微小RNA-506-3p靶向SPOCK1對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖、凋亡的研究

代恒蘋, 尤克莎, 陳典玲

(陜西省安康市婦幼保健院 產(chǎn)科三病區(qū), 陜西 安康, 725000)

宮頸癌的發(fā)病率僅次于乳腺癌，是女性癌癥相關(guān)死亡的重要原因[1]。近年來，雖已發(fā)現(xiàn)治療宮頸癌的生物靶點(diǎn)，但其死亡率仍居高不下。微小RNA(miRNA)是一類與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的短鏈小分子非編碼RNA。miR-506-3p屬于miR-506-514亞群，位于X染色體，參與對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡和遷移等生命活動(dòng)的調(diào)控，影響腫瘤發(fā)生發(fā)展。研究[2]表明, miR-506在宮頸癌組織中異常低表達(dá)，通過靶向作用于hedgehog通路中Gli3轉(zhuǎn)錄因子，誘導(dǎo)細(xì)胞周期出現(xiàn)G1/S期阻滯，抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。SPOCK1又叫細(xì)胞外基質(zhì)蛋白多糖基因，屬于鈣離子結(jié)合蛋白多糖家族成員，位于人類染色體5q31位點(diǎn)。既往研究[3-7]表明, SPOCK1在神經(jīng)膠質(zhì)瘤、結(jié)腸癌、食管鱗狀細(xì)胞癌、卵巢癌及肺癌等腫瘤組織中異常表達(dá)，下調(diào)其表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。但SPOCK1在宮頸癌發(fā)展中的作用還不清楚。生物信息學(xué)分析顯示, SPOCK1是miR-506-3p的潛在靶點(diǎn)。本研究檢測(cè)了宮頸癌細(xì)胞中miR-506-3p和SPOCK1的表達(dá)情況，觀察miR-506-3p過表達(dá)和SPOCK1抑制表達(dá)對(duì)宮頸癌細(xì)胞HeLa增殖和凋亡的影響，探究miR-506-3p對(duì)SPOCK1的靶向作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料、試劑

宮頸癌細(xì)胞HeLa、Siha、Caski及正常宮頸細(xì)胞Ect1/E6E7購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)引物、miR-506-3p mimic、miR-NC、si-SPOCK1、si-NC、pcDNA、pcDNA-SPOCK1、WT-SPOCK1及MUT-SPOCK1的構(gòu)建和測(cè)序由北京華大基因公司完成，蛋白質(zhì)印跡(Western blot)相關(guān)試劑購自上海碧云天公司，四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)試劑、Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒購于北京索萊寶公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)、實(shí)驗(yàn)分組與細(xì)胞轉(zhuǎn)染

采用含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基對(duì)正常宮頸細(xì)胞Ect1/E6E7和宮頸癌細(xì)胞HeLa、Siha及Caski進(jìn)行培養(yǎng)。定期觀察細(xì)胞生長情況，及時(shí)更換培養(yǎng)液。用胰酶消化融合度約為80%細(xì)胞，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

將實(shí)驗(yàn)分為miR-506-3p mimic組(轉(zhuǎn)染miR-506-3p mimic)、miR-NC組(轉(zhuǎn)染miR-NC)、si-SPOCK1組(轉(zhuǎn)染si-SPOCK1)、si-NC組(轉(zhuǎn)染si-NC)、miR-506-3p mimic+pcDNA組(轉(zhuǎn)染miR-506-3p mimic和pcDNA)和miR-506-3p mimic+pcDNA-SPOCK1組(轉(zhuǎn)染miR-506-3p mimic和pcDNA-SPOCK1)。

