肝腸首過效應(yīng)對五味子醇甲在大鼠體內(nèi)生物利用度的影響

李寧,沈璐,牛麗君,李卓,邱志霞,張德文

(1.中國藥科大學(xué)藥學(xué)院,江蘇 南京 211198;2.長白山科學(xué)研究院,吉林 長白山保護(hù)開發(fā)區(qū)管理委員會 133613)

五味子是長白山珍貴的藥用植物,具有保肝、鎮(zhèn)靜、催眠、抗衰老、抗腫瘤、抗疲勞、免疫調(diào)節(jié)等功效[1],對急慢性、病毒性肝炎等多種肝臟疾病有良好的治療效果,這主要與木脂素類成分相關(guān),其中五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素、五味子酯甲是最為重要的幾種生物活性木脂素[2]。五味子醇甲是中藥五味子中含量最高的木脂素成分,2020年版《中國藥典》將五味子醇甲的含量作為五味子的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[3]。五味子醇甲具有明顯的鎮(zhèn)靜催眠、抗癌、抗炎、保護(hù)肝細(xì)胞和抗自由基活性等作用。雖然五味子提取物及其多種制劑有良好的療效,但五味子主要成分的體內(nèi)生物利用度較低,其中五味子醇甲的生物利用度僅為15%左右。五味子醇甲在體內(nèi)吸收迅速,易從血液分布到各個組織臟器,比如肝、腎、心、脾、腦等,在肝臟中分布濃度最高[4]。已有報道發(fā)現(xiàn),CYP3A是五味子醇甲的主要代謝酶,羥基化和去甲基化可能是五味子醇甲的主要代謝方式[5]。五味子醇甲大多以代謝產(chǎn)物的形式:或進(jìn)入膽汁,進(jìn)入腸道后隨糞便排出體外;或進(jìn)入血液,經(jīng)腎臟隨尿液排出體外[6]。

綜合考慮五味子醇甲吸收迅速、消除快的體內(nèi)藥動學(xué)特性,本研究重點(diǎn)考察五味子醇甲的體內(nèi)處置過程,從藥動學(xué)角度,探討五味子醇甲低生物利用度的原因。借助肝臟、腸道首過代謝動物模型,研究腸道、肝臟代謝在五味子醇甲體內(nèi)轉(zhuǎn)化過程中的作用以及對生物利用度的影響,以期為臨床研究提供更多理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 藥品與試劑

五味子醇甲(純度:99.6%)購自中國食品藥品檢定研究院；GL-V9(純度>99.3%,內(nèi)標(biāo))由中國藥科大學(xué)藥化教研室提供;乙腈、甲醇(色譜純)購自美國Tedia公司;聚乙二醇400(PEG400)、羥丙基-β-環(huán)糊精為分析純;其他試劑均為市售分析純。精密稱量五味子醇甲和GL-V9各1 mg,溶于1 mL DMSO,配制成1.0 mg·mL-1的儲備液,放置于4 ℃冰箱中備用。

1.2 儀器

質(zhì)譜儀(型號:AB Sciex 4000,Applied Biosystems公司);超高效液相色譜儀(型號:LC-30A,日本SHIMADZU公司);電子天平(型號:AB135-S,METTLER TOLEDO公司);旋渦混合器(型號:XW-80C,上海醫(yī)大儀器廠);低溫超速離心機(jī)(型號:5430-R,Eppendorf公司);數(shù)控超聲清洗器(型號:KQ2200DE,昆山市超聲儀器有限公司)。

1.3 給藥劑量及藥物配制

精密稱量一定量的五味子醇甲,按照10%DMSO+30%PEG400+60%生理鹽水(含10%羥丙基-β-環(huán)糊精)的比例配制成一定體積的藥液,按照10 mg·kg-1的劑量,靜脈注射(i.v)或幽門靜脈注射(i.p.v)給藥。

精密稱量一定量的五味子醇甲,按照10%DMSO+30%PEG400+60%生理鹽水(含10%羥丙基-β-環(huán)糊精)的比例配制成一定體積的藥液,分別按照10、20、50 mg·kg-1劑量，灌胃(i.g)給藥;或分別按20 mg·kg-1劑量，十二指腸穿刺(i.d)給藥。

