阿薩爾基亞芽孢桿菌對大麗輪枝菌微菌核的抑制作用

高 暢,劉桂敏,曾 紅,2

(1.塔里木大學 生命科學學院， 新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團塔里木盆地生物資源保護利用重點實驗室，新疆阿拉爾 843300；2.塔里木大學 生命科學學院，新疆阿拉爾 843300)

棉花黃萎病主要是由大麗輪枝菌(VerticilliumdahliaeKleb)引起的一種土傳性植物病害，造成棉花等經(jīng)濟作物產(chǎn)量質(zhì)量下降，經(jīng)濟損失嚴重。新疆是中國最大的棉產(chǎn)基地之一[1]，近年來，棉花黃萎病在新疆地區(qū)危害日益加重，2000年，農(nóng)5師0.67hm2棉田發(fā)病嚴重，發(fā)病率占總棉田的25%。棉花黃萎病在新疆主要植棉地區(qū)普遍發(fā)生，中度及以上病田占比達48.1%，嚴重發(fā)生病田占比為24.1%[2]，危害嚴重，已成為阻礙新疆棉花生產(chǎn)可持續(xù)發(fā)展的主要障礙之一，而防治棉花黃萎病的生物菌劑有限，所以篩選棉花黃萎病高效拮抗菌株，研究其防病效果及機制對于棉花黃萎病的生物防治具有重要意義。

棉花黃萎病難以防治的根源是大麗輪枝菌的休眠體微菌核(microsclerotia，ms)具有耐寒耐旱等抗逆特性[3]，可以在土壤中存活10a之久[4]。國內(nèi)外關(guān)于棉花黃萎病防治采取的措施主要有抗性品種選育、改善栽培措施、施用化學農(nóng)藥等[5]。多菌靈、高錳酸鉀、咪鮮胺是常用的防治棉花黃萎病的化學農(nóng)藥，能迅速抑制或殺死病原菌，但對土壤和宿主植物破壞性強。以甲基溴作為殺菌劑，利用煙熏法殺死微菌核[6]，僅能緩解棉田地表病害，對于棉花黃萎病土傳性病害防效有限，長期使用造成致病菌產(chǎn)生耐藥性，不能有效抑制土壤中微菌核含量，且對環(huán)境污染嚴重，因此甲基溴逐漸被淘汰。傳統(tǒng)化學農(nóng)藥難以控制微菌核，而生物防治作為一種環(huán)境友好型的方法則可以有效抑制微菌核的存活，降低其致病活性或抑制萌發(fā)，大量研究表明采用生物防治大麗輪枝菌是十分理想的選擇。2004年Tjamos等[7]報道過一種植物根系促生細菌PaenibacillusalveiK165作為生物控制調(diào)節(jié)體(BCAS)殺死V.dahliae；2012年薛磊等[8]篩選出6株拮抗性鏈霉菌，通過離體試驗利用其發(fā)酵液作用于大麗輪枝菌，結(jié)果表明6株拮抗菌的發(fā)酵液均對大麗輪枝菌微菌核有一定抑制作用，其中B49抑菌效果最好，其抑菌率高達69.70%；2020年張向月等[9]發(fā)現(xiàn)枝頂孢霉屬內(nèi)生真菌CEF-193對大麗輪枝菌生長及微菌核形成均有抑制作用。因此，可以通過微生物菌劑抑制大麗輪枝菌微菌核萌發(fā)，保障棉花增產(chǎn)、增收，實現(xiàn)棉花產(chǎn)業(yè)持續(xù)發(fā)展。