收集對(duì)數(shù)生長期的HeLa細(xì)胞接種于6孔板(以5×105個(gè)/孔)上，細(xì)胞融合度約為60%時(shí)，室溫下將各組待轉(zhuǎn)染RNA與LipofectamineTM2000混合，孵育20 min后，將混合物加入HeLa細(xì)胞中搖晃混勻，無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)6 h, 再用含血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h, 進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)分析。為進(jìn)一步驗(yàn)證miR-506-3p是通過調(diào)控SPOCK1表達(dá)參與對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)控，進(jìn)行回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)，把miR-506-3p mimic和pcDNA-SPOCK1同時(shí)轉(zhuǎn)入HeLa細(xì)胞，觀察過表達(dá)SPOCK1能否逆轉(zhuǎn)miR-506-3p對(duì)宮頸癌細(xì)胞HeLa增殖和凋亡的影響。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)miR-506-3p和SPOCK1的mRNA表達(dá)水平

按照Trizol說明書分別提取正常宮頸細(xì)胞Ect1/E6E7和宮頸癌細(xì)胞HeLa、Siha及Caski總RNA, 分析其濃度、純度后，逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA, 隨后進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。miR-506-3p和SPOCK1mRNA的檢測(cè)分別以U6和GAPDH為內(nèi)參。采用2-△△Ct法計(jì)算mRNA的相對(duì)表達(dá)量。所用引物序列如下(5′-3′): miR-506-3p上游引物: ACACTCATAAGGCACCCTTC; miR-506-3p下游引物: TCTACTCAGAAGGGGAGTAC;U6上游引物: CTCGCTTCGGCAGCACA;U6下游引物: ACGCTTCACGAATTTGC;SPOCK1上游引物: CAGCCTGTCCACACAAAAGC;SPOCK1下游引物: CCATCGATT-TGGGGGTTCCA;GAPDH上游引物: GTCAACGGATTTGGTCTGTATT;GAPDH下游引物: CGCUUCACGAAUUUGCGUGUCAU。

1.4 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

TargetscanHuman 7.1網(wǎng)站(http://www.targetscan.org/vert_71/)在線預(yù)測(cè)顯示miR-506-3p與SPOCK1基因的3′UTR有結(jié)合位點(diǎn)。構(gòu)建含有或未含有miR-506-3p結(jié)合位點(diǎn)的野生型或突變型SPOCK1基因3′UTR的熒光素酶表達(dá)載體WT-SPOCK1、MUT-SPOCK1。按照1.2 LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染方法將WT-SPOCK1和MUT-SPOCK1質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到HeLa細(xì)胞，同時(shí)分別轉(zhuǎn)染miR-506-3p mimic或miR-NC。用熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)儀進(jìn)行結(jié)果檢測(cè)。

1.5 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活力

分別取miR-506-3p mimic組、miR-NC組、si-SPOCK1組、si-NC組、miR-506-3p mimic+pcDNA組及miR-506-3p mimic+pcDNA-SPOCK1組轉(zhuǎn)染成功的對(duì)數(shù)期細(xì)胞，用胰酶消化后重懸細(xì)胞，以3×103個(gè)/孔細(xì)胞數(shù)接種于96孔板中，培養(yǎng)24、48、72 h后按照文獻(xiàn)[8-9]方法加入MTT試劑以檢測(cè)細(xì)胞增殖活力，以空白孔調(diào)零，用酶標(biāo)儀在490 nm波長處測(cè)定各孔光密度值(OD值)。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡

采用適量結(jié)合緩沖液重懸各組細(xì)胞。按照Annexin V/PI試劑盒說明書，暗室內(nèi)先后加入Annexin V-FITC和PI染色。使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度。

1.7 Western blot測(cè)定蛋白表達(dá)水平

用RIPA裂解液提取正常宮頸細(xì)胞Ect1/E6E7和宮頸癌細(xì)胞HeLa、Siha、Caski以及各轉(zhuǎn)染組HeLa細(xì)胞總蛋白，并測(cè)定蛋白濃度。取30 μg蛋白樣品上樣，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，并濕法轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜。隨后用Western封閉液室溫封閉60 min, 吸盡封閉液后，用抗SPOCK1、GAPDH、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白(Cyclin D1)、細(xì)胞周期蛋白激酶抑制劑(p21)、抗凋亡因子(Bcl-2)、凋亡蛋白(Bax)、活化型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Cleaved-caspase3)和升高剪切型PARP(Cleaved-PARP)一抗4 ℃緩慢搖動(dòng)孵育過夜; 用相應(yīng)的二抗(1∶1 000)室溫孵育2 h。ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯色后進(jìn)行拍照，并用Image J軟件對(duì)目的條帶進(jìn)行定量(以GAPDH為內(nèi)參)。

