膽道閉鎖肝臟不同病理分期的免疫微環(huán)境研究①

張昊東 康 權(quán) （重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院渝中院區(qū)普外科，國家兒童健康與疾病臨床研究中心，兒童發(fā)育與疾病教育部重點實驗室，重慶市干細(xì)胞治療工程技術(shù)研究中心，重慶 400014）

膽道閉鎖（biliary atresia，BA）是一種嚴(yán)重的新生兒疾病，表現(xiàn)為進(jìn)行性炎癥和纖維化阻塞肝內(nèi)和肝外膽管，如不經(jīng)治療大部分患兒2 歲內(nèi)會因進(jìn)行性纖維化肝衰竭而死亡，進(jìn)行葛西手術(shù)后約一半患兒仍伴有進(jìn)行性肝纖維化，但經(jīng)過肝移植手術(shù)后大部分患兒可存活至成年［1-2］。

基于目前研究，無論是哪種因素誘發(fā)的BA，均會激活BA 先天性及適應(yīng)性免疫應(yīng)答，且均支持炎癥反應(yīng)促進(jìn)膽管損傷［3］。已有多個研究將病理組織學(xué)和臨床信息及預(yù)后聯(lián)系起來，提示兒童預(yù)后不良或與纖維化有關(guān)［4-5］。

盡管免疫細(xì)胞及免疫相關(guān)細(xì)胞因子或趨化因子、細(xì)胞因子受體在BA 發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，如樹突狀細(xì)胞、NK 細(xì)胞以及CD4/CD8 在診斷時位于嬰兒肝臟中，直接參與上皮破壞和促進(jìn)適應(yīng)性炎癥反應(yīng)發(fā)展，并與過度表達(dá)的活化標(biāo)志物有關(guān)［5］。體外 T 細(xì)胞研究表明，BA 患者 CD4+和 CD8+T 細(xì)胞具有寡克隆擴(kuò)增功能［6］。但尚無系統(tǒng)研究分析BA 不同病理分期的免疫細(xì)胞浸潤情況，以及免疫相關(guān)基因和分子通路表達(dá)差異。因此，本研究擬評估BA不同病理分期中的免疫相關(guān)基因，以及浸潤免疫細(xì)胞和途徑激活水平差異。

1 材料與方法

1.1 材料 從NCBI基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫（GEO）下載GSE15235 芯片數(shù)據(jù)集。GSE15235 表達(dá)數(shù)據(jù)以GPL570 相應(yīng)探針注釋。該數(shù)據(jù)集包含47 個有病理臨床信息的BA 樣本，選取其中組織學(xué)評分≥2 分的14 個主要為炎癥（n=9）和纖維化（n=5）的樣本進(jìn)行分析。從 ImmPort（https：//www. immport. org/home）數(shù)據(jù)庫下載得到2 498個免疫相關(guān)基因。

1.2 方法

1.2.1 數(shù)據(jù)預(yù)處理及基因差異分析 采用R 軟件包limma 對芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，差異基因的篩選截斷值設(shè)為|log2FC|＞1，P＜0.05，并與 ImmPort下載的免疫相關(guān)基因取交集得到免疫相關(guān)差異基因（趨化因子、細(xì)胞因子及細(xì)胞因子受體等）。

1.2.2 免疫細(xì)胞評估 采用ImmuCellAI 在線網(wǎng)站分析芯片數(shù)據(jù)，包括18 個T-細(xì)胞亞群的24 種免疫細(xì)胞豐度。

1.2.3 基因富集分析 采用clusterProfiler 軟件包進(jìn)行富集分析，富集分析基于GO和KEGG數(shù)據(jù)庫注釋基因表達(dá)數(shù)據(jù)，以P＜0.05為顯著富集的臨界值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用Mann-WhitneyU檢驗比較不同組免疫細(xì)胞豐度。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。所有統(tǒng)計檢驗均為雙側(cè)檢驗，所有統(tǒng)計測試和可視化分析均采用R軟件（3.6.3版本）完成。

