置換、浸透、包埋處理后，由EMU C7型超薄切片機(jī)切得70～90 nm的切片，切片經(jīng)鈾、鉛雙染后于透射電鏡(transmission electron microscope, TEM)下進(jìn)行觀察，并記錄不同處理條件下病原菌細(xì)胞形態(tài)變化情況。

1.6 GSFE對病原菌細(xì)胞膜通透性的影響

1.6.1 熒光顯微鏡下觀察GSFE對病原菌細(xì)胞膜通透性的影響 參考Huang等[15]的方法，取0.5 mL病原菌孢子懸浮液(106CFU·mL-1)接種至30 mL的PDB培養(yǎng)液中，于28℃、180 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)48 h后，添加GSFE使其終濃度分別為0、EC50和MIC，繼續(xù)培養(yǎng)8 h。取出5 mL菌液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，8 000 r·min-1離心5 min收集菌體，用0.05 mol·L-1的PBS緩沖液(pH值7.0)清洗3次以去掉殘余培養(yǎng)液，加入500 μL 10 μg·mL-1的碘化丙啶避光染色30 min，離心收集菌體，用PBS緩沖液清洗3次，加入2 mL PBS緩沖液懸浮菌體，取20 μL懸浮液于載玻片上，蓋上蓋玻片，于熒光顯微鏡下(激發(fā)波長BP 546/12 nm，發(fā)射波長LP 590 nm)觀察并拍照。

1.6.2 菌絲胞外電導(dǎo)率的測定 取0.5 mL病原菌孢子懸浮液(106CFU·mL-1)接種至30 mL的PDB培養(yǎng)液中，于28℃、180 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)2 d。取出菌絲體，用布氏漏斗抽干其表面培養(yǎng)液和水分，并用PBS緩沖液沖洗3次，稱取1 g菌絲轉(zhuǎn)移至25 mL試管中，加入10 mL終濃度為0、EC50和MIC的GSFE；分別在GSFE處理0.5、1、2、4、6和8 h時測定各處理液的電導(dǎo)率，并按以下公式計算相對電導(dǎo)率[16]：

相對電導(dǎo)率=

1.6.3 菌絲蛋白質(zhì)和核酸類物質(zhì)外滲的測定 在含有不同濃度GSFE的PDB培養(yǎng)液中培養(yǎng)病原菌菌絲，分別在培養(yǎng)0.5、1、2、4、6和8 h后吸取2 mL菌液，14 000 r·min-1離心5 min，收集上清液，采用紫外分光光度計分別測定260 nm和280 nm波長下的吸光度值[17]，OD260和OD280分別表示上清液中核酸類和蛋白質(zhì)類物質(zhì)的相對含量。

1.7 GSFE對病原菌作用靶位預(yù)測分析

1.7.1 對病原菌菌絲麥角固醇含量的影響 取0.5 mL病原菌孢子懸浮液(106CFU·mL-1)接種至30 mL的PDB培養(yǎng)液中，于28℃、180 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)2 d，加入GSFE使其終濃度為EC50，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)48 h，收集菌絲，加入無菌蒸餾水沖洗數(shù)次，洗掉殘余培養(yǎng)液并抽濾，稱取0.5 g菌絲放入研缽中，參考吳志明等[18]的方法提取各菌絲樣品中的麥角固醇。

通過高效液相色譜(high performance liquid chromatography, HPLC)檢測麥角固醇含量。精確稱取5 mg麥角固醇用分析純乙醇溶解并定容至10 mL，配置成濃度分別為250、125、100、50、25和5 μg·mL-1的麥角固醇液相檢測標(biāo)準(zhǔn)液。用微量進(jìn)樣器吸取上述麥角固醇樣品15 μL，注入液相色譜儀測定麥角固醇含量，HPLC條件：色譜柱為Thermo Scientific Hypersil BDS C18、流動相為色譜級純甲醇、紫外檢測器(Waters 2487)檢測波長282 nm、柱溫25℃、流速0.9 mL·min-1、 進(jìn)樣量15 μL，以峰面積為縱坐標(biāo)(y)，濃度為橫坐標(biāo)(x)，繪制HPLC標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算各樣品中的麥角固醇含量。以添加等量無菌0.05 mol·L-1的PBS緩沖液(pH值7.0)培養(yǎng)的意大利青霉和指狀青霉為空白對照。