1.8 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié) 果

2.1 miR-506-3p和SPOCK1在宮頸癌細(xì)胞和正常宮頸細(xì)胞中的表達(dá)

qRT-PCR結(jié)果顯示，宮頸癌細(xì)胞HeLa、Siha、Caski中miR-506-3p的表達(dá)與正常宮頸細(xì)胞Ect1/E6E7相比均降低,SPOCK1mRNA的表達(dá)與正常宮頸細(xì)胞Ect1/E6E7相比升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Western blot結(jié)果顯示，宮頸癌細(xì)胞HeLa、Siha、Caski中SPOCK1蛋白的表達(dá)與正常宮頸細(xì)胞Ect1/E6E7相比均升高(P<0.05), 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖1、表1。

圖1 宮頸癌細(xì)胞和正常宮頸細(xì)胞中SPOCK1蛋白的表達(dá)

表1 miR-506-3p和SPOCK1在宮頸癌細(xì)胞和正常宮頸細(xì)胞中的表達(dá)

2.2 miR-506-3p靶向調(diào)控SPOCK1的表達(dá)

生物信息學(xué)分析(圖2A)顯示, miR-506-3p在SPOCK1基因3′UTR有相應(yīng)結(jié)合位點(diǎn)。熒光素酶活性檢測(cè)結(jié)果(見表2)顯示，轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-SPOCK1后，再轉(zhuǎn)染miR-506-3p mimic組的HeLa細(xì)胞的熒光素酶活性低于再轉(zhuǎn)染miR-NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而轉(zhuǎn)染MUT-SPOCK1后，再轉(zhuǎn)染miR-506-3p mimic組的HeLa細(xì)胞的熒光素酶活性變化與再轉(zhuǎn)染miR-NC組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05), 表明SPOCK1是miR-506-3p的靶基因。

A: SPOCK1與miR-506-3p的結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè); B: miR-506-3p過表達(dá)或抑制其表達(dá)對(duì)SPOCK1蛋白表達(dá)的影響圖2 miR-506-3p靶向調(diào)控SPOCK1的表達(dá)

表2 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

Western blot檢測(cè)結(jié)果(見圖2B和表3)顯示, miR-506-3p mimic組HeLa細(xì)胞SPOCK1蛋白表達(dá)水平低于與miR-NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); anti-miR-506-3p組HeLa細(xì)胞SPOCK1蛋白表達(dá)水平高于anti-miR-NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 說明miR-506-3p可抑制HeLa細(xì)胞SPOCK1基因的表達(dá)。

表3 miR-506-3p過表達(dá)或抑制其表達(dá)對(duì)SPOCK1蛋白表達(dá)的影響

2.3 miR-506-3p過表達(dá)對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖和凋亡的影響

qRT-PCR(見表4)顯示，與miR-NC組相比, miR-506-3p mimic組HeLa細(xì)胞miR-506-3p的表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 表明成功構(gòu)建了過表達(dá)miR-506-3p的HeLa細(xì)胞株。

MTT增殖實(shí)驗(yàn)(見表4)顯示, miR-506-3p mimic組HeLa細(xì)胞在48、72 h時(shí)細(xì)胞活力低于miR-NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 表明過表達(dá)miR-506-3p可顯著抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖。

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果(見圖3B和表4)顯示, miR-506-3p mimic組細(xì)胞凋亡率高于miR-NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果表明，過表達(dá)miR-506-3p可顯著促進(jìn)宮頸癌HeLa細(xì)胞的凋亡。

