利用植物提取物綠色合成納米銀粒子及其對(duì)臺(tái)灣乳白蟻的毒性

謝曉俊， 羊桂英， 于保庭， 胡 寅， 莫建初,*

(1.浙江大學(xué)昆蟲科學(xué)研究所, 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)業(yè)昆蟲學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 浙江省作物病蟲生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 杭州 310058;2.全國(guó)白蟻防治中心, 杭州 310011)

近年來，隨著害蟲和病原微生物耐藥性的增強(qiáng)，人們嘗試將納米技術(shù)與生物技術(shù)相結(jié)合，來發(fā)展兼具殺菌和抗蟲活性的綠色納米產(chǎn)品(Aziz and Akbarzadeh, 2017)。 納米銀粒子(silver nanoparticles, AgNPs)是指粒徑達(dá)到納米級(jí)別的金屬銀單質(zhì)，因具有獨(dú)特的化學(xué)穩(wěn)定性、強(qiáng)導(dǎo)電性、高催化性、抗菌、抗病毒和抗蚊蟲等特性，已經(jīng)在農(nóng)業(yè)、生物醫(yī)學(xué)、環(huán)境科學(xué)、光化學(xué)工業(yè)和能源科學(xué)等領(lǐng)域都開展了廣泛研究(Ahmedetal., 2016a; 彭紅等, 2017; Prasadetal., 2017; Shietal., 2017)。AgNPs的制備是納米技術(shù)研究的基礎(chǔ)(Benelli, 2016)。傳統(tǒng)的AgNPs主要通過物理和化學(xué)方法合成，存在高能耗、不穩(wěn)定、步驟繁瑣、使用的溶劑毒性強(qiáng)、污染嚴(yán)重以及對(duì)環(huán)境和非靶標(biāo)生物有潛在危害等弊端(Adaketal., 2021)。利用植物提取液制備AgNPs是利用植物體內(nèi)的生物活性分子進(jìn)行深度組裝，具有成本低廉、綠色無毒、可持續(xù)性好和環(huán)境安全等特點(diǎn)，是AgNPs合成的發(fā)展方向。

白蟻是危害房屋建筑和綠化樹木的重要害蟲，臺(tái)灣乳白蟻Coptotermesformosanus是我國(guó)分布廣泛、危害性較大的白蟻種類之一。利用安全、環(huán)保的藥劑防治白蟻是落實(shí)鄉(xiāng)村振興政策和促進(jìn)美麗中國(guó)建設(shè)的重要舉措。研究發(fā)現(xiàn)，綠色合成的AgNPs對(duì)蚊蟲具有良好的毒殺活性，但其對(duì)白蟻的毒殺效果目前仍不清楚。為了明確AgNPs對(duì)白蟻的防治效果，本實(shí)驗(yàn)以藥用植物大黃Rheumpalmatum、白毛夏枯草Ajuganipponensis、苦參Sophoraflavescens和魚腥草Houttuyniacordata的水提液為生物原料合成AgNPs，測(cè)定分析綠色合成AgNPs對(duì)臺(tái)灣乳白蟻工蟻毒殺效果及其作用機(jī)理，以期為新型高效、綠色安全的納米殺白蟻劑的研發(fā)提供有價(jià)值的參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料和儀器設(shè)備

1.1.1供試植物材料：大黃根莖、白毛夏枯草植株、苦參根和魚腥草植株。

1.1.2供試白蟻：供試白蟻為臺(tái)灣乳白蟻C.formosanus，由全國(guó)白蟻防治中心提供。試驗(yàn)前先將白蟻放在室內(nèi)溫度(27±1)℃、相對(duì)濕度80%±5%的環(huán)境下飼養(yǎng)1周以上，選取大小相近、行動(dòng)活躍的乳白蟻成熟工蟻個(gè)體，稱重并記錄每10頭工蟻的重量。