1.4 實(shí)驗(yàn)動物

SD大鼠,雄性，體質(zhì)量180～220 g,由上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供,生產(chǎn)許可證號:SCXK(滬)2018-0006,在中國藥科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心飼養(yǎng)1周后使用。給藥前12 h和給藥后4 h禁食,試驗(yàn)期間自由飲水。實(shí)驗(yàn)過程按照中國藥科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理相關(guān)規(guī)定進(jìn)行(批準(zhǔn)號:20190066)。

1.5 動物試驗(yàn)與取樣方法

1.5.1 整體藥動學(xué)研究 SD大鼠隨機(jī)分為i.v給藥組和3個不同劑量i.g給藥組，每組4只。清醒大鼠尾靜脈注射五味子醇甲10 mg·kg-1,在給藥前和給藥后2、5、10、20、30、45 min,1、2、4 h經(jīng)頸靜脈處取全血至肝素化試管中,8 000 r·min-1離心5 min,分離血漿并于-70 ℃保存待測;清醒大鼠分別i.g給予五味子醇甲10、20、50 mg·kg-1，在給藥前和給藥后5、10、20、30、45 min,1、2、4 h經(jīng)頸靜脈取全血至肝素化試管中,8 000 r·min-1離心5 min,分離血漿并于-70 ℃保存待測。

1.5.2 五味子醇甲的總體代謝研究 SD大鼠分為i.d給藥組和i.g給藥組，每組4只。采用20%烏拉坦腹腔注射麻醉大鼠(0.1 mg·kg-1),以仰臥位固定于手術(shù)板上。整個手術(shù)期間手術(shù)板置于白熾燈下保溫,并用潤濕棉花覆蓋創(chuàng)口。在大鼠頸部一側(cè)剪開頸靜脈處皮膚,用鑷子撕開肌肉分離出一側(cè)頸靜脈,將遠(yuǎn)心端結(jié)扎防止泵血。用剪刀將頸靜脈剪一小口后用連接有注射器的肝素化的膽管插管插入頸靜脈中,使插管前段進(jìn)入頸靜脈約4～7 mm,用注射器輕輕抽吸插管,回血后用手術(shù)線結(jié)扎固定,再推注含0.05%肝素鈉的生理鹽水0.1 mL防止凝血;沿腹白線剪開大鼠腹腔小心找到十二指腸,避開腸系膜靜脈密集處,用注射器穿刺給予藥物20 mg·kg-1,經(jīng)頸靜脈采血。同時為了研究胃部對五味子醇甲代謝的影響,按照同樣的手術(shù)方法,i.g給予大鼠五味子醇甲20 mg·kg-1,經(jīng)頸靜脈采血。

分別于給藥前和給藥后2、5、10、20、30 min,1、2、4 h從頸靜脈插管處用注射器取血200 μL(棄去前端含肝素鈉部分)并立即轉(zhuǎn)移至肝素化試管中,再補(bǔ)以200 μL含0.05%肝素鈉的生理鹽水,血樣8 000 r·min-1離心5 min,分離血漿并于-70 ℃保存待測。

1.5.3 五味子醇甲腸代謝研究 在大鼠(n=4)麻醉狀態(tài)下,沿腹白線剪開大鼠腹腔,找到十二指腸,露出肝門靜脈并找到側(cè)支幽門靜脈,游離出約0.5 cm幽門靜脈段,兩端穿線,將遠(yuǎn)離肝門靜脈端結(jié)扎,然后由幫手將靠近肝門靜脈的一側(cè)埋線輕輕提起,防止泵血,用針頭在幽門靜脈上穿刺幽門靜脈,將連接有注射器的肝素化的膽管插管插入幽門靜脈中,使插管前段進(jìn)入肝門靜脈約2 mm,用注射器輕輕抽吸插管,回血后用手術(shù)線結(jié)扎固定,再推注含0.05%肝素鈉的生理鹽水0.1 mL防止凝血。

經(jīng)i.d給予20 mg·kg-1的五味子醇甲,分別于給藥前和給藥后2、5、10、20、30 min,1、2、4 h從幽門靜脈插管處用注射器取血200 μL(棄去前端含肝素鈉部分)并立即轉(zhuǎn)移至肝素化試管中,再補(bǔ)以200 μL含0.05%肝素鈉的生理鹽水,血樣8 000 r·min-1離心5 min,分離血漿并于-70 ℃保存待測。