Western blot檢測(cè)結(jié)果(見圖3A和表4)顯示, miR-506-3p mimic組HeLa細(xì)胞Cyclin D1和Bcl-2蛋白的表達(dá)低于miR-NC組, p21、Bax、Cleaved-caspase3和Cleaved-PARP蛋白的表達(dá)高于miR-NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

A: 免疫印跡圖; B: 細(xì)胞凋亡流式圖。圖3 miR-506-3p過表達(dá)對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖和凋亡的影響

2.4 抑制SPOCK1表達(dá)對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖和凋亡的影響

Western blot檢測(cè)(見圖4、表5)顯示, si-SPOCK1組HeLa細(xì)胞SPOCK1蛋白的表達(dá)低于si-NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 表明成功構(gòu)建了抑制SPOCK1表達(dá)的HeLa細(xì)胞株。si-SPOCK1組HeLa細(xì)胞CyclinD1和Bcl-2蛋白的表達(dá)低于si-NC組, p21、Bax、Cleaved-caspase3和Cleaved-PARP蛋白的表達(dá)高于si-NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表4 miR-506-3p過表達(dá)對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖和凋亡的影響

MTT增殖實(shí)驗(yàn)(見表5)顯示, si-SPOCK1組HeLa細(xì)胞在48、72 h時(shí)細(xì)胞活力低于si-NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 表明抑制SPOCK1表達(dá)可顯著抑制HeLa細(xì)胞增殖。

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)(見表5)顯示, si-SPOCK1組細(xì)胞凋亡率高于si-NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果表明，抑制SPOCK1表達(dá)對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞具有顯著促凋亡作用。

圖4 免疫印跡圖

表5 抑制SPOCK1表達(dá)對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖和凋亡的影響

2.5 SPOCK1過表達(dá)逆轉(zhuǎn)miR-506-3p過表達(dá)對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖和凋亡的作用

Western blot檢測(cè)(見圖5和表6)顯示，與miR-NC組相比, miR-506-3p mimic組HeLa細(xì)胞SPOCK1、Cyclin D1和Bcl-2蛋白的表達(dá)降低, p21、Bax、Cleaved-caspase3和Cleaved-PARP蛋白的表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 與miR-506-3p mimic+pcDNA組相比, miR-506-3p mimic+pcDNA-SPOCK1組HeLa細(xì)胞SPOCK1、Cyclin D1和Bcl-2蛋白的表達(dá)升高, p21、Bax、Cleaved-caspase3和Cleaved-PARP蛋白的表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖5 免疫印跡圖

MTT法檢測(cè)(見表6)顯示, miR-506-3p mimic組HeLa細(xì)胞在48、72 h時(shí)細(xì)胞活力低于miR-NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); miR-506-3p mimic+pcDNA-SPOCK1組HeLa細(xì)胞在48、72 h時(shí)細(xì)胞活力高于miR-506-3p mimic+pcDNA組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)(見表6)顯示, miR-506-3p mimic組細(xì)胞凋亡率高于miR-NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 而miR-506-3p mimic+pcDNA-SPOCK1組細(xì)胞凋亡率低于miR-506-3p mimic+pcDNA組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。以上結(jié)果表明, SPOCK1過表達(dá)可以逆轉(zhuǎn)過表達(dá)miR-506-3p對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞的增殖抑制及凋亡促進(jìn)作用。

3 討 論

腫瘤細(xì)胞的惡性增殖和凋亡抵抗是腫瘤發(fā)生的重要機(jī)制。因此探討宮頸癌細(xì)胞增殖和凋亡的內(nèi)在機(jī)制，尋找遏制宮頸癌惡性發(fā)展的靶基因具有重要的意義。

miR-506-3p位于人類X染色體長臂27.3位置，細(xì)胞中miR-506-3p的異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。研究[10]顯示, miR-506-3p在多種腫瘤中異常低表達(dá)，通過上調(diào)其下游靶基因，可調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡等生命進(jìn)程。例如, miR-506-3p可下調(diào)RAB3D的表達(dá)抑制骨肉瘤細(xì)胞MG63的增殖和轉(zhuǎn)移過程。miR-506-3p還可下調(diào)LHX2的表達(dá)抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路，從而抑制鼻咽癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移[11]。研究[12]表明, miR-506-3p在宮頸癌中表達(dá)下調(diào)，但miR-506-3p在宮頸癌中的作用并未完全闡明。