2 結(jié)果

2.1 免疫相關(guān)基因表達(dá) 通過差異分析得到91個差異基因，其中40個炎癥組上調(diào)，51個纖維組上調(diào)，并將包含于ImmPort 數(shù)據(jù)庫中的免疫相關(guān)基因用熱圖表示（圖1）。包含13 個免疫相關(guān)基因MMP9、IL1RL1、RASGRP1、MPO、CCL20、SEMA6A、CXCL11、PTX3、HSPA6、CTSG、RNASE3、GREM1 和 CD8A，表達(dá)情況見表1。KEGG 富集分析顯示免疫相關(guān)差異基因主要富集于細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用通路（圖2A），GO 富集分析顯示免疫相關(guān)差異基因主要參與的分子生物學(xué)過程包括抗菌體液反應(yīng)、對真菌、細(xì)胞外基質(zhì)的組織、對細(xì)菌的防御反應(yīng)、細(xì)胞外結(jié)構(gòu)組織中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答、中性粒細(xì)胞激活、中性粒細(xì)胞激活參與免疫應(yīng)答及嗜中性粒細(xì)胞脫顆粒過程等（圖2B）。

圖2 免疫相關(guān)差異基因的KEGG和GO富集分析Fig.2 KEGG and GO enrichment analysis of immune-related differentially expressed genes

表1 免疫相關(guān)差異表達(dá)基因Tab.1 Immune-related differentially expressed genes

圖1 BA炎癥組和纖維化組差異表達(dá)基因Fig.1 Differentially expressed genes between inflammatory group and fibrotic group in BA

2.2 免疫細(xì)胞表達(dá) 通過ImmuCellAI 在線工具評估GSE15235數(shù)據(jù)集的14個包含病理分級的肝臟樣本（5 個主要表現(xiàn)為炎癥和9 個主要表現(xiàn)為纖維化）的24 種免疫細(xì)胞豐度（圖3A）。肝纖維化組中顯示nTreg 及iTreg 呈高表達(dá)，NKT 細(xì)胞及中性粒細(xì)胞呈低表達(dá)（圖3B）。

圖3 BA中24種免疫細(xì)胞豐度Fig.3 Abundance of 24 types of immune cells in BA

2.3 基因集富集分析 根據(jù)BA 不同分期組基因表達(dá)GSEA 結(jié)果，發(fā)現(xiàn)通過KEGG 注釋的通路中炎癥組，如ErbB 信號途徑、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用及代謝相關(guān)途徑被顯著激活。纖維化組主要激活的途徑有ABC轉(zhuǎn)運蛋白、維生素A新陳代謝、藥物代謝-細(xì)胞色素P450、其他類型O-聚糖生物合成及EGFR 酪氨酸激酶抑制劑耐藥等途徑（圖4A）。GO數(shù)據(jù)庫注釋的分子生物學(xué)過程顯示炎癥組富集的主要為白細(xì)胞聚集、白細(xì)胞遷移參與炎癥反應(yīng)及黏膜先天免疫應(yīng)答過程等，而纖維化組主要富集于T細(xì)胞受體復(fù)合物、T 細(xì)胞趨化調(diào)節(jié)、調(diào)控趨化因子介導(dǎo)的信號通路、干擾素分泌調(diào)節(jié)、賦予抗拉強(qiáng)度的細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)成分及膠原蛋白-激活信號等過程（圖4B）。

圖4 基因集富集分析Fig.4 Gene sets enrichment analysis

3 討論

本研究旨在探討B(tài)A 肝臟不同病理分期的免疫微環(huán)境差異。通過差異分析得到13個免疫相關(guān)差異基因，MMP9、IL1RL1、MPO、CCL20、PTX3、HSPA6、CTSG和RNASE3主要在炎癥組中高表達(dá)，RASGRP1、SEMA6A、CXCL11、GREM1 和 CD8A 主要在纖維化組中高表達(dá)。KEGG 富集分析顯示免疫相關(guān)差異基因主要富集于細(xì)胞因子受體相互作用通路，GO 富集分析顯示免疫相關(guān)差異基因主要參與的分子生物學(xué)過程包括抗菌體液反應(yīng)、細(xì)胞外基質(zhì)的組織、對細(xì)菌的防御反應(yīng)、細(xì)胞外結(jié)構(gòu)組織中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答、中性粒細(xì)胞激活、中性粒細(xì)胞激活參與免疫反應(yīng)及嗜中性粒細(xì)胞脫顆粒過程。Immu-CellAI 分析提示肝纖維化組中nTreg 及iTreg 呈高表達(dá)，NKT 細(xì)胞及中性粒細(xì)胞在炎癥組中高表達(dá)。GSEA 分析顯示炎癥組主要激活代謝及細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)類分子途徑等，纖維化組主要激活細(xì)胞基質(zhì)及T細(xì)胞介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫應(yīng)答相關(guān)分子途徑。