1.5.4 五味子醇甲肝首過代謝研究 SD大鼠分為頸靜脈采血組和幽門靜脈采血組，每組4只。在大鼠麻醉狀態(tài)下,按上述方法,分別進(jìn)行頸靜脈插管和幽門靜脈插管。i.p.v給予10 mg·kg-1的五味子醇甲,分別于給藥前和給藥后2、5、10、20、30 min,1、2、4 h從頸靜脈插管處用注射器取血200 μL(棄去前端含肝素鈉部分)并立即轉(zhuǎn)移至肝素化試管中,再補(bǔ)以200 μL含0.05%肝素鈉的生理鹽水,血樣8 000 r·min-1離心5 min,分離血漿并于-70 ℃保存待測。

1.6 藥代動力學(xué)參數(shù)的計算方法

主要的藥動學(xué)參數(shù)利用WinNonlin 8.0軟件以統(tǒng)計矩方法計算:達(dá)峰濃度(Cmax):采用實(shí)測值;達(dá)峰時間(Tmax):采用實(shí)測值;血藥濃度-時間曲線下面積(AUC0-t)值:采用梯形法計算;消除半衰期(t1/2)=0.693/ke,其中ke為末端相消除速率常數(shù);平均滯留時間(MRT)=AUMC/AUC，其中AUMC為時間與血藥濃度的乘積-時間曲線下面積。

絕對生物利用度(Ft)計算:

其中Fa×Fg為腸道利用度,Fh為肝臟利用度;AUCi.g和AUCi.v分別為i.g和i.v給藥后的系統(tǒng)暴露量;Dosei.v和Dosei.g分別為i.v和i.g給藥的劑量。

Fh計算:

其中AUCi.p.v和AUCi.v分別為i.p.v和i.v給藥后的系統(tǒng)暴露量；Dosei.v和Dosei.p.v分別為i.v和i.p.v給藥的劑量。

Fa×Fg計算:

其中AUCi.d,portal和AUCi.d,system分別為i.d給藥后的幽門靜脈采血和頸靜脈采血的暴露量;Dose為i.d給藥的劑量;Rb為全血與血漿比值,本研究中設(shè)定為1;Qportal為肝門靜脈血流量,設(shè)定為39.2 mL·min-1·kg-1。

胃部利用度(FG)計算:

其中AUCi.g和AUCi.d分別為i.g和i.d給藥后的系統(tǒng)暴露量;Dosei.g和Dosei.d分別為i.g和i.d給藥的劑量。

1.7 五味子醇甲的體外代謝研究

將一定濃度的五味子醇甲10 μL(終濃度為1 μmol·L-1)加至含有肝、腸微粒體的反應(yīng)體系中預(yù)溫孵5 min(5 mmol·L-1MgCl2+0.5 mg·mL-1微粒體,反應(yīng)終體積為200 μL),加入NADPH 1.0 mmol·L-1啟動反應(yīng),分別在0、10、20、30 min,1、2 h取點(diǎn)并立即轉(zhuǎn)移至冰浴中。取100 μL溫孵樣品加入400 μL冰乙酸乙酯終止反應(yīng),渦旋振蕩3 min,12 000 r·min-1離心5 min,取上清300 μL于離心管中,并在離心濃縮儀中揮干,測定前用100 μL流動相復(fù)溶(含內(nèi)標(biāo)),10 μL進(jìn)樣LC-MS/MS系統(tǒng)分析。溫孵樣品每個時間點(diǎn)重復(fù)3份。

利用WinNonlin 8.0軟件計算藥動學(xué)參數(shù),以末端指數(shù)消除擬合五味子醇甲的體外消除半衰期，并按照如下公式擬合體外的內(nèi)在清除率(CLint)。