SPOCK1是鈣離子結(jié)合蛋白多糖家族成員，其參與調(diào)控細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、DNA修復(fù)和轉(zhuǎn)移。隨著對(duì)腫瘤研究的進(jìn)一步深入, SPOCK1在多種腫瘤中的重要作用引起了學(xué)者的廣泛關(guān)注。SPOCK1在食管鱗狀細(xì)胞癌中過表達(dá)[13]; SPOCK1與拉帕替尼耐藥及胃癌復(fù)發(fā)有關(guān)[14]; 在肝癌細(xì)胞中, CHD1L可作用于SPOCK1進(jìn)而激活A(yù)kt信號(hào)通路，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移[15]。生物信息學(xué)分析顯示,SPOCK1是miR-506-3p的潛在靶基因，但SPOCK1在宮頸癌中的表達(dá)情況及miR-506-3p能否靶向作用于SPOCK1參與宮頸癌細(xì)胞的增殖和凋亡調(diào)控還不清楚。

表6 過表達(dá)SPOCK1逆轉(zhuǎn)miR-506-3p過表達(dá)對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖和凋亡的作用

本研究檢測(cè)到宮頸癌細(xì)胞中miR-506-3p表達(dá)異常下調(diào), SPOCK1表達(dá)異常上調(diào)。這與GONG M等[12]宮頸癌中miR-506-3p低表達(dá)的結(jié)論一致。隨后的雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)和Western blot結(jié)果證實(shí)SPOCK1表達(dá)受到miR-506-3p的靶向負(fù)性調(diào)控。用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法上調(diào)miR-506-3p表達(dá)或RNA干擾技術(shù)抑制SPOCK1表達(dá)，均發(fā)現(xiàn)HeLa細(xì)胞中Cyclin D1和Bcl-2表達(dá)下降, p21和Bax表達(dá)升高，細(xì)胞增殖減弱，凋亡增加。Cyclin D1表達(dá)減少，與CDKs形成的細(xì)胞周期素蛋白激酶復(fù)合物減少，同時(shí)p21抑制復(fù)合物的活性，進(jìn)一步阻礙細(xì)胞周期從G0/G1期進(jìn)入S期，從而發(fā)揮抗增殖作用。促凋亡蛋白Bax表達(dá)增加，抗凋亡因子Bcl-2表達(dá)減少，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[16]。此外，上調(diào)miR-506-3p或抑制SPOCK1表達(dá)后細(xì)胞凋亡標(biāo)記物Cleaved-caspase3和Cleaved-PARP表達(dá)顯著升高。這與敲減SPOCK1后，前列腺癌[17]、膽囊癌[3]及膀胱癌[18]細(xì)胞增殖減弱凋亡增加現(xiàn)象相吻合，并可能與PI3K/Akt信號(hào)通路有關(guān)[19]。以上結(jié)果提示，在宮頸癌細(xì)胞中, miR-506-3p可通過抑制癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡，抑制宮頸癌的進(jìn)一步惡化。而SPOCK1則發(fā)揮相反的作用。把miR-506-3p mimic和pcDNA-SPOCK1共轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)miR-506-3p對(duì)HeLa細(xì)胞的增殖抑制和促進(jìn)凋亡作用在一定程度上得到逆轉(zhuǎn)。

綜上所述，在宮頸癌細(xì)胞中miR-506-3p低表達(dá), SPOCK1高表達(dá)，且miR-506-3p通過靶向下調(diào)SPOCK1的表達(dá)抑制宮頸癌細(xì)胞HeLa增殖并誘導(dǎo)其凋亡。這為miR-506-3p作為宮頸癌治療靶點(diǎn)提供新的理論依據(jù)。