1.1.3儀器設(shè)備：恒溫干燥箱、40目篩、恒溫水浴鍋、離心機(jī)、真空抽濾機(jī)、冷凍干燥機(jī)、手動(dòng)勻漿器、Cary 60型紫外可見分光光度計(jì)(安捷倫)、NS-90納米粒度分析儀(歐美克)、JEM-1400 Flash透射電子顯微鏡和Gemini SEM 300掃描電子顯微鏡等。

1.2 植物提取物的制備

將植物樣品在80℃高溫烘48 h后研磨過40目篩得到植物粉末。取10 g植物粉末加入到100 mL蒸餾水中，80℃水浴鍋內(nèi)加熱2 h，每隔30 min振蕩一次。室溫下冷卻后，以10 000 r/min轉(zhuǎn)速離心獲得上清液，經(jīng)Whatman No.1濾紙過濾，得到澄清的植物提取液用于AgNPs的合成(Fouadetal., 2018)。

1.3 納米銀粒子的綠色合成

將10 mL植物提取液逐滴加入到90 mL 2 mmol/L硝酸銀溶液中，在80℃恒溫水浴鍋內(nèi)加熱80 min，每隔20 min左右振蕩一次，加熱完畢取出，室溫下冷卻，然后以12 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心15 min，棄上清液，加入蒸餾水以10 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，棄上清液。重復(fù)清洗3次，獲得底部沉淀(Poopathietal., 2015)。將沉淀冷凍干燥分別得到大黃根莖AgNPs(H-NPs)、白毛夏枯草AgNPs(BX-NPs)、苦參根AgNPs(KS-NPs)和魚腥草AgNPs(YX-NPs)粉末，將上述粉末保存在-80℃冰箱內(nèi)用于表征和殺蟲活性測(cè)定。

1.4 納米銀粒子的表征觀測(cè)

1.4.1紫外可見光譜分析：取適量AgNPs粉末溶解于2 mL的蒸餾水中，混合均勻后用于測(cè)定。利用Cary 60紫外可見分光光度計(jì)(UV-Vis)，分析波長(zhǎng)200-800 nm范圍內(nèi)樣品的吸光度，保存光譜中波長(zhǎng)與吸光度的數(shù)據(jù)并利用Origin軟件作圖。

1.4.2掃描電子顯微鏡(SEM)分析：取干燥的AgNPs粉末，均勻涂抹至粘在載盤上的膠帶上，將載盤放于鍍膜機(jī)中噴鍍金膜5 min，以提高樣品的導(dǎo)電性，改善電子圖像的質(zhì)量。最后，樣品上機(jī)抽真空，通過Gemini SEM 300掃描電子顯微鏡觀察AgNPs的表面形態(tài)和聚集程度。

1.4.3透射電子顯微鏡(TEM)分析：取適量AgNPs粉末溶解于2 mL的無水乙醇中，超聲波振蕩分散5 min以充分混勻。然后將樣品滴在覆蓋有支持膜的銅網(wǎng)上，用吸墨紙去除多余的液體，接著將載網(wǎng)置于水銀燈下5 min，待乙醇揮發(fā)完畢，充分干燥后，樣品上機(jī)，通過JEM-1400 Flash透射電子顯微鏡表征AgNPs的結(jié)構(gòu)和粒度。

1.4.4X射線能譜(EDS)分析：Gemini SEM 300掃描電子顯微鏡上配備能譜儀，進(jìn)行元素分析以確保AgNPs的存在。

1.4.5納米粒徑分析：取適量AgNPs粉末溶解于2 mL的蒸餾水中，混合均勻后用于測(cè)定。利用NS-90粒徑儀的動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)測(cè)量粒子大小，測(cè)定工作在25℃下進(jìn)行，每個(gè)樣品重復(fù)3次測(cè)量其流體力學(xué)粒度。