1.8 樣品處理

采用乙腈逐級稀釋五味子醇甲儲備液,配制一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液(1、2、5、10、20、50、100、200、500、1 000 ng·mL-1)放置于4 ℃冰箱中備用;精密吸取50 μL不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液和質(zhì)控樣品工作液(3個水平的質(zhì)控樣品2、50、800 ng·mL-1,用于樣品分析過程中的質(zhì)量控制和檢測精度控制),于離心濃縮儀揮干后分別加入50 μL的大鼠空白血漿,加入100 μL 50 ng·mL-1的GL-V9溶液,另加入50 μL空白乙腈,振蕩5 min后于12 000 r·min-1,4 ℃離心10 min,取一定體積的上清液于進(jìn)樣小瓶,進(jìn)樣體積為5 μL。

1.9 樣品檢測方法

采用LC-MS/MS方法測定血漿樣品和體外溫孵樣品:色譜柱為Agilent Extend C18柱(1.8 μm,4.6 mm×50 mm);柱溫40 ℃;流動相A為0.1%甲酸水溶液,流動相B為乙腈,流速為0.8 mL·min-1,采用梯度洗脫:0.01～0.5 min,5%B;0.5～1.0 min,5%B;1.0～2.0 min,90%B;2.0～2.5 min,90%B;2.5～3.0 min,5%B;3.0～3.5 min,5%B。質(zhì)譜離子源為Turbo Spray源,正離子；噴霧電壓5 500 V；Gas1,45；Gas2,45；離子源溫度為500 ℃；去簇電壓DP為80 V；掃描方式為多級反應(yīng)監(jiān)測(MRM)。用于定量分析的離子反應(yīng)分別為m/z433.1→384.2(CE 25 V,五味子醇甲),410.2→126.1(CE 28 V,內(nèi)標(biāo))。

該LC-MS/MS方法進(jìn)行了簡單的方法學(xué)考察,主要包括專屬性、精密度、準(zhǔn)確度和長期冷凍穩(wěn)定性、處理前穩(wěn)定性等,結(jié)果見表1～2。發(fā)現(xiàn)在五味子醇甲和內(nèi)標(biāo)GL-V9出峰位置未有明顯干擾;精密度和準(zhǔn)確度的RSD在15%以內(nèi);無明顯的基質(zhì)干擾效應(yīng);血漿樣品-70 ℃長期冷凍穩(wěn)定性、凍融穩(wěn)定性、處理前放置穩(wěn)定性、處理后放置穩(wěn)定性并無明顯降低,說明該方法可以應(yīng)用于血漿樣品中五味子醇甲的測定。

表1 大鼠血漿中4個濃度水平五味子醇甲批內(nèi)和批間精密度、準(zhǔn)確度結(jié)果Table 1 Intra-batch and inter-batch precision and accuracy of schizandrin in rat plasma at LLOQ and three QC levels

表2 大鼠血漿中五味子醇甲的基質(zhì)效應(yīng)、回收率以及不同條件下的穩(wěn)定性研究Table 2 Matrix effect,recovery assay of schizandrin at three QC levels and stability investigation under different conditions at low and high QC levels in rat plasma

2 結(jié)果

2.1 五味子醇甲的整體藥動學(xué)過程

大鼠i.v給予10 mg·kg-1的五味子醇甲后,血漿中五味子醇甲的血藥濃度-時間曲線如圖1所示。藥動學(xué)參數(shù)如表3所示，i.v給藥后，五味子醇甲在大鼠體內(nèi)半衰期短(t1/2,0.72 h)、平均停留時間短(MRTlast,0.71 h)、清除率高(CL,3.87 L·h-1·kg-1)、表觀分布容積較大(Vz,4.04 L·kg-1)。

圖1 大鼠i.v給予10 mg·kg-1五味子醇甲后血漿中五味子醇甲濃度-時間曲線Fig.1 The plasma concentration-time profile of schizandrin in rats after i.v administration of 10 mg·kg-1

大鼠分別i.g給予10、20、50 mg·kg-1五味子醇甲后,血漿中五味子醇甲的血藥濃度-時間曲線如圖2所示。藥動學(xué)參數(shù)如表3所示，i.g給藥后,五味子醇甲吸收快(Tmax，0.37、0.44、0.33 h)、平均停留時間短(MRTlast，1.74、1.65、1.27 h),AUC0-4 h為303.66、559.24、1 185.20 h·ng·mL-1,F為12.0%、11.0%、9.35%,高劑量時F略有降低,這些主要的藥動學(xué)參數(shù)與文獻(xiàn)報道接近[1,7]。

