鹽酸氨溴索注射液微生物限度方法學(xué)驗(yàn)證

吳駿鑫　藍(lán)陳陳　于琦

摘要：目的：建立鹽酸氨溴索注射液微生物限度檢查方法。方法依據(jù)《中國藥典》2020版四部1105非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查法：微生物計(jì)數(shù)法進(jìn)行方法適用性驗(yàn)證。結(jié)果：采用薄膜過濾法，使用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，沖洗量為每膜400ml，適用性試驗(yàn)中各試驗(yàn)菌株的回收率比值均在0.5～2.0范圍內(nèi)，符合實(shí)驗(yàn)要求。結(jié)論該方法可適用于鹽酸氨溴索注射液微生物限度的檢查。

關(guān)鍵詞：鹽酸氨溴索注射液;微生物限度;薄膜過濾法

中圖分類號(hào)：R917?? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? 文章編號(hào)：

Abstract：Objective：To establish a microbial limit test method for Ambroxol Hydrochloride Injection. Methods? according to China Pharmacopoeia 2020 edition four 1105non microbial products microbial limit test： microbial counting method applicability validation. Results? The membrane filtration method is adopted， and usepH7. 0 sterile Sodium Chloride Peptone buffer， the flushing volume is 400ml per membrane， and the recovery ratio of each test strain in the applicability test is in the range of 0.5 ～ 2.0， which meets the experimental requirements. Conclusion? T The method can be used to check the microbial limit of ambroxol hydrochloride injection.

Key words： Ambroxol Hydrochloride Injection.;microbial limit test; membrane filtration method

鹽酸氨溴索是一種有機(jī)化合物，可促進(jìn)呼吸道內(nèi)部粘稠分泌物的排除及減少粘液的滯留，因而顯著促進(jìn)排痰。適用于伴有痰液分泌不正常及排痰功能不良的急性、慢性呼吸系統(tǒng)疾病，例如：慢性支氣管炎急性加重，喘息型支氣管炎、支氣管哮喘的祛痰治療;術(shù)后肺部并發(fā)癥的預(yù)發(fā)性治療;早產(chǎn)兒及新生兒嬰兒呼吸窘迫綜合癥（ARDS）的治療。

1 儀器與材料

classⅡType A/B3型生物安全柜（美國法瑪西亞公司）;XG.1DTE-0.6型脈動(dòng)真空滅菌器（山東新華醫(yī)療器械股份有限公司）;LMQ.C-50E型立式滅菌器（山東新華醫(yī)療器械股份有限公司）;KB115E3.1型低溫生化培養(yǎng)箱（BINDER）;LRH-325A型生化培養(yǎng)箱（廣東宏泰君科學(xué)儀器股份有限公司）;HTY-601型集菌儀（浙江泰林生物技術(shù)股份有限公司）。

xxxx-xx-xx

基金項(xiàng)目名稱（編號(hào)）

姓名（出生年—），性別，籍貫，學(xué)位，職稱，研究方向.（必須提供第一作者信息）

試藥

鹽酸氨溴索注射液（杭州澳亞生物技術(shù)股份有限公司，批號(hào)為201G0242，201G0243，201G0244）。

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC（B）26003]，銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[CMCC（B）10104]，枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）[CMCC（B）63501]，白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC（F）98001]，黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC（F）98003]，均來自浙江食品藥品檢定研究院，工作菌株為第五代。

胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（江蘇益瑪生物科技有限公司，批號(hào)201023-1），沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（自制;批號(hào)為201112）;pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司，批號(hào)為20201029），0.9%氯化鈉注射液（山東齊都藥業(yè)有限公司;批號(hào)為1910282162），聚山梨酯80（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)為20190919），上述培養(yǎng)基適用性檢查結(jié)果均符合2020年版《中國藥典》要求。