1.7.2 兩性霉素B和GSFE復(fù)配抑菌效果評價 將兩性霉素B與GSFE按照一定比例混配，按照1.4.1的方法測定兩性霉素B、GSFE及兩者混劑對意大利青霉和指狀青霉菌絲生長的抑制作用。采用Wadley方法計算混配藥劑的增效系數(shù)(synergistic ratio，SR)，評價混配藥劑的聯(lián)合作用類型[19]。

EC50(th)=(a+b)/(a/EC50A+b/EC50B)

SR=EC50(th)/EC50(ob)

式中，a，b分別代表A藥(兩性霉素B)和B藥(GSFE)在混劑中所占比例。EC50(th)為理論值，EC50(ob)為實(shí)測值。SR<0.5為拮抗作用，0.5≤SR≤1.5為相加作用，SR>1.5為增效作用[19]。

1.7.3 對病原菌麥角固醇合成途徑影響 取0.5 mL病原菌孢子懸浮液(106CFU·mL-1)接種至30 mL的PDB培養(yǎng)液中，于28℃、180 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)2 d，隨后分別加入GSFE、兩性霉素B以及二者混劑，各供試藥劑終濃度為EC50，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)48 h，收集菌絲，加入無菌蒸餾水沖洗數(shù)次，洗掉殘余培養(yǎng)液并抽濾。對各菌絲樣品中麥角固醇、甾醇類化合物進(jìn)行提取。采用薄層色譜法對各樣品進(jìn)行檢測，以麥角固醇標(biāo)準(zhǔn)品作為對照。

薄層色譜和掃描條件：展開劑為環(huán)己烷∶乙酸乙酯(4∶1)，蒸汽飽和30 min，展開8 cm；分別取標(biāo)準(zhǔn)品及各樣品溶液20 μL點(diǎn)于高效硅膠板上展開；10%硫酸乙醇溶液噴霧，110℃顯色60 min。

1.8 數(shù)據(jù)分析

采用DPS 7.05軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，使用GraphPad Prism 8軟件繪制圖片。

2 結(jié)果與分析

2.1 GSFE對意大利青霉和指狀青霉的抑制活性

由表1可知，GSFE對意大利青霉和指狀青霉菌絲的抑制率隨著GSFE濃度的升高而增強(qiáng)，其中GSFE對意大利青霉的毒力線性回歸方程為y=2.067 6+1.347 0x， 相關(guān)系數(shù)為0.987 0，EC50為116.76 μg·mL-1； 對指狀青霉的毒力線性回歸方程為y=2.016 6+1.375 1x，相關(guān)系數(shù)為0.990 8，EC50為147.74 μg·mL-1。

當(dāng)GSFE濃度達(dá)250 μg·mL-1時，其對意大利青霉和指狀青霉抑制率均達(dá)100%(表1)，推測GSFE對意大利青霉和指狀青霉的最小抑菌濃度應(yīng)介于125～250 μg·mL-1之間。為測定其最小抑菌濃度，配制GSFE濃度為125、150、175、200、225和250 μg·mL-1含藥平板，觀察意大利青霉和指狀青霉在含藥平板上的生長狀況。結(jié)果顯示，意大利青霉和指狀青霉在GSFE濃度為125、150、175 μg·mL-1的含藥平板上均能生長，而在GSFE濃度為200、225和250 μg·mL-1含藥平板上均不能生長。因此，GSFE對意大利青霉和指狀青霉的最小抑菌濃度均為200 μg·mL-1。

2.2 GSFE對病原菌菌絲形態(tài)的影響

經(jīng)掃描電鏡觀察，GSFE處理的意大利青霉和指狀青霉菌絲形態(tài)發(fā)生了明顯變化。在對照組(未加入GSFE)中，2種病原真菌菌絲均形態(tài)飽滿、表面均勻光滑、粗細(xì)均勻、隔膜清晰(圖1-A1、B1)；而經(jīng)GSFE處理后，意大利青霉和指狀青霉菌絲表面均出現(xiàn)塌陷皺縮，菌絲體出現(xiàn)畸形干癟(圖1-A2、A3、B2、B3)；經(jīng)MIC濃度的GSFE處理后，部分菌絲出現(xiàn)較嚴(yán)重的扭曲，甚至呈螺旋狀(圖1-A3、B3)。結(jié)果表明，GSFE對意大利青霉和指狀青霉菌絲產(chǎn)生了嚴(yán)重影響，造成菌絲脫水、皺縮。

