非肌層浸潤性膀胱癌微小RNA-138、微小RNA-143表達(dá)與患者預(yù)后的相關(guān)性分析

張 剛, 任衢軍, 成澤民

(四川省達(dá)州市中心醫(yī)院 泌尿外科, 四川 達(dá)州, 635000)

膀胱癌是臨床常見的惡性腫瘤，多發(fā)于50～70歲人群，其中約75%為非肌層浸潤性膀胱癌(NMIBC)[1]。目前，經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù)被廣泛應(yīng)用于NMIBC的治療中，其能將肉眼所見病灶切除，對NMIBC具有一定的治療價值，但仍有50%～80%患者腫瘤復(fù)發(fā)，且約30%患者伴有腫瘤進(jìn)展，嚴(yán)重影響預(yù)后[2]。相關(guān)研究[3]指出，膀胱癌發(fā)生與進(jìn)展的機(jī)制非常復(fù)雜，篩選潛在腫瘤標(biāo)記物以進(jìn)一步明確膀胱癌的發(fā)病機(jī)制是臨床研究的重點(diǎn)與難點(diǎn)，這對于膀胱癌的早期診療具有重要意義。微小核糖核酸(miRNA)是非編碼RNA分子，這類分子能調(diào)控靶基因表達(dá)，參與細(xì)胞代謝、發(fā)育、凋亡、更新等過程，其異常改變與腫瘤疾病有關(guān)[4]。黃卓雅等[5]指出，微小RNA-138(miR-138)能對沉默信息調(diào)節(jié)因子1進(jìn)行靶向調(diào)控，從而調(diào)節(jié)膀胱癌細(xì)胞凋亡與增殖。另有研究[6]提示，微小RNA-143(miR-143)基因多態(tài)性與膀胱癌發(fā)生風(fēng)險有關(guān)，表明miR-143基因在膀胱癌中可能發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。miR-138、miR-143表達(dá)與NMIBC患者預(yù)后的關(guān)系目前尚未完全明確，本研究選取124例NMIBC患者為研究對象，探討NMIBC組織中miR-138、miR-143表達(dá)與患者預(yù)后的相關(guān)性，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取達(dá)州市中心醫(yī)院2015年6月—2018年6月收治的124例NMIBC患者作為研究對象，其中68例患者同時取癌組織與癌旁組織(距離病灶約3 cm)。納入標(biāo)準(zhǔn): ① 經(jīng)病理診斷證實(shí)為NMIBC的成年患者; ② 既往無化學(xué)治療、放射治療、免疫治療等干預(yù)史者; ③ 近期未使用過激素、免疫抑制劑者; ④ 能接受隨訪者; ⑤ 遵循自愿原則，簽署同意書者。排除標(biāo)準(zhǔn): ① 有惡性血液疾病或其他部位原發(fā)性腫瘤者; ② 伴尿出血、泌尿系統(tǒng)感染者; ③ 心、肝、腎等臟器功能不全者; ④ 因腫瘤復(fù)發(fā)入院者; ⑤ 既往有精神病史者。124例患者中，男101例，女23例; 年齡40～75歲，平均(60.15±12.86)歲; 有飲酒史33例，無飲酒史91例; 腫瘤分期為Ta期89例, T1期35例; 腫瘤直徑≥3 cm者41例, <3 cm者83例; 高血壓者21例，無高血壓者103例; 單發(fā)腫瘤96例，多發(fā)腫瘤28例; 病理分級為高級別乳頭狀尿路上皮癌(UPC)26例、低級別UPC 42例、低度惡性潛能乳頭狀尿路上皮腫瘤(PUNLMP)56例。本研究方案獲得達(dá)州市中心醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)。

1.2 檢測方法

通過手術(shù)獲取患者膀胱癌組織、癌旁組織，采用實(shí)時逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法測定miR-138、miR-143表達(dá)水平。主要儀器為分光光度計(jì)(U-T9型，屹譜儀器制造有限公司)、熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)儀(MA-688型，江蘇迅睿生物技術(shù)有限公司)、低溫冰箱(DW-86L390型，南京貝登醫(yī)療股份有限公司)和高速離心機(jī)(TGL-16M型，博科集團(tuán))。主要材料為無水乙醇、三氯甲烷、瓊脂糖、異丙醇、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，試劑盒購于美國Invitrogen公司。采用Trizol試劑提取總RNA，取少量RNA液測定純度及濃度。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。取5 μL cDNA行RT-PCR擴(kuò)增，并使用熒光定量PCR儀與配套試劑進(jìn)行檢測。miR-138上游、下游引物序列分別為5′-AGCTGGTGTTGTGAATCAGGCCG-3′、5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′; miR-143上游、下游引物序列分別為5′-TGAGATGAAGCACTGT-3′、5′-ACATCGACTGTAGCATA-3′; 內(nèi)參引物U6的上游、下游引物序列分別為5′-CAGGGGCCATGCTAAATCTTC-3′、5′-CTTGGCAGCACATATACTAAAAT-3′。反應(yīng)條件: 95 ℃預(yù)變性15 min; 94 ℃變性15 s, 55 ℃退火30 s, 70 ℃延伸34 s, 40個循環(huán)。采用2-△△CT法表示miR-138、miR-143相對表達(dá)量。