圖2 大鼠i.g給予10、20、50 mg·kg-1五味子醇甲后血漿中五味子醇甲濃度-時間曲線Fig.2 The plasma concentration-time profile of schizandrin in rats after i.g administration of 10,

表3 大鼠i.v給予10 mg·kg-1,i.g給予10、20、50 mg·kg-1五味子醇甲的主要藥動學(xué)參數(shù)Table 3 The pharmacokinetic parameters of schizandrin in rats after i.v administration of 10 mg·kg-1 and i.g administration of 10,20,50 mg·kg-1

2.2 大鼠i.g和i.d給予五味子醇甲后經(jīng)頸靜脈采血的體內(nèi)藥動學(xué)過程

大鼠分別i.g和i.d給予20 mg·kg-1的五味子醇甲后,頸靜脈血漿中五味子醇甲的血藥濃度-時間曲線圖3所示。

圖3 大鼠i.g和i.d給予20 mg·kg-1五味子醇甲后頸靜脈中五味子醇甲濃度-時間曲線Fig.3 The plasma concentration-time profile of schizandrin in rats after i.g and i.d administration of 20 mg·kg-1

經(jīng)i.g和i.d給藥的AUC0-4 h相近,分別為467.98、469.03 h·ng·mL-1,這說明胃部首過效應(yīng)對五味子醇甲的影響幾乎可以忽略(FG接近100%),藥動學(xué)參數(shù)如表4所示。

表4 大鼠i.g和i.d給予20 mg·kg-1五味子醇甲后頸靜脈和幽門靜脈血中五味子醇甲的主要藥動學(xué)參數(shù)Table 4 The pharmacokinetic parameters of schizandrin in jugular vein and pyloric vein after i.g and i.d administration

2.3 大鼠i.v和i.p.v給予五味子醇甲后經(jīng)頸靜脈采血的藥動學(xué)過程

大鼠分別經(jīng)i.v和i.p.v給予10 mg·kg-1的五味子醇甲,經(jīng)頸靜脈采血后,頸靜脈血漿中五味子醇甲的濃度-時間曲線分別如圖4所示。

圖4 大鼠i.v和i.p.v給予10 mg·kg-1五味子醇甲后頸靜脈中五味子醇甲濃度-時間曲線Fig.4 The plasma concentration-time profile of schizandrin in rats after i.v and i.p.v administration of 10 mg·kg-1

與i.v給藥(AUC0-4 h=2 547.79 h·ng·mL-1)相比,i.p.v給藥后AUC0-4 h減小,為1 960.22 h·ng·mL-1;經(jīng)公式計算,可以估算大約有76.94%(Fh)進(jìn)入系統(tǒng),肝攝取率為23.06%(1-76.94%),也就是通過i.p.v給藥的五味子醇甲大約有23.06%攝取進(jìn)入肝臟后消除。藥動學(xué)參數(shù)見表5。

表5 大鼠i.v和i.p.v給予10 mg·kg-1五味子醇甲的主要藥動學(xué)參數(shù)Table 5 The pharmacokinetic parameters of schizandrin in rats after i.v and i.p.v administration of 10 mg·kg-1

2.4 大鼠i.d給予五味子醇甲經(jīng)幽門靜脈采血的體內(nèi)藥動學(xué)過程

大鼠i.d給予20 mg·kg-1五味子醇甲后，幽門靜脈血漿中五味子醇甲的濃度-時間曲線如圖5所示。經(jīng)i.d給藥后,幽門靜脈中五味子醇甲的暴露量顯著高于頸靜脈,分別為1 648.08、469.03 h·ng·mL-1,經(jīng)公式計算(以肝門靜脈血流量39.2 mL·min-1·kg-1計算)的腸道利用度為21.53%(Fa×Fg),因此腸道發(fā)生代謝的部分為78.47%(1-21.53%)。藥動學(xué)參數(shù)見表4。

圖5 大鼠i.d給予20 mg·kg-1五味子醇甲后幽門靜脈中五味子醇甲的濃度-時間曲線Fig.5 The plasma concentration-time profile of schizandrin in rats in pyloric vein after i.d administration of 20 mg·kg-1