注：A1、B1：未加入GSFE培養(yǎng)的菌絲；A2、B2：用終濃度為EC50的GSFE培養(yǎng)的菌絲；A3、B3：用終濃度為MIC的GSFE培養(yǎng)的菌絲。下同。圖中箭頭表示菌絲損傷部位。Note: Mycelia were incubated in PDB without GSFE (A1、B1) or at final concentrations of EC50 (A2、B2) or MIC (A3、B3). The same as following. The arrow in the figure shows the damage site of mycelium.圖1 GSFE對意大利青霉(A)和指狀青霉(B)菌絲形態(tài)的影響Fig.1 Effects of GSFE on mycelial morphology of P. italicum (A) and P. digitatum (B)

圖2 GSFE對意大利青霉(A)和指狀青霉(B)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響Fig.2 Effects of GSFE on cell ultrastructure of P. italicum (A) and P. digitatum (B)

2.3 GSFE對病原菌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響

經(jīng)透射電鏡觀察，在對照組中，2種病原真菌菌絲均細(xì)胞飽滿、結(jié)構(gòu)清晰、層次清楚、胞外無滲透物；細(xì)胞壁、細(xì)胞膜連續(xù)且完整；其中細(xì)胞壁規(guī)則完整，質(zhì)地致密，并且厚薄均勻；細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)也緊密且完整；細(xì)胞器豐富完整，細(xì)胞核、核仁等細(xì)胞器清晰可見(圖2-A1、B1)。而經(jīng)GSFE處理后，2種病原真菌的菌絲細(xì)胞發(fā)育明顯受到抑制，細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)也受到破壞，細(xì)胞壁出現(xiàn)變形，部分細(xì)胞壁增厚(圖2-B2)，且出現(xiàn)明顯的質(zhì)壁分離現(xiàn)象(圖2-A2、B2)；細(xì)胞膜則內(nèi)折形成層狀結(jié)構(gòu)，出現(xiàn)明顯的皺縮(圖2-A2、A3、B2、B3)；細(xì)胞器組成紊亂，結(jié)構(gòu)模糊不明顯，胞質(zhì)不均勻。此外，當(dāng)GSFE濃度達(dá)MIC時，胞內(nèi)細(xì)胞器呈現(xiàn)碎渣樣(圖2-B3)；部分菌絲內(nèi)甚至呈現(xiàn)空腔狀(圖2-A3)。由此可見，GSFE處理后，意大利青霉和指狀青霉菌絲細(xì)胞完整性喪失、細(xì)胞器出現(xiàn)損傷、內(nèi)含物大量流失。

2.4 GSFE對病原菌細(xì)胞膜通透性的影響

2.4.1 熒光顯微鏡下觀察GSFE對病原菌細(xì)胞膜通透性的影響 碘化丙啶(propidium iodide, PI)是一種核酸染料。它不能穿透完整的細(xì)胞膜，但凋亡晚期和死細(xì)胞由于細(xì)胞膜通透性增加，其能夠透過細(xì)胞膜而將細(xì)胞核染色[17-18]。

熒光顯微鏡結(jié)果表明，經(jīng)PI染色的2種病原真菌菌絲對照組胞內(nèi)顯示紅色熒光(圖3-B1、D1)；而經(jīng)EC50、MIC濃度GSFE處理后的多數(shù)菌絲體胞內(nèi)則呈現(xiàn)出熒光現(xiàn)象(圖3-B2、B3、D2、D3)。對比EC50濃度GSFE處理的菌絲體熒光強(qiáng)度(圖3-B2、D2)，MIC濃度處理的菌絲體紅色熒光明顯更強(qiáng)(圖3-B3、D3)。結(jié)果表明，GSFE造成意大利青霉和指狀青霉的細(xì)胞膜損傷，引起細(xì)胞膜通透性增加，最終導(dǎo)致PI染料能夠進(jìn)入菌體對細(xì)胞核進(jìn)行染色。

圖3 GSFE對意大利青霉(A、B)和指狀青霉(C、D)菌絲體細(xì)胞膜通透性的影響Fig.3 Effects of GSFE on membrane permeability of mycelium of P. italicum (A、B) and P. digitatum (C、D)

圖4 GSFE對意大利青霉(A)和指狀青霉(B)菌絲相對電導(dǎo)率的影響Fig.4 Effects of GSFE treatment on the conductivity of P. italicum (A) and P. digitatum (B) mycelia

