鹽酸小檗堿對牛血清白蛋白淀粉樣纖維化聚集的影響作用及機(jī)制研究

韓曉樂，劉晨音，于 帆，朱佳驊，胡軍成

(中南民族大學(xué) 化學(xué)與材料科學(xué)院，湖北 武漢 430074)

異喹啉生物堿鹽酸小檗堿，又稱黃連素,對多種革蘭陽性及陰性菌具有抑制作用，能增強(qiáng)白細(xì)胞及肝網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬能力，有較強(qiáng)的體內(nèi)外抗腫瘤活性并能誘導(dǎo)B16細(xì)胞分化.小檗堿的鹽酸鹽已廣泛用于治療胃腸炎、細(xì)菌性痢疾等，對肺結(jié)核、猩紅熱、急性扁桃腺炎和呼吸道感染也有一定療效，臨床還發(fā)現(xiàn)本品有抗心律失常的作用[1].蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊形成纖維狀凝結(jié)物，是目前已知的多種退行性精神疾病，諸如阿爾茲海默癥的發(fā)病原因.纖維化過程中產(chǎn)生大量毒素影響細(xì)胞和生物體的正常生理活性，并加速細(xì)胞的凋亡[2-3].

目前已有學(xué)者通過熒光技術(shù)、量熱技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)鹽酸小檗堿可與牛血清白蛋白亞結(jié)構(gòu)域中的氨基酸殘基結(jié)合，在光譜分析手段下表現(xiàn)出對蛋白質(zhì)內(nèi)源熒光的規(guī)律性猝滅，白蛋白最大發(fā)射峰紅移，對熱力學(xué)參數(shù)進(jìn)行計(jì)算得出猝滅機(jī)制為靜態(tài)猝滅[4-6].但是，鹽酸小檗堿對于蛋白質(zhì)淀粉樣纖維化的影響作用及其機(jī)制仍缺乏相關(guān)研究.因此，了解蛋白質(zhì)淀粉樣纖維化過程的產(chǎn)生機(jī)理，尋找抑制或減慢纖維化速度的方法或?qū)橹委熛嚓P(guān)疾病帶來新的思路[7-8].

本文以牛血清白蛋白(BSA)為模型，采用熒光光譜(FL)、紫外可見光譜(UV)、圓二色譜(CD)進(jìn)行分析表征，同時(shí)使用場發(fā)射電鏡(SEM)觀測蛋白形貌，研究了鹽酸小檗堿對牛血清白蛋白淀粉樣纖維化的抑制作用及抑制機(jī)制,以期在藥代動力學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域?yàn)辂}酸小檗堿的進(jìn)一步開發(fā)使用提供理論基礎(chǔ)[9-10].

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

F-7000型熒光光度計(jì)(日本，日立公司)，UV-2550型紫外可見分光光度計(jì)(日本，日立公司)，Chirascan Plus圓二色譜儀(日本，日立公司)；SU8010型場發(fā)射電鏡，BSA (純度≥98 %，BioFroxx公司)，鹽酸小檗堿( BH，純度≥98 %，上海西隴生物科技公司)，硫黃素T (ThT，純度97 %，上海麥克林生物科技公司)，8-苯氨基-1-萘磺酸(ANS，純度96 %，上海阿拉丁有限公司).BH用5 %無水乙醇溶解，配制成濃度為1.0×10-3mol·L-1的原始溶液，于4 ℃ 冰箱中避光保存；其它試劑均為分析純.實(shí)驗(yàn)用水為超純水.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 BSA淀粉樣纖維化的制備

稱取適量的BSA溶解于pH=7.4的PBS緩沖溶液(0.05 mol·L-1) 中，配制成物質(zhì)的量濃度為150.0 μmol·L-1的蛋白溶液，放置在4 ℃ 的冰箱中充分溶解12 h.取不同體積的鹽酸小檗堿原液加入到BSA蛋白溶液中，鹽酸小檗堿的物質(zhì)的量濃度分別為0、37.5、112.5、150.0 μmol·L-1.將上述溶液充分混勻后, 置于65 ℃ 的恒溫水浴鍋中培育，分別在1、2、3、9、12、24、36、48、60、72、96 h 時(shí)取樣，樣品保存于-20 ℃ 冰箱中待測.