1.5 對(duì)白蟻的毒性測(cè)定

將AgNPs粉末溶解于蒸餾水中，配制成800, 400, 200, 100和50 mg/L 5個(gè)濃度梯度組，蒸餾水做空白對(duì)照組。取φ20 mm的濾紙片在蒸餾水及不同濃度的AgNPs溶液中浸漬10 s，取出晾干形成藥膜，將其置于鋪有2 g細(xì)沙(過40目篩后置烘箱80℃烘48 h)并加水濕潤(rùn)的培養(yǎng)皿(φ60 mm)中央。每個(gè)培養(yǎng)皿中移入50頭健康且大小一致的臺(tái)灣乳白蟻工蟻和2頭兵蟻，每個(gè)濃度處理重復(fù)3次，將培養(yǎng)皿置于恒溫恒濕培養(yǎng)箱內(nèi)[溫度(27±1)℃，相對(duì)濕度80%±5%]飼養(yǎng)觀察，定期滴加適量蒸餾水濕潤(rùn)培養(yǎng)皿內(nèi)細(xì)沙。每隔24 h記錄工蟻死亡數(shù)，連續(xù)7 d，統(tǒng)計(jì)7 d后臺(tái)灣乳白蟻工蟻的累計(jì)死亡率。

1.6 納米銀粒子的殺白蟻?zhàn)饔脵C(jī)制生化指標(biāo)測(cè)定

1.6.1制備蟲體勻漿：采用WHO規(guī)定的流程，經(jīng)過適當(dāng)修改，通過生化試驗(yàn)測(cè)定AgNPs處理7 d后白蟻體內(nèi)的生化組分的變化(WHO, 1998)。取800 mg/L AgNPs處理的臺(tái)灣乳白蟻工蟻(試驗(yàn)組)和蒸餾水處理的臺(tái)灣乳白蟻工蟻(對(duì)照組)各30頭，每次測(cè)定10頭白蟻，每個(gè)處理3次重復(fù)。用蒸餾水洗滌白蟻體表，用紙巾吸去體表水分，將其收集到2 mL離心管中，冰浴勻漿后在4℃ 12 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心，取上清液用于蟲體可溶性蛋白質(zhì)含量、乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase, AchE)活性和濾紙酶活性(filter paper activity, FPA)測(cè)定。

1.6.2可溶性蛋白質(zhì)含量測(cè)定：采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定臺(tái)灣乳白蟻工蟻體內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)含量(劉玉明等, 2013)。分別取試驗(yàn)組和對(duì)照組的蟲體勻漿液分別加入考馬斯亮藍(lán)G250試劑，混勻后，測(cè)定波長(zhǎng)620 nm的吸光值并記錄。

1.6.3AchE活性測(cè)定：AchE可催化乙酰膽堿水解生成膽堿，膽堿與二硫?qū)ο趸郊姿嶙饔蒙傻?-巰基-硝基苯甲酸在412 nm處有最大吸收峰(林建國(guó)等, 2005)。因此，利用分光光度法測(cè)定412 nm處吸光度的增加速率即可計(jì)算出對(duì)照白蟻和處理白蟻蟲體勻漿中的AchE活性。本研究采用蘇州夢(mèng)犀生物醫(yī)藥科技有限公司生產(chǎn)的AchE活性測(cè)定試劑盒測(cè)定樣品3 min內(nèi)吸光值的變化，計(jì)算第190秒和第10秒的吸光值差即為3 min內(nèi)吸光值變化值。

1.6.4FPA測(cè)定：FPA水解濾紙產(chǎn)生的還原糖能與3,5-二硝基水楊酸生成紅棕色氨基化合物，在540 nm處有最大吸收峰，且反應(yīng)液顏色深淺與還原糖的量成正比，利用這一原理可測(cè)定樣品的纖維素酶總活性(或FPA)。本試驗(yàn)采用蘇州夢(mèng)犀生物醫(yī)藥科技有限公司生產(chǎn)的FPA試劑盒進(jìn)行測(cè)定。

1.7 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)對(duì)照組和AgNPs處理組工蟻的累計(jì)死亡率數(shù)據(jù)，利用SPSS軟件的卡方檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性分析，計(jì)算在95%置信區(qū)間的LC50和LC90。分別對(duì)各處理組的3個(gè)生化指標(biāo)進(jìn)行單因素方差分析和LSD法多重比較檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 納米銀粒子的表征