2方法與結(jié)果

2.1菌液制備

取金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物接種至胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基上或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，30℃～35℃培養(yǎng)18～24小時(shí)。取白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物接種至沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中，20℃～25℃培養(yǎng)2～3天。上述培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每毫升不大于100cfu的菌懸液。

將黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物接種至沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基上，20℃～25℃培養(yǎng)5～7天使大量孢子成熟，加3～5ml含0.05%（v/v）聚山梨酯80的 0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后用適宜方法吸出孢子懸液至無菌試管內(nèi)，用含0.05%（v/v）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液制成每毫升不大于100cfu的孢子懸液。

2.2菌液計(jì)數(shù)

取金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉各不大于100cfu，接種至胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基上，每株試驗(yàn)菌平行接種兩個(gè)平皿。銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌置30～35℃培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間不超過3天，計(jì)數(shù);白色念珠菌、黑曲霉置30～35℃培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間不超過5天，計(jì)數(shù)。取白色念珠菌、黑曲霉各不大于100cfu，接種至沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，每株試驗(yàn)菌平行接種兩個(gè)平皿，置20～25℃培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間不超過5天，計(jì)數(shù)。結(jié)果如下。不同菌種在對(duì)應(yīng)的稀釋濃度下，菌落計(jì)數(shù)均符合規(guī)定。

2.3微生物計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)

試驗(yàn)組：取鹽酸氨溴索注射液供試液3批每批各7份，每份100ml，加入試驗(yàn)菌液（白色念珠菌、黑曲霉各制備兩份，其余試驗(yàn)菌各一份），混勻。每份分別通過裝有0.45μm孔徑濾膜的集菌器過濾，使每張濾膜所濾過的供試液中含菌量不大于100cfu，經(jīng)過每張濾膜的供試品量為100ml。然后每張膜用400ml的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗，過濾。金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌貼于胰酪大豆胨瓊脂平皿上;白色念珠菌、黑曲霉分別取一份貼于胰酪大豆胨瓊脂平皿上，另一份貼于沙氏葡萄糖瓊脂平皿上。

供試品對(duì)照組：取鹽酸氨溴索注射液供試液2份，每份100ml，分別通過裝有0.45μm孔徑濾膜的集菌器過濾，然后每張膜用400ml的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗，過濾，分別貼于胰酪大豆胨瓊脂平皿和沙氏葡萄糖瓊脂平皿上。

菌液對(duì)照組：以稀釋液代替供試液，按試驗(yàn)組操作加入試驗(yàn)菌。

陰性對(duì)照組：取試驗(yàn)用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液2份，每份100ml，分別通過裝有0.45μm孔徑濾膜的集菌器過濾，分別貼于胰酪大豆胨瓊脂平皿和沙氏葡萄糖瓊脂平皿上。

將TSA平板置培養(yǎng)箱，33.0℃下培養(yǎng)，加有金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)3天，加有白色念珠菌、黑曲霉的培養(yǎng)5天，計(jì)數(shù)結(jié)果見表2、表3和表4。

將SDA平板置培養(yǎng)箱，21.5℃下培養(yǎng)5天，計(jì)數(shù)結(jié)果見表5、表6和表7。

由表2至表7可知，試驗(yàn)組的菌回收率均在0.5～2范圍內(nèi)，且陰性對(duì)照組無菌生長，即說明供試品的微生物計(jì)數(shù)的方法適用性試驗(yàn)通過。

3 討論

根據(jù)《中國藥典》2020年版四部1105非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查法，微生物限度檢查法可采用平皿法、薄膜過濾法、MPN法。鹽酸氨溴索是一種有機(jī)化合物能溶于水，且無特殊抑菌性，故采用薄膜過濾法進(jìn)行微生物限度檢查。經(jīng)驗(yàn)證結(jié)果顯示，3批供試品組及菌液對(duì)照組在使用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗400ml每膜后，回收率在合格范圍內(nèi)符合規(guī)定。故鹽酸氨溴索注射液可以采用上述驗(yàn)證方法，結(jié)果可行且可靠。

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