1.2.2 ThT熒光光譜測定

稱取適量的ThT溶解于pH=7.4的PBS緩沖溶液中，配制成物質(zhì)的量濃度為50.0 μmol·L-1的熒光試劑，向2 mL的ThT試劑中加入20 μL不同時(shí)間段取出的BSA樣品，充分振蕩，避光反應(yīng)30 min.使用熒光分光光度計(jì)，在440 nm 的激發(fā)波長下，測定450～650 nm 范圍內(nèi)的熒光光譜，激發(fā)和發(fā)射的狹縫寬度均為5 nm.

1.2.3 ANS熒光光譜測定

稱取適量ANS溶解于pH=7.4的PBS緩沖溶液中，配制成物質(zhì)的量濃度為150.0 μmol·L-1的熒光試劑，向2 mL ANS溶液中加入50 μL不同時(shí)間段取出的BSA樣品，充分振蕩，避光反應(yīng)30 min 后測定ANS熒光光譜.激發(fā)波長設(shè)定為380 nm，掃描范圍為400～600 nm，激發(fā)和發(fā)射的狹縫寬度均為2.5 nm.

1.2.4 CD測定

使用圓二色譜儀(CD)測定BSA溶液培育前后二級結(jié)構(gòu)的變化.在室溫條件下，將稀釋的蛋白溶液(3.75 μmol·L-1) 加入到石英比色皿中進(jìn)行測定，波長掃描范圍為190～250 nm ，每組樣品測量3次，通過扣除緩沖溶液的背景光譜來校正所測得的CD光譜[6,9,11-12].

2 結(jié)果與討論

2.1 鹽酸小檗堿對牛血清白蛋白淀粉樣纖維化的抑制

硫黃素T是一種陰離子熒光試劑，對纖維的靈敏度和特異性識別度很高，對纖維有穩(wěn)定的親和性，能與β-折疊表面的芳香族氨基酸發(fā)生特異性結(jié)合，于440 nm的激發(fā)波長作用下，在484 nm 處出現(xiàn)特征發(fā)射峰，β-折疊含量越多熒光強(qiáng)度越強(qiáng)，可以此間接反應(yīng)纖維化的程度[2,13].BSA與人血清白蛋白(HSA)為同源蛋白，不同于大多數(shù)蛋白質(zhì)的核依賴聚集模型，BSA和HAS在纖維化培育開始后便形成原纖維，進(jìn)而結(jié)合形成成熟的淀粉樣纖維.由ThT熒光圖譜(圖1)可看出，在0～60 h,蛋白質(zhì)纖維處于生長期，60 h 以后，熒光強(qiáng)度趨于穩(wěn)定，說明溶液中原纖維基本都已形成成熟的淀粉樣纖維，且隨著蛋白質(zhì)中BH濃度的增大，ThT熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)減弱的趨勢，因此可以初步判斷，鹽酸小檗堿對牛血清白蛋白的淀粉樣纖維化有抑制作用，并與物質(zhì)的量濃度成正相關(guān).

圖1 不同濃度鹽酸小檗堿存在下BSA淀粉樣蛋白聚集的ThT熒光動力學(xué)