1.3 隨訪方法

NMIBC患者術(shù)后均隨訪36個月，隨訪方式包括門診隨訪、電話隨訪，且患者均遵醫(yī)囑定期門診復(fù)查。觀察并分析患者的無瘤生存率與累積生存率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 NMIBC組織、癌旁組織miR-138、miR-143表達(dá)情況比較

NMIBC組織中miR-138、miR-143表達(dá)量均低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 見表1。

表1 NMIBC組織、癌旁組織miR-138、miR-143表達(dá)量比較

2.2 預(yù)后情況及預(yù)后單因素分析

本研究以術(shù)后出現(xiàn)復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、死亡事件為預(yù)后不良，以無事件生存為預(yù)后良好。124例患者中，預(yù)后不良者38例、預(yù)后良好者86例，將其分別納入預(yù)后不良組、預(yù)后良好組。miR-138、miR-143表達(dá)量以癌組織中表達(dá)量均值為界分成高表達(dá)(>均值)與低表達(dá)(≤均值)。預(yù)后不良組腫瘤T1期、腫瘤直徑≥3 cm、多發(fā)腫瘤、高級別UPC占比均高于預(yù)后良好組, miR-138高表達(dá)率、miR-143高表達(dá)率均低于預(yù)后良好組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 124例NMIBC患者預(yù)后的單因素分析[n(%)]

2.3 預(yù)后的多元Cox回歸分析

采用多元Cox回歸模型對單因素分析中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變量進(jìn)行量化賦值，并將其設(shè)為自變量X, 同時以預(yù)后為因變量Y(預(yù)后良好=0，預(yù)后不良=1)。多元Cox回歸分析結(jié)果顯示，腫瘤T1期、腫瘤直徑≥3 cm、多發(fā)腫瘤、高級別UPC是預(yù)后的危險因素(P<0.05), 而miR-138高表達(dá)、miR-143高表達(dá)是預(yù)后的保護(hù)因素(P<0.05), 見表3。

表3 NMIBC患者預(yù)后的多元Cox回歸分析

2.4 不同miR-138、miR-143表達(dá)患者的無瘤生存及累積生存情況

根據(jù)NMIBC組織中miR-138表達(dá)量的不同，將124例患者分成miR-138高表達(dá)組(n=69)、miR-138低表達(dá)組(n=55)。miR-138高表達(dá)組的無瘤生存率、累積生存率分別為82.61%(57/69)、88.41%(61/69)。miR-138低表達(dá)組的無瘤生存率、累積生存率分別為52.73%(29/55)、47.27%(26/55)。miR-138高表達(dá)組的無瘤生存率、累積生存率均高于低表達(dá)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=12.652、14.911,P<0.01), 見圖1。

A: 無瘤生存函數(shù)圖; B: 累積生存函數(shù)圖。

根據(jù)NMIBC組織中miR-143表達(dá)量的不同，將124例患者分成miR-143高表達(dá)組(n=64)、miR-143低表達(dá)組(n=60)。miR-143高表達(dá)組無瘤生存率、累積生存率分別為84.38%(54/64)、87.50%(56/64)。miR-143低表達(dá)組無瘤與累積生存率分別為53.33%(32/60)、61.67%(37/60)。miR-143高表達(dá)組的無瘤生存率、累積生存率均高于低表達(dá)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=13.968、11.022,P<0.01), 見圖2。

A: 無瘤生存函數(shù)圖; B: 累積生存函數(shù)圖。

2.5 NMIBC組織中miR-138與miR-143表達(dá)的一致性

Kappa檢驗(yàn)結(jié)果顯示, NMIBC組織中miR-138表達(dá)與miR-143表達(dá)具有高度一致性(Kappa=0.790,P<0.01), 見表4。