2.1.1紫外可見光譜分析：紫外-可見光譜分析是判斷AgNPs合成的第一步。在本研究中，分別利用大黃根莖、白毛夏枯草全株、苦參根和魚腥草全株的水提取液作為原料，與AgNO3發(fā)生還原反應(yīng)80 min，混合液從最初澄清透明的淡黃色變成深棕褐色。4種AgNPs的紫外-可見光譜圖顯示分別在450, 435, 430和430 nm處出現(xiàn)最大吸收峰，證實(shí)了AgNPs的形成，在400～450 nm左右的表面等離子體共振峰(surface plasmon resonance, SPR)與AgNPs相對(duì)應(yīng)(圖1)。 這與之前報(bào)道的以植物為原料合成AgNPs的最大吸收峰在400～500 nm范圍內(nèi)的結(jié)果(Ahmedetal., 2016b; Rolimetal., 2019)一致。

圖1 植物提取物合成的AgNPs紫外-可見吸收光譜圖Fig.1 Ultraviolet-visible spectra of AgNPs synthesized by plant extractsA: 用大黃根莖水提取物綠色合成的納米銀粒子Green synthesized AgNPs using aqueous extract of Rheum palmatum roots (H-NPs); B: 用白毛夏枯草全株水提取物綠色合成的納米銀粒子Green synthesized AgNPs using aqueous extract of Ajuga nipponensis plants (BX-NPs); C: 用苦參根水提取物綠色合成的納米銀粒子Green synthesized AgNPs using aqueous extract of Sophora flavescens roots (KS-NPs); D: 用魚腥草全株水提取物綠色合成的納米銀粒子Green synthesized AgNPs using aqueous extract of Houttuynia cordata plants (YX-NPs).AgNPs: 納米銀粒子Silver nanoparticles.下同The same below.

2.1.2掃描電子顯微鏡分析：SEM分析的綠色合成AgNPs的結(jié)構(gòu)和尺寸如圖2所示，4種AgNPs多聚集，粒子呈球形。大黃根莖提取物合成的AgNPs (H-NPs)尺寸最大，粒徑在80～180 nm之間，而白毛夏枯草全株提取物合成的AgNPs (BX-NPs)、苦參根提取物合成的AgNPs (KS-NPs)和魚腥草全株提取物合成的AgNPs (YX-NPs)粒子偏小，粒徑大小范圍是50～100 nm。

圖2 植物提取物合成的AgNPs掃描電子顯微鏡圖Fig.2 Scanning electron microscopy (SEM) images of AgNPs synthesized by plant extractsA: H-NPs; B: BX-NPs; C: KS-NPs; D: YX-NPs.

2.1.3透射電子顯微鏡分析：綠色合成AgNPs的典型TEM圖像如圖3所示。這些納米粒子具有面心立方結(jié)構(gòu)，分布相對(duì)均勻。大多呈均勻的球形，符合紫外可見光譜中SPR波段的形狀。其中H-NPs的粒徑明顯大于其他三者的。粒徑在80～180 nm之間，這與利用歐薄荷葉(MubarakAlietal., 2011)和歐洲小檗(Behravanetal., 2019)綠色合成的AgNPs大小相似。

圖3 植物提取物合成的AgNPs透射電子顯微鏡圖Fig.3 Transmission electron microscopy (TEM) images of AgNPs synthesized by plant extractsA: H-NPs; B: BX-NPs; C: KS-NPs; D: YX-NPs.