新疆棉區(qū)以連作為主，導致土壤微環(huán)境很難被改善，微菌核長期存活土壤中，使得黃萎病害日趨嚴重，同時缺乏有效防治棉花黃萎病的生物菌劑。在前期工作中從新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團第1師12團連作棉田篩選出一株對棉花黃萎病有明顯抑制效果的拮抗菌株，通過形態(tài)鑒定、生理生化試驗、16S rDNA和gyrB基因序列分析，確定該菌株為TUBP1(Bacillusaxarquiensis)，利用生長速率法和牛津杯法在離體條件下測定拮抗菌株TUBP1發(fā)酵液對棉花黃萎病菌抑菌活性，盆栽試驗和小區(qū)生防試驗結(jié)果均證明B.axarquiensis對棉花黃萎病生防效果顯著[10]。后期又研究TUBP1對大麗輪枝菌拮抗活性，結(jié)果表明該菌株活性成分為蛋白，此類蛋白能夠破壞大麗輪枝菌細胞膜，從而進入細胞引起線粒體細胞膜電位極化，促使其活性氧增加，破壞大麗輪枝菌細胞造成細胞凋亡[11]；用TUBP1蛋白處理的大麗輪枝菌其孢子和菌絲出現(xiàn)凹陷萎縮[12]。本研究通過菌核萌發(fā)、共培養(yǎng)試驗及盆栽試驗檢測TUBP1發(fā)酵液對微菌核的抑制作用，為研制和開發(fā)棉花黃萎病有效生防菌劑提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

病原菌菌株：大麗輪枝菌VerticilliumdahliaeATCC36211。

生防細菌菌株：BacillusaxarquiensisTUBP1，由塔里木盆地生物資源保護利用重點實驗室提供，分離于新疆第1師12團棉田土壤。

1.2 試劑及材料

抗生素(青霉素鈉溶液與硫酸慶大霉素混合)、棉花種子、PMMA觀察箱、營養(yǎng)土。

PDA培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200 g，葡萄糖 20 g，瓊脂20 g，水定容至1 000 mL。

Czapek-Dox培養(yǎng)基：蔗糖30 g，NaNO32 g，K2HPO41.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KCl 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.1 g，水定容至1 000 mL，pH 7.0～7.2。

NB培養(yǎng)基:葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，牛肉膏5 g/L，pH 7.0。

1.3 試驗方法

1.3.1 制備大麗輪枝菌微菌核懸浮液及TUBP1無菌發(fā)酵液 將PDA平板中活化好的V.dahliae打成7 mm的菌餅(2～3個)，接種到100 mL Czapek-Dox培養(yǎng)液中，每瓶培養(yǎng)液加入100 μL(0.05 g/L)抗生素，120 r/min、22 ℃培養(yǎng)3周，離心收集微菌核，無菌水重懸，重復3次，收集微菌核懸浮液置，4 ℃下保存，備用。

TUBP1接種到NB培養(yǎng)液中，180 r/min、 37 ℃培養(yǎng)48 h，離心收集上清液，0.22 μm微孔濾膜過濾2～3次，將無菌發(fā)酵液置于4 ℃下保存，備用[13]。

1.3.2 TUBP1發(fā)酵液活性測定 處理組(TM)：100 mL滅菌后PDA培養(yǎng)基冷卻至45 ℃左右，分別取原濃度、5倍和10倍稀釋后的TUBP1發(fā)酵液25 mL加入 PDA平板中。對照組(CK)：以等量無菌水代替處理組混合液中的發(fā)酵液，震蕩混勻后倒板，得到對照組和處理組PDA平板。平板凝固12 h，取100 μL微菌核懸浮液均勻涂板，室溫培養(yǎng)，每隔12 h觀察微菌核萌發(fā)情況。

分別取上述對照組、處理組PDA平板，平板中央接入大麗輪枝菌菌餅，每隔5 d觀察大麗輪枝菌生長狀態(tài)，十字交叉法測量不同處理下菌落大小，根據(jù)菌落直徑計算發(fā)酵液抑菌率( inhibition rate，IR) ，抑菌率=(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/(對照菌落直徑-7 )×100%。

1.3.3 掃描電鏡觀察TUBP1與大麗輪枝菌共培養(yǎng)對其形態(tài)影響 取TUBP1無菌發(fā)酵液與大麗輪枝菌共培養(yǎng)5 d、10 d、15 d菌體，參考電鏡樣品處理步驟[14]進行前處理，電鏡觀察。