表4 NMIBC組織中miR-138表達(dá)與miR-143表達(dá)的一致性

3 討 論

NMIBC是臨床較常見的一種膀胱癌類型，多采用手術(shù)切除治療，但這類腫瘤主要呈中心性生長，術(shù)后仍有部分患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致死亡風(fēng)險增加[7]。NMIBC的發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜，臨床亟需進(jìn)一步探索其發(fā)生與進(jìn)展機(jī)制并尋找更好的預(yù)后評估指標(biāo)，以便更有效地分析病情，改善患者預(yù)后。相關(guān)研究[8]證實(shí), miRNA與腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展有關(guān)，其能通過對腫瘤微環(huán)境進(jìn)行調(diào)控，參與腫瘤細(xì)胞分化、分泌、轉(zhuǎn)移等過程，并調(diào)節(jié)腫瘤免疫系統(tǒng)，促進(jìn)或抑制腫瘤進(jìn)展。YANG R等[9]研究顯示, miR-138-5p能靶向Survivin促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞的侵襲和增殖。WANG Y等[10]則認(rèn)為, miR-138-5p表達(dá)下調(diào)與膀胱癌預(yù)后不良密切相關(guān)。由此推測, miR-138可能在膀胱癌中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用，其表達(dá)異?；蚺c患者病情進(jìn)展有關(guān)。LI M S等[11]指出, Circ_0006332可通過調(diào)控miR-143表達(dá)對MYB家族成員MYBL2基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)，參與膀胱癌進(jìn)展，間接提示miR-143表達(dá)與膀胱癌有關(guān)。

miR-138在多種惡性腫瘤中呈異常表達(dá)，包括結(jié)直腸癌、鼻咽癌、膀胱癌等，其對腫瘤細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制較復(fù)雜，在多數(shù)腫瘤中具有抑癌作用，能促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡，抑制其增殖[12]。王秋爽等[13]指出，miR-138能靶向細(xì)胞周期蛋白1對結(jié)腸癌患者腫瘤細(xì)胞增殖進(jìn)行抑制，提示其具備抑癌功能。p53對miRNA表達(dá)有調(diào)控作用，其也受相關(guān)miRNA表達(dá)調(diào)控, p53介導(dǎo)的信號通路能促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡，而miR-138能靶向p53的3′-UTR區(qū)，致p53表達(dá)上調(diào)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，這可能是miR-138重要的抗癌機(jī)制[14]。動物實(shí)驗(yàn)[15]結(jié)果提示, miR-143位于染色體5q32處，具有抑癌作用，其表達(dá)受缺氧誘導(dǎo)因子-1α、p53蛋白調(diào)節(jié)，此外, miR-143還可能通過靶向大鼠肉瘤相關(guān)信號通路達(dá)到抑制癌癥進(jìn)展的目的。本研究結(jié)果顯示, NMIBC組織中miR-138、miR-143表達(dá)量顯著低于癌旁組織，表明患者機(jī)體的抗癌能力不足，會促進(jìn)NMIBC癌細(xì)胞增殖與進(jìn)展。

NMIBC患者的中遠(yuǎn)期預(yù)后情況已引起廣泛關(guān)注，相關(guān)研究[16]提示, NMIBC患者預(yù)后大多與腫瘤分期、腫瘤數(shù)目、病理分級等有關(guān)。本研究結(jié)果顯示, NMIBC患者預(yù)后與腫瘤分期、腫瘤直徑、腫瘤數(shù)目、病理分級有關(guān)，與既往研究[17-18]結(jié)論相符。本研究還顯示, miR-138高表達(dá)、miR-143高表達(dá)對患者預(yù)后有保護(hù)性作用，可提高患者無瘤生存率與累積生存率，且miR-138、miR-143在NMIBC組織中的表達(dá)存在高度一致性。SEGOVIA C等[19]指出，磷脂酰肌醇-3-激酶催化亞單位α的改變可致miR-138表達(dá)增加，有利于對NMIBC細(xì)胞進(jìn)行抑制，進(jìn)而可改善患者預(yù)后。KAMAL M T等[20]發(fā)現(xiàn)，膀胱癌患者血漿miR-143表達(dá)低于健康者，與本研究結(jié)論吻合，進(jìn)一步提示低表達(dá)miR-143可能促進(jìn)膀胱癌進(jìn)展。本研究觀察miR-138、miR-143在NMIBC組織中的表達(dá)情況，并分析二者與預(yù)后的關(guān)系以及二者表達(dá)的一致性，發(fā)現(xiàn)miR-138、miR-143在NMIBC中均有抑癌作用，且二者低表達(dá)可能共同促進(jìn)癌細(xì)胞增殖。但本研究存在一定局限性，如樣本選取范圍偏小，且納入患者大多來自當(dāng)?shù)?，未來還需擴(kuò)大病例選取范圍，進(jìn)一步分析不同地區(qū)患者間的miR-138、miR-143表達(dá)情況。

綜上所述, miR-138、miR-143在NMIBC組織中均表達(dá)下調(diào)，二者低表達(dá)可導(dǎo)致患者預(yù)后不良, miR-138、miR-143有望成為NMIBC診療的新靶標(biāo)。