2.4.2 對菌絲胞外電導(dǎo)率的影響 電導(dǎo)率可間接反映病原菌菌絲細(xì)胞膜的損傷程度，電導(dǎo)率越大，表明電解質(zhì)滲漏量越多，細(xì)胞膜的損傷程度越嚴(yán)重[20]。由圖4可知，在一定范圍內(nèi)，相對電導(dǎo)率隨著時間的延長及GSFE濃度的增高而逐漸增大，并且各時間點(diǎn)的相對電導(dǎo)率均高于對照組。其中，在處理8 h時，經(jīng)EC50和MIC濃度處理的意大利青霉相對電導(dǎo)率分別達(dá)到40.07%和49.23%，對照組僅為22.67%(圖4-A)；而經(jīng)EC50和MIC濃度處理的指狀青霉相對電導(dǎo)率則達(dá)到33.13%和42.86%，對照組僅為20.38%(圖4-B)。綜上，經(jīng)GSFE處理后，意大利青霉和指狀青霉電解質(zhì)泄露量增加，造成反應(yīng)液中電導(dǎo)率上升，說明GSFE處理對2種病原菌細(xì)胞膜造成破壞，從而導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性增加。

2.4.3 對細(xì)胞內(nèi)容物泄露的影響 當(dāng)病原菌細(xì)胞膜遭到破壞時，核酸、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)均會從細(xì)胞膜中釋放出來[21]，因此，可通過測定上清液中核酸、蛋白質(zhì)含量的變化來評估GSFE處理后意大利青霉和指狀青霉細(xì)胞膜通透性的損傷程度。如圖5所示，意大利青霉和指狀青霉在不同濃度(EC50、MIC)GSFE處理后，培養(yǎng)液中蛋白質(zhì)和核酸含量均高于對照組，并且隨著GSFE處理時間的延長，蛋白質(zhì)和核酸向外滲透量更為明顯，處理6 h時，病原菌培養(yǎng)液中可溶性蛋白和核酸的含量是對照組的2～3倍。

圖5 GSFE對意大利青霉(A)和指狀青霉(B)菌絲體內(nèi)容物滲漏的影響Fig.5 Effects of GSFE treatment on the leakage of cell contents of P. italicum (A) and P. digitatum (B) mycelia

2.5 GSFE在病原菌上作用靶位的分析

2.5.1 GSFE和兩性霉素B復(fù)配增效系數(shù)測定結(jié)果 在毒力測定試驗中，單用兩性霉素B對意大利青霉的毒力線性回歸方程為y=2.976 1+1.106 9x，相關(guān)系數(shù)為0.987 8，EC50值為67.38 μg·mL-1； 而GSFE與兩性霉素按1∶1比例混合后，復(fù)配藥劑對意大利青霉的毒力線性回歸方程為y=2.005+1.427x，相關(guān)系數(shù)為0.990 7，測得EC50(實(shí)際)值為88.54 μg·mL-1； 利用Wadley評價方法計算得出EC50(理論)值為85.45 μg·mL-1， SR為1.048，介于0.5～1.5之間，為相加作用。

單用兩性霉素B對指狀青霉的毒力線性回歸方程為y=3.181 0+0.972 6x，相關(guān)系數(shù)為0.989 2，EC50為74.15 μg·mL-1；而復(fù)配藥劑對指狀青霉的毒力線性回歸方程為y=2.193 6+1.419 7x，相關(guān)系數(shù)為0.991 5，測得EC50(實(shí)際)值為94.19 μg·mL-1；利用Wadley評價方法計算得出EC50(理論)值為98.70 μg·mL-1， SR為0.95，介于0.5～1.5之間，為相加作用。

GSFE與兩性霉素B抑制意大利青霉和指狀青霉具有相加作用，說明這兩類物質(zhì)可能具有相同的病原作用靶位。兩性霉素B作用真菌病原靶位是其細(xì)胞膜上的麥角固醇，因此，GSFE作用青、綠霉病原作用靶位可能也為其細(xì)胞膜上的麥角固醇。

2.5.2 對病原菌麥角固醇含量的影響 根據(jù)不同濃度麥角固醇標(biāo)準(zhǔn)品與其對應(yīng)的HPLC檢測峰面積數(shù)據(jù)，以峰面積為縱坐標(biāo)(y)，濃度為橫坐標(biāo)(x)繪制HPLC標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得其回歸方程為y=11 296x+13 110，相關(guān)系數(shù)為0.999 8。由圖6-A可知，麥角固醇標(biāo)準(zhǔn)品與樣品吸收峰均能與其他雜質(zhì)峰呈現(xiàn)較好的分離，且保留時間基本一致，均為7 min左右，表明該檢測方法切實(shí)可行，可用于菌絲樣品麥角固醇含量檢測。