免疫相關(guān)細(xì)胞因子、趨化因子和受體與促炎纖維化信號的觸發(fā)和放大密切相關(guān)，如小鼠BA 模型中IL-1R1或NLRP3靶向損失，可保護(hù)新生小鼠免受RRV 誘導(dǎo)的膽管阻塞［7］；基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）家族廣泛參與炎癥過程，MMP9 可防止LPS 誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞炎癥及可限制結(jié)腸炎相關(guān)癌癥中的活性氧積累和DNA損傷［8-9］；髓過氧化物酶是白細(xì)胞分泌的一種高度氧化酶，與人類和實驗性非酒精性脂肪性肝炎有關(guān)，且在機(jī)制上還與房顫和纖維化有關(guān)［10-12］；一項研究發(fā)現(xiàn)隨著肝病患者肝纖維化程度增加，CXCL11 水平升高［13］；還有研究表明CXCL11 通過改變異常的血管重塑抑制肺纖維化［14］。表明免疫相關(guān)基因在炎癥期或纖維化期發(fā)揮重要作用。

BA 患兒診斷時肝臟有多種免疫細(xì)胞（CD4+細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞、NK 細(xì)胞及 DC 細(xì)胞）和促炎細(xì)胞因子（細(xì)胞因子、趨化因子和白細(xì)胞介素等）浸潤。Treg 作為一種調(diào)劑免疫耐受的細(xì)胞，在調(diào)控免疫細(xì)胞，如CD8 細(xì)胞、NK 細(xì)胞及Th1 細(xì)胞功能上發(fā)揮重要作用，其數(shù)量或功能缺陷會導(dǎo)致T 細(xì)胞介導(dǎo)自身免疫應(yīng)答加重膽管損傷［15-20］。本研究發(fā)現(xiàn)nTreg 和iTreg 在BA 肝纖維組中表達(dá)高于炎癥組，與既往實驗性BA 研究結(jié)論一致。RRV 感染后小鼠BA 模型的細(xì)胞行為表明，當(dāng)小鼠在7 d 的生命中膽管損傷時，肝Treg 迅速增加10 倍，但在第1 天注射時未觀察到這種增加［20］?？赡芘c炎癥早期Treg 數(shù)量和功能不足導(dǎo)致無法控制炎癥破壞膽管有關(guān)。NKT 細(xì)胞在炎癥組中表達(dá)高于纖維化組，炎癥早期NKT 細(xì)胞作為先天性免疫應(yīng)答細(xì)胞迅速參與炎癥反應(yīng)，纖維化期Treg 增加受抑制后活性降低［20］。肝臟炎癥典型特征為重新募集主要由單核細(xì)胞、早期活化的促炎巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和NK 細(xì)胞組成的炎癥細(xì)胞庫，以上細(xì)胞損害肝血管結(jié)構(gòu)和功能，這些先天性免疫細(xì)胞首先被激活募集至肝臟損傷膽管細(xì)胞［21］。也有研究顯示嗜中性粒細(xì)胞可促進(jìn)肝臟炎癥和纖維化自發(fā)消退［22］。目前針對以上免疫細(xì)胞在BA中的具體作用機(jī)制尚不清楚。

本研究描繪了BA 發(fā)展免疫微環(huán)境的變化，但具有一定局限性，首先，本研究僅揭示了不同病理分期BA 肝臟免疫微環(huán)境，無法在單細(xì)胞水平反映類型和狀態(tài)，更為先進(jìn)的單細(xì)胞RNA 測序可揭示各獨立細(xì)胞的特異性。其次，本研究包括BA 肝臟樣本數(shù)較少，本身BA 肝臟炎癥和纖維化病理分期界限較為主觀，因此在評估BA 肝臟進(jìn)展中的免疫微環(huán)境方面可能存在偏差。最后，需進(jìn)行動物和實驗室實驗進(jìn)一步闡明免疫微環(huán)境在BA 發(fā)病及發(fā)展機(jī)制中的作用。

總之，本研究評估了BA 不同病理期浸潤的免疫相關(guān)基因、免疫細(xì)胞及分子途徑激活水平，有助于闡明BA發(fā)病機(jī)制，為BA治療提供新的方向。