1.3.4 盆栽試驗檢測微菌核萌發(fā)率 10 cm×10 cm(口徑×高度)育苗袋育苗，自然土和營養(yǎng)土(含泥炭、椰糠、珍珠巖、蛭石、復合花肥等)按比例(1∶1)制成混合土壤，播種后保持土壤濕度，使種子有充足水分萌發(fā)。培養(yǎng)3周的棉苗移栽到PMMA觀察箱(15 cm×15 cm×25 cm，L×W×H),每箱1株棉苗，設(shè)置對照組(CK)、處理組(TM)各5組。箱正面透明可活動的標為A面，箱底有孔保持水分流通，土壤同樣采用育苗時的比例。10 d后棉苗恢復活性，處理組用TUBP1發(fā)酵液澆灌棉苗(每箱100 mL)，對照組用等量無菌水澆灌，每隔2 d，重復以上操作。5 d后將微菌核菌懸液加入0.75%瓊脂液中(溫度控制在 45 ℃左右防治破壞微菌核活性)，用磁力攪拌器混勻后倒至A面，凝固后取出，在室內(nèi)晾置24 h，多余水分蒸發(fā)使瓊脂層變成薄層，將A面組裝回箱子。10 d后顯微鏡觀察，微菌核的萌發(fā)數(shù)設(shè)為x未萌發(fā)數(shù)設(shè)為y，分別在A面根尖區(qū)域抽樣，樣方為20 cm2。

相對抑制率=

2 結(jié)果與分析

2.1 TUBP1對大麗輪枝菌微菌核萌發(fā)及形態(tài)的影響

微菌核萌發(fā)隨時間不斷增加，前12 h CK組和TM組均無明顯變化，24 h時開始萌發(fā)，待 72 h CK組微菌核萌發(fā)率達到85.49%，TM組原發(fā)酵液處理的微菌核萌發(fā)率為62.52%(圖1-A)，5倍和10倍稀釋發(fā)酵液的微菌核萌發(fā)率分別為70.10%(圖1-B)、75.33%(圖1-C)。

CK、TM分別指對照組和處理組；A.TUBP1原發(fā)酵液；B.TUBP1發(fā)酵液5倍稀釋；C.TUBP1發(fā)酵液10倍稀釋

2.2 TUBP1對大麗輪枝菌的形態(tài)影響

培養(yǎng)15 d后，與對照組相比，處理組菌絲生長旺盛且原濃度發(fā)酵液共培養(yǎng)的大麗輪枝菌菌絲較發(fā)達。施加原濃度發(fā)酵液共培養(yǎng)10 d大麗輪枝菌菌落不產(chǎn)微菌核(圖2-B)，共培養(yǎng)15 d時菌落邊緣有極少微菌核產(chǎn)生(圖2-C)，由原來的菌核型轉(zhuǎn)變成菌絲型。3個不同培養(yǎng)時期，處理組菌落直徑隨TUBP1發(fā)酵液濃度增加逐漸降低且始終小于對照組(圖2-D)。

A～C.TUPB1發(fā)酵液與大麗輪枝菌共培養(yǎng)5～15 d菌落形態(tài)，D.不同處理菌落直徑測量；A～D.CK為對照，TM-1表示原濃度發(fā)酵液、TM-2和TM-3表示5倍和10倍稀釋發(fā)酵液，下同

2.3 TUBP1發(fā)酵液對大麗輪枝菌抑菌效果

TUBP1不同稀釋濃度發(fā)酵液對大麗輪枝菌生長均有抑制作用，不同處理抑制率差異顯著(表1)；原濃度發(fā)酵液抑菌效果較好，共培養(yǎng)15 d，其抑菌率達到64.69%；5、10倍稀釋發(fā)酵液，共培養(yǎng)5 d、10 d、15 d二者抑菌率均低于原濃度 TUBP1發(fā)酵液。

表1 TUBP1不同濃度發(fā)酵液對大麗輪枝菌抑菌率Table 1 Inhibition rate of TUBP1 against Verticillium dahliae