2.1.4X射線能譜分析：如圖4所示，AgNPs的EDS圖譜均在3 keV處出現(xiàn)強(qiáng)特征峰，表明了Ag+還原成了Ag0。因?yàn)楸砻娴入x子體共振，對(duì)金屬AgNPs的吸收非常理想。除了Ag的強(qiáng)峰以外，包括Cl在內(nèi)的雜峰是因?yàn)楦髦参锾崛∥镏杏衅渌兀诤铣蛇^程中被AgNPs包裹而混雜其中。由于植物的各部分中含有多糖、脂質(zhì)、生物堿、單寧、酚類、皂苷及萜類等化學(xué)成分。這些化學(xué)分子經(jīng)過重組，在納米銀粒子合成中作為還原劑和穩(wěn)定劑，將硝酸銀溶液中的Ag+還原成納米級(jí)別的銀單質(zhì)。根據(jù)目前研究發(fā)現(xiàn)：植物綠色合成的納米銀粒子樣品為混合物，主要包含納米銀粒子(銀單質(zhì))以及覆蓋其表面的單寧、黃酮類和酚類化合物等成分。

圖4 植物提取物合成的AgNPs的X射線能譜圖Fig.4 X-ray energy dispersive spectrum (EDS) images of AgNPs synthesized by plant extractsA: H-NPs; B: BX-NPs; C: KS-NPs; D: YX-NPs.

2.1.5納米粒度分析：利用納米粒度分析儀測(cè)量得到的4種AgNPs粒度分布如圖5所示。與SEM和TEM分析的結(jié)果相一致，H-NPs粒徑大多分布在100～200 nm之間，流體力學(xué)平均為179 nm；BX-NPs粒徑在10～100 nm之間，平均為72 nm；KS-NPs和YX-NPs粒徑分布相一致，粒徑較小，平均約為69 nm。4種植物提取物合成的AgNPs粒子大小分布相對(duì)集中，說明粒子大小相對(duì)均勻。本研究通過SEM、TEM和粒度分析發(fā)現(xiàn)，4種藥用植物提取物合成的AgNPs粒子大小均勻，粒徑在69～180 nm之間，粒子多呈球形，說明本研究合成的AgNPs符合標(biāo)準(zhǔn)，可用于臺(tái)灣乳白蟻的毒殺作用測(cè)定。

圖5 植物提取物合成的AgNPs粒度分布圖Fig.5 The particle size distribution maps of AgNPs synthesized by plant extractsA: H-NPs; B: BX-NPs; C: KS-NPs; D: YX-NPs.

2.2 綠色合成納米銀粒子對(duì)臺(tái)灣乳白蟻工蟻的毒殺活性

研究結(jié)果表明, 不同濃度AgNPs處理7 d內(nèi)，隨著AgNPs濃度升高，臺(tái)灣乳白蟻工蟻的累積死亡率均逐漸升高，呈現(xiàn)出劑量依賴現(xiàn)象。SPSS數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示AgNPs濃度與臺(tái)灣乳白蟻工蟻死亡率之間呈線性相關(guān)關(guān)系，H-NPs, BX-NPs, KS-NPs和YX-NPs對(duì)臺(tái)灣乳白蟻工蟻的LC50值分別為150, 340, 342和309 mg/L，LSD卡方檢驗(yàn)達(dá)顯著水平(P<0.05)，說明數(shù)據(jù)的擬合優(yōu)度良好(表1)。

研究結(jié)果顯示，AgNPs處理7 d后，臺(tái)灣乳白蟻成熟工蟻死亡率最低為88%(KS-NPs)，最高為100%(H-NPs)，而最低濃度50 mg/L處理下，各組白蟻的死亡率也近10%。并且4組AgNPs對(duì)工蟻的LC50值均較小，最小的H-NPs為150 mg/L，最大的KS-NPs僅為342 mg/L(表1)，表明AgNPs在較低濃度處理下，較短的時(shí)間內(nèi)就對(duì)臺(tái)灣乳白蟻工蟻具有較好的毒殺活性。

表1 4種植物提取物合成的納米銀粒子處理7 d內(nèi)對(duì)臺(tái)灣乳白蟻成熟工蟻的毒性Table 1 Toxicity of AgNPs synthesized by four plant extracts to adult workers of Coptotermes formosanus in 7 d