2.5 五味子醇甲的體外代謝研究

五味子醇甲在肝、腸微粒體(終濃度為0.5 mg·mL-1)體系中,可發(fā)生明顯的NADPH依賴的代謝,2 h內(nèi)基本代謝完全,如圖6所示;在肝臟微粒體中,五味子醇甲的代謝半衰期約為15.4 min;腸道微粒體中的代謝半衰期約為49.2 min,主要參數(shù)如表6所示。與文獻(xiàn)報道一致[5,8],五味子醇甲在腸道和肝臟微粒體體系中可以發(fā)生明顯的NADPH依賴的代謝,其代謝速率快,內(nèi)在清除率CLint分別為0.090 5、0.028 5 mL·min-1·mg-1(表6),這一情況也與體內(nèi)情況一致,進(jìn)一步說明五味子醇甲在吸收過程中的代謝在很大程度上會影響其體內(nèi)的系統(tǒng)暴露量。

圖6 五味子醇甲在肝、腸微粒體體系中的穩(wěn)定性(n=3)Fig.6 The in vitro metabolic stability of schizandrin in the hepatic and intestinal microsomes system(n=3)

表6 五味子醇甲在肝、腸微粒體體系中藥動學(xué)參數(shù)(n=3)Table 6 The in vitro metabolic parameters of schizandrin in the hepatic and intestinal microsomes system (n=3)

3 討論

肝臟、腸道代謝在藥物體內(nèi)轉(zhuǎn)化、首過效應(yīng)、肝腸循環(huán)等過程中發(fā)揮著非常重要的作用,很大程度上影響藥物的生物利用度。可以通過建立肝腸首過代謝動物模型,分別經(jīng)i.v、i.g、i.p.v、i.d這4種給藥方式,比較不同給藥途徑的AUC,評價肝臟、腸道首過效應(yīng)對生物利用度的貢獻(xiàn)程度[9-10]。

考慮五味子醇甲吸收迅速、消除快的體內(nèi)藥動學(xué)特性,本研究設(shè)計了一系列實(shí)驗(yàn),考察i.g給予不同劑量的五味子醇甲后,大鼠血漿中五味子醇甲的經(jīng)時變化過程,并計算其生物利用度;其后建立大鼠肝前首過代謝模型:比較i.v給藥和i.p.v給藥后,頸靜脈血中五味子醇甲AUC的差異,說明肝首過代謝對五味子醇甲的影響;比較i.g給藥和i.d給藥后,頸靜脈血中五味子醇甲AUC的差異,說明胃部代謝對五味子醇甲的影響;比較i.d給藥后,幽門靜脈內(nèi)五味子醇甲AUC與頸靜脈內(nèi)五味子醇甲AUC的差異,間接說明腸道對五味子醇甲利用度的影響。

以五味子醇甲在腸道(Fa×Fg,21.53%)和肝臟(Fh,76.94%)的利用度,估算五味子醇甲的總體利用度Ft為16.57%(Fa×Fg×Fh,21.53%×76.94%),這與經(jīng)i.g給藥頸靜脈采血后計算的生物利用度接近(18.33%)。同時發(fā)現(xiàn)i.g或i.d給藥,五味子醇甲的達(dá)峰時間均在1 h以內(nèi),這說明五味子醇甲吸收迅速；而在4 h結(jié)束采樣前,并未發(fā)現(xiàn)明顯的肝腸循環(huán),這可能與其主要的吸收方式為被動擴(kuò)散有關(guān),也可能與麻醉狀態(tài)下胃腸蠕動程度降低相關(guān)。五味子醇甲在體外肝、腸微粒體體系中主要發(fā)生NADPH依賴的代謝清除,這可能是由于CYP3A是五味子醇甲的主要代謝酶系[5],其在肝臟、腸道中大量表達(dá)。體內(nèi)外研究結(jié)果說明肝腸首過代謝在很大程度上影響五味子醇甲的生物利用度,而腸道代謝在五味子醇甲的首過代謝中貢獻(xiàn)程度更大。因此,明確五味子醇甲首過效應(yīng)發(fā)生的主要部位以及對其生物利用度的影響,有助于為五味子醇甲臨床用藥及開發(fā)新劑型提供理論依據(jù)。