在意大利青霉處理組中，對照組峰面積為372 891， 經(jīng)濃度為EC50的GSFE處理后的菌絲中麥角固醇含量顯著降低，僅為對照組的17.92%(圖6-B)；在指狀青霉處理組中，對照組峰面積為324 980，處理組中菌絲中麥角固醇含量也僅為對照組的20.13%(圖6-C)。結(jié)果表明，GSFE不僅有類似兩性霉素B作用病原菌細(xì)胞膜上麥角固醇靶位，而且還有類似氟康唑等引起病原菌細(xì)胞膜上麥角固醇合成受阻作用，可能與GSFE具有多種抗菌活性成分有關(guān)。

注：A：麥角固醇標(biāo)準(zhǔn)品；B：經(jīng)GSFE(EC50)處理過的意大利青霉中的麥角固醇；C：經(jīng)GSFE(EC50)處理過的指狀青霉中的麥角固醇。Note: A: Ergostrol standard. B: Ergosterol in P. italicum treated EC50 of GSFE. C: Ergosterol in P. digitatum treated with EC50 of GSFE.圖6 GSFE對意大利青霉和指狀青霉菌絲麥角固醇含量的影響Fig.6 Effects of GSFE treatment on the ergosterol content of P. italicum and P. digitatum mycelia

3 討論

我國野生大型真菌資源豐富，種類繁多，是重要的天然藥物資源庫[22]。由于大型真菌天然代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)多樣且抑菌活性顯著，一些來源于大型真菌的發(fā)酵產(chǎn)物已在植物病害生物防治工作中得以應(yīng)用。近年來，從大型真菌中發(fā)掘抑菌活性成分、探索活性成分抑菌機(jī)制已成為熱門的研究方向[23]。裸腳菇0612-9是采集自南昌市梅嶺山區(qū)的一株野生大型真菌，目前已經(jīng)從裸腳菇0612-9發(fā)酵液中分離并鑒定出兩種類胡蘿卜烷型化合物fulvoferruginin和5-epi-fulvoferruginin，兩者均具有抑制柑橘青、綠霉病病原菌的活性[24]。據(jù)報道，來源于海藻附生真菌綠木霉(Trichodermavirens)Y133發(fā)酵產(chǎn)物的一種胡蘿卜烷倍半萜類化合物具有抑制微藻生長的活性[25]；此外，從五味子屬植物鶴慶五味子Schisandrawilsoniana中提取的胡蘿卜烷型倍半萜具有抗乙型肝炎病毒活性[26]。本研究證明GSFE在意大利青霉和指狀青霉等病原菌上的作用位點(diǎn)是細(xì)胞膜上的麥角固醇，這與兩性霉素B等真菌藥物的作用靶點(diǎn)一致，但裸腳菇0612-9中幾種已知的胡蘿卜烷型化合物與兩性霉素B結(jié)構(gòu)存在一定的差異，其產(chǎn)生靶位競爭的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

本研究中，GSFE處理引起意大利青霉和指狀青霉細(xì)胞膜通透性增加、麥角固醇含量降低，這一結(jié)果表明麥角固醇可能是GSFE作用靶位之一。麥角固醇是真菌細(xì)胞膜上的特異組分，其主要功能是維持細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定性。麥角固醇的缺乏會導(dǎo)致菌絲細(xì)胞膜完整性受損，因此麥角固醇也成為許多真菌藥劑的作用靶位[27-28]。如檸檬醛、新型農(nóng)抗N2等均通過影響菌絲細(xì)胞膜麥角固醇合成途徑使細(xì)胞膜通透性改變，引起細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)外滲，導(dǎo)致點(diǎn)狀青霉和水稻紋枯病菌等病原真菌的死亡[18，29]。為明確GSFE中與麥角固醇互作的活性組分，后續(xù)有必要對活性物質(zhì)進(jìn)行分離純化，并對活性成分與麥角固醇互作機(jī)制進(jìn)行深入研究。

4 結(jié)論

GSFE對意大利青霉和指狀青霉菌絲生長均有較強(qiáng)的抑制活性。經(jīng)GSFE處理后，意大利青霉和指狀青霉的菌絲均發(fā)生嚴(yán)重的皺縮、干癟，胞內(nèi)空泡狀；細(xì)胞質(zhì)大量減少，細(xì)胞膜通透性增加，菌體內(nèi)核酸、可溶性蛋白及麥角固醇含量顯著降低。此外，含量分析及靶位競爭試驗顯示GSFE對意大利青霉和指狀青霉作用靶位之一為麥角固醇。