2.4 掃描電鏡觀察TUBP1發(fā)酵液對大麗輪枝菌形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

通過掃描電鏡觀察(圖3)，施加不同濃度TUBP1發(fā)酵液對大麗輪枝菌表型均有影響。分生孢子及微菌核形成減少，且隨培養(yǎng)時間延長菌絲發(fā)生膨脹、斷裂，出現(xiàn)異型，大麗輪枝菌自身形態(tài)結(jié)構(gòu)被破壞，說明該生防菌株TUBP1對棉花黃萎病菌有較顯著的抑制效果。

CK表示對照；C為分生孢子；H代表菌絲；M為微菌核；①菌絲膨脹；②菌絲破裂；③菌絲腫脹；比例尺=30 μm

2.5 盆栽試驗中TUBP1發(fā)酵液對微菌核的抑制作用

盆栽試驗結(jié)果(表2)表明，處理組的萌發(fā)率低于對照組，相對抑制率為38.95%，表明TUBP1發(fā)酵液對微菌核的萌發(fā)有較好的抑制 作用。

表2 TUBP1發(fā)酵液對棉花黃萎病菌微菌核萌發(fā)的抑制Table 2 Inhibition of TUBP1 on sclerotia germination of Verticillium dahliae

3 討 論

在國家要求“化肥、農(nóng)藥雙減”的背景下生物菌劑在抑制植物病害方面作用日益突出，芽孢桿菌作為一類抗逆性極強的生防菌，可抑制多種植物病原菌。目前已有許多研究將芽孢桿菌與殺菌劑復配，包括枯草芽孢桿菌、多粘芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌等多個種屬，經(jīng)過驗證能成功防治多種植物病害[15]。

在本研究中，阿薩爾基亞芽孢桿菌發(fā)酵液可通過抑制大麗輪枝菌微菌核的形成控制病原菌生長繁殖，降低棉花黃萎病發(fā)病率。試驗表明，阿薩爾基亞芽孢桿菌發(fā)酵液在離體、盆栽試驗檢測中對大麗輪枝菌微菌核萌發(fā)具有較強抑制作用。不同培養(yǎng)時期，阿薩爾基亞芽孢桿菌發(fā)酵液均對大麗輪枝菌形態(tài)及菌核萌發(fā)有影響。其中原濃度發(fā)酵液抑菌作用最強；共培養(yǎng)15 d，大麗輪枝菌由菌核型向菌絲型轉(zhuǎn)變，其抑菌率達64.69%，說明阿薩爾基亞芽孢桿菌發(fā)酵液對大麗輪枝菌抑菌活性顯著且存在濃度依賴性。在掃描電鏡下較直觀地觀察到對照組與處理組差異，隨培養(yǎng)時間及發(fā)酵液濃度增加大麗輪枝菌菌絲形態(tài)發(fā)生膨脹、斷裂、異型，分生孢子及微菌核形成逐漸減少，進一步說明阿薩爾基亞芽孢桿菌對大麗輪枝菌微菌核有較強抑制作用。

微菌核形成量少或不能形成微菌核的大麗輪枝菌，其致病力也會相應減弱[16]，微菌核形成量的減少意味著棉花黃萎病的抗逆性休眠體減少，連作棉田的發(fā)病率降低。拮抗植物病原菌的生防細菌抗逆性強、生長快、種類較多，其中芽孢桿菌應用較多，定殖率高，且能夠促進植物生長[17]。該研究中的阿薩爾基亞芽孢桿菌易于培養(yǎng)，生長繁殖速度快，在優(yōu)化發(fā)酵工藝[18 -19]基礎(chǔ)上制成活菌生防菌制劑施入土壤，直接作用于大麗輪枝菌微菌核，減少土壤中黃萎致病菌數(shù)量，達到生防目的。綜上可見，開發(fā)阿薩爾基亞芽孢桿菌生防菌劑防治棉花黃萎病前景樂觀，對新疆棉花黃萎病的生物防治意義重大。