2.3 綠色合成納米銀粒子毒殺臺(tái)灣乳白蟻的作用機(jī)制

圖6表明，800 mg/L 4種AgNPs處理7 d后，臺(tái)灣乳白蟻工蟻體內(nèi)的可溶性蛋白質(zhì)含量以及AchE活性和FPA較對(duì)照均顯著降低。其中，經(jīng)H-NPs處理后的白蟻，其可溶性蛋白質(zhì)含量從210 mg/L降低至120 mg/L，這說明AgNPs對(duì)臺(tái)灣乳白蟻體內(nèi)蛋白質(zhì)的合成具有一定抑制作用。而AchE活性從313.16 nmol/min·g FW降低至46.25 nmol/min·g FW，表明AgNPs通過改變臺(tái)灣乳白蟻體內(nèi)AchE活性造成蟲體神經(jīng)中毒，引發(fā)功能失調(diào)死亡。FPA代表的是纖維素綜合酶活性。AgNPs處理的臺(tái)灣乳白蟻，其FPA顯著低于對(duì)照，說明AgNPs處理后，臺(tái)灣乳白蟻的纖維素綜合酶活性均顯著降低。鑒于臺(tái)灣乳白蟻主要利用纖維素類物質(zhì)作為其食物，體內(nèi)的纖維素綜合酶活性顯著降低，會(huì)影響其食物消化和利用，這可能也是AgNPs導(dǎo)致臺(tái)灣乳白蟻死亡的重要原因之一。

圖6 800 mg/L AgNPs處理7 d對(duì)臺(tái)灣乳白蟻成熟工蟻體內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)含量(A)、乙酰膽堿酯酶活性(B)和濾紙酶活性(C)的影響Fig.6 Effect of 800 mg/L AgNPs on the soluble protein content (A), AchE activity (B) and filter paper activity (FPA) (C)in adult workers of Coptotermes formosanus at 7 d after treatment以蒸餾水飼喂組白蟻為對(duì)照組(CK)。圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤; 柱上不同字母表示經(jīng)LSD法多重比較檢驗(yàn)差異顯著(P<0.05)。Termites fed with distilled water were used as the control (CK).Data in the figure are mean±SE.Different letters above bars indicate significant difference by LSD test (P<0.05).

3 討論

AgNPs廣泛應(yīng)用于傷口敷料、外用藥膏、抗菌噴劑和抗菌織物等中(Slavinetal., 2017)。利用植物原料綠色合成AgNPs，具有高效、操作簡(jiǎn)便、成本低廉和綠色安全的特點(diǎn)，也是開發(fā)新型抗菌劑和殺蟲劑的重要手段(Raietal., 2009; Benellietal., 2018)。AgNPs的大小和形狀直接影響其作用，粒徑小、均勻、呈球形的AgNPs在抗病毒、抗菌、抗氧化、生物催化以及對(duì)病媒控制方面都發(fā)揮著重要作用(Azizetal., 2019)。

本研究以4種藥用植物為原料綠色合成AgNPs，通過UV-vis, SEM, TEM, EDS和納米粒度分析等方式對(duì)合成的AgNPs進(jìn)行驗(yàn)證，并表征了AgNPs的粒徑大小、形狀、聚集程度以及元素組成等特性，發(fā)現(xiàn)在室內(nèi)條件下，較低濃度的AgNPs對(duì)臺(tái)灣乳白蟻就具有較高的毒性，且AgNPs處理后白蟻體內(nèi)的可溶性蛋白質(zhì)含量、AchE活性和FPA均顯著降低，說明AgNPs影響了臺(tái)灣乳白蟻體內(nèi)蛋白質(zhì)的合成、正常的神經(jīng)傳導(dǎo)和消化利用纖維素的能力。因此，利用植物水提物綠色合成AgNPs有望為白蟻的綜合治理提供新的手段。但是如若要實(shí)際應(yīng)用，迫切需要在以下幾個(gè)方面進(jìn)行更深層次的研究：