2.2 鹽酸小檗堿對牛血清白蛋白淀粉樣纖維表面疏水性的影響

蛋白質(zhì)在不斷聚集形成纖維化的過程中，常伴隨著蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的折疊，誘導(dǎo)蛋白質(zhì)內(nèi)部疏水性氨基酸暴露.ANS作為一種典型的疏水性探針，本身熒光強(qiáng)度較弱，當(dāng)其作用于蛋白質(zhì)的疏水性氨基酸時(shí)，其熒光強(qiáng)度會顯著增強(qiáng)[10,14].常溫下BSA內(nèi)部疏水性氨基酸不會暴露出來，但在65 ℃ 培育96 h 后，BSA-ANS體系表現(xiàn)出較強(qiáng)的熒光強(qiáng)度.表明纖維化培育后的BSA表面暴露出較多的疏水性氨基酸殘基.圖2顯示，當(dāng)在蛋白質(zhì)溶液中分別加入37.5、112.5、150.0 μmol·L-1的鹽酸小檗堿后，ANS熒光強(qiáng)度隨之降低，該結(jié)果表明鹽酸小檗堿可以誘導(dǎo)BSA多肽鏈的收縮，從而使蛋白質(zhì)在較高溫度(65 ℃)下也能維持正常的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性.有文獻(xiàn)報(bào)道，小分子與蛋白質(zhì)的非共價(jià)結(jié)合能夠穩(wěn)定淀粉樣纖維蛋白的核心結(jié)構(gòu)，因此，推測鹽酸小檗堿可能與BSA的氨基酸殘基發(fā)生非共價(jià)結(jié)合而抑制了BSA纖維的形成[15].

圖2 不同物質(zhì)的量濃度鹽酸小檗堿存在下BSA淀粉樣蛋白聚集的ANS熒光動力學(xué)

2.3 鹽酸小檗堿對牛血清白蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響

在正常蛋白質(zhì)向成熟淀粉樣纖維轉(zhuǎn)化的過程中，蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)中的α-螺旋會向β-折疊轉(zhuǎn)變[16].圖3顯示未經(jīng)培育的BSA在208和222 nm 處有2個(gè)明顯的特征吸收峰，表明在BSA結(jié)構(gòu)中α-螺旋占主導(dǎo)地位.當(dāng)BSA在65 ℃下培育96 h 后，222 nm 處的吸收峰強(qiáng)度減弱，表明BSA的二級結(jié)構(gòu)由α-螺旋向β-折疊轉(zhuǎn)變[16].當(dāng)向上述培育的BSA溶液中加入不同物質(zhì)的量濃度的鹽酸小檗堿后，BSA的CD光譜橢圓度逐漸恢復(fù)，且呈現(xiàn)濃度依賴關(guān)系，表明鹽酸小檗堿的加入能夠阻止蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)由α-螺旋向β-折疊的轉(zhuǎn)變，BH通過穩(wěn)定蛋白質(zhì)的α-螺旋結(jié)構(gòu)而發(fā)揮其抑制淀粉樣纖維化的作用[10].

圖3 不同濃度鹽酸小檗堿存在下65 ℃ 水浴培育96 h后BSA二級結(jié)構(gòu)的變化

2.4 SEM測定

圖4為不同物質(zhì)的量濃度(cA=0 μmol·L-1,cB=37.5 μmol·L-1,cC=112.5 μmol·L-1,cD=150.0 μmol·L-1)BH含量培育96 h后，蛋白質(zhì)在掃描電子顯微鏡下的形態(tài).可看出隨著BH物質(zhì)的量濃度的增大，蛋白質(zhì)的纖維化程度逐漸減小，纖維邊緣逐漸模糊，佐證前期實(shí)驗(yàn)中BH對蛋白質(zhì)的纖維化呈現(xiàn)抑制作用.

圖4 不同物質(zhì)的量濃度鹽酸小檗堿存在下65 ℃ 水浴培育96 h后BSA在掃描電鏡下的形貌

3 結(jié)論

鹽酸小檗堿對BSA淀粉樣纖維化的抑制作用呈現(xiàn)濃度依賴性，BH通過減少蛋白質(zhì)表面疏水性氨基酸的暴露，使得蛋白質(zhì)在較高溫度(65 ℃)下也能夠維持正常的構(gòu)象.BH可能通過與BSA中的賴氨酸殘基的特異性結(jié)合而穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，從而抑制蛋白質(zhì)的纖維化聚集.該研究結(jié)果可為鹽酸小檗堿作為新型抗淀粉樣蛋白抑制劑的研發(fā)提供一定的理論基礎(chǔ).