(1)AgNPs和其他納米顆粒在害蟲的防治效果上的比較。基于最近研究，植物合成的納米顆粒對(duì)包括蚊子、甲蟲、蛾子、蜱螨虱等重要經(jīng)濟(jì)害蟲顯示出了一定的防治效果，其中綠色合成AgNPs的研究最為深入，關(guān)于其他納米顆粒的害蟲防治方面的相關(guān)文獻(xiàn)甚少，且缺乏不同納米顆粒對(duì)同一種害蟲的毒性研究，無法進(jìn)行數(shù)據(jù)對(duì)比。因此，后續(xù)應(yīng)在綠色合成不同NPs的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步檢測(cè)它們對(duì)同一種害蟲的毒性作用，從而針對(duì)性篩選出對(duì)目標(biāo)害蟲效果最顯著、成本最低廉的綠色納米顆粒。

(2)拓寬AgNPs毒性研究對(duì)象范圍。學(xué)者利用細(xì)菌、真菌和植物制備的AgNPs，在較低濃度下對(duì)白紋伊蚊Aedesalbopictus、斯氏按蚊Anophelesstephensi、三帶喙庫蚊Culextritaeniorhynchus和庫態(tài)按蚊Anophelesculicifacies等的幼蟲和蛹具有較高的毒性(Amerasanetal., 2016; Govindarajanetal., 2016; Kumaretal., 2018)。如今，AgNPs在蚊媒控制方面的潛力已被廣泛認(rèn)知， 然而有關(guān)農(nóng)業(yè)和城市害蟲的研究卻屈指可數(shù)。相比于傳統(tǒng)殺蟲劑，綠色AgNPs毒性作用顯著、使用劑量低且綠色環(huán)保，顯示綠色合成的AgNPs具有廣闊的應(yīng)用前景。因此， 后續(xù)應(yīng)加強(qiáng)其他媒介害蟲、農(nóng)業(yè)和城市害蟲的毒性測(cè)定，拓寬研究范圍。

(3)AgNPs對(duì)非靶標(biāo)生物和生態(tài)環(huán)境的影響。AgNPs在體內(nèi)的評(píng)估顯示出高度生物相容性，對(duì)細(xì)胞活力、免疫功能等生長(zhǎng)發(fā)育方面的負(fù)面影響較小。但是以上僅局限于實(shí)驗(yàn)室研究的初步結(jié)論，缺少在實(shí)際應(yīng)用中的評(píng)估，所以在納米農(nóng)藥釋放到土壤中是否會(huì)對(duì)微生物和非靶標(biāo)生物造成一定影響的研究上存在一定爭(zhēng)議，但多數(shù)研究認(rèn)為低劑量存在不會(huì)影響到生物的生長(zhǎng)。另外，在水環(huán)境中的魚類會(huì)生物累積水環(huán)境中的微量污染物，那么AgNPs的潛在釋放可能通過食用魚類危害人類健康，并且影響生態(tài)環(huán)境。但是目前對(duì)于AgNPs使用后與生態(tài)系統(tǒng)的相互作用關(guān)系還不清楚。因此，拓展AgNPs農(nóng)藥實(shí)際使用后的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，將對(duì)評(píng)估AgNPs相關(guān)的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)等起到重要作用。

(4)AgNPs工業(yè)化生產(chǎn)面臨的挑戰(zhàn)。首先，植物源合成的AgNPs的粒徑和形狀決定其對(duì)害蟲的防治效果，因此規(guī)范統(tǒng)一化的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)減少副產(chǎn)物生成、提高AgNPs產(chǎn)量將是工業(yè)化生產(chǎn)的第一大挑戰(zhàn)。其次，粉末劑型的穩(wěn)定性高于其他劑型，而實(shí)際使用時(shí)更傾向于液體配方。因此，提高固體AgNPs農(nóng)藥的持久性和穩(wěn)定性將成為又一挑戰(zhàn)。最后，進(jìn)一步研究開發(fā)納米農(nóng)藥的安全簡(jiǎn)便的應(yīng)用技術(shù)、可獲得性等也是一大難題。