百合LhTPS基因啟動(dòng)子的克隆及序列分析

韓 婷 王 婷 李興桃 杜 方

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，山西 太谷 030800)

萜烯合酶(Terpene synthase，TPS)作為萜烯途徑中最后一步關(guān)鍵酶，對(duì)各種萜烯類成分的合成具有重要意義。萜烯類物質(zhì)作為植物體內(nèi)一種重要的次生代謝物，具有引誘昆蟲授粉和抵御逆境脅迫的作用，也有許多萜烯類物質(zhì)被用于工業(yè)、醫(yī)藥和食品行業(yè)。小分子的萜烯類化合物還是植物花香揮發(fā)物的重要成分，對(duì)于刺激消費(fèi)，提升觀賞植物的商業(yè)價(jià)值具有不可低估的重要性。

百合是具有高商業(yè)價(jià)值的觀賞植物，市場(chǎng)上常見的品種多屬于亞洲百合雜種系(Asiatic，A)、東方百合雜種系(Oriental，O)、喇叭百合雜種系(Trumpet，T)以及東方百合和喇叭百合的組間雜種系東喇百合(Orienpet，OT)。其中，亞洲百合常無香，其它種類百合常有香。提升亞洲百合的香味以增加其商業(yè)價(jià)值是百合育種的目標(biāo)之一。萜烯類物質(zhì)是有香百合的主要揮發(fā)性成分，已有學(xué)者從百合中克隆到與萜烯類化合物釋放相關(guān)的

LhTPS

基因，其在濃香型百合中的表達(dá)量顯著高于無香型，但基因表達(dá)差異形成的原因尚不可知。高等植物基因表達(dá)主要由啟動(dòng)子與轉(zhuǎn)錄因子之間相互作用進(jìn)行調(diào)控，克隆百合

LhTPS

基因啟動(dòng)子是解析其基因調(diào)控因子及作用機(jī)制的前提。目前，已經(jīng)在百合中克隆到只在雄配子細(xì)胞中表達(dá)的

LGC1

基因啟動(dòng)子、與花色形成相關(guān)的

CHS

、

ANS

基因啟動(dòng)子和逆境脅迫誘導(dǎo)型

GPAF

啟動(dòng)子等，但尚未獲得

LhTPS

基因啟動(dòng)子序列。本研究利用反向PCR技術(shù)在不同百合品種中克隆

LhTPS

基因的啟動(dòng)子，并利用生物信息學(xué)方法比較品種間啟動(dòng)子序列的多態(tài)性和作用元件的差異，為日后進(jìn)行

LhTPS

啟動(dòng)子活性和功能分析奠定基礎(chǔ)，也為闡明百合萜類揮發(fā)物形成的調(diào)控機(jī)制奠定了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料種植于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝試驗(yàn)站露天苗圃(112° E，37° N)。選用品種包括亞洲百合‘Pearl Melanie’‘Red Life’，東方百合‘Entertainer’，東喇百合‘Friso’‘Urandi’‘Mister Sandman’以及喇叭百合‘Pink Perfection’‘Orange Planet’。采摘露天苗圃中8個(gè)百合品種健康植株的嫩葉，液氮速凍后儲(chǔ)存于-80 ℃超低溫冰箱用于DNA的提取。

1.2 DNA提取

采用CTAB法提取百合幼嫩葉片基因組DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量，用NanoDrop 2000生物光度計(jì)檢測(cè)DNA濃度和純度，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 反向PCR法克隆‘Red Life’和‘Entertainer’LhTPS基因5′側(cè)翼片段

基于已知‘Sorbonne’

LsoTPS

基因組DNA序列(

LsoTPS

-

gDNA

，MH618207)在

Bgl

Ⅱ酶切位點(diǎn)上游設(shè)計(jì)正向引物IPCR-1F(5′-CAAGTGATGGAGGACGCTAAAG-3′)，在

LsoTPS

基因 5′端設(shè)計(jì)反向引物IPCR-1R(5′-CTTGGACAACTGACAATGCGAG-3′)。用

Bgl

Ⅱ?yàn)閮?nèi)切酶對(duì)‘Red Life’和‘Entertainer’基因組DNA進(jìn)行酶切、DNA環(huán)化并使用通用型DNA純化回收試劑盒回收DNA。以‘Red Life’和‘Entertainer’基因組DNA為模板進(jìn)行第一次反向PCR，反應(yīng)體系20 μL，包括PCR Mix 10 μL，IPCR-1F和IPCR-1R 各0.5 μL，gDNA 2 μL，ddHO 7 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性3 min，之后為35個(gè)循環(huán)的變性(94 ℃，30 s)、退火(56 ℃，30 s)和延伸(72 ℃，2 min)過程，最后在72 ℃ 延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收、連接、轉(zhuǎn)化和篩選等一系列過程送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。測(cè)序序列與‘Sorbonne’

LsoTPS

基因組DNA序列進(jìn)行拼接，以IPCR-2F(5′-CGGAACACACTTGAAAGGAGAA-3′)和IPCR-2R(5′-TACTCCACCAGAATCAACCCTC-3′)為第2次步移的引物進(jìn)行PCR，PCR的反應(yīng)體系和反應(yīng)程序同第1輪PCR。

1.4 LhTPS基因啟動(dòng)子的克隆

根據(jù)2次反向PCR得到的序列設(shè)計(jì)正向引物IPCR-LF(5′-CTAGACCGACTCATCATCATCTTCT-3′)和反向引物IPCR-LR(5′-GAAGTGGATGAGATGGGAAGTCG-3′)，用以克隆其它百合啟動(dòng)子全長(zhǎng)序列。反應(yīng)體系25 μL，包括基因組DNA 2 μL，dNTP Mixture 4 μL，10 x LA PCR Buffer II(Mgplus)2.5 μL，Takara LA

Taq

0.25 μL，IPCR-LF和IPCR-LR各 0.5 μL，ddHO 15.25 μL。PCR反應(yīng)程序同上。PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收、連接、轉(zhuǎn)化和篩選等一系列過程送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。

1.5 LhTPS基因啟動(dòng)子序列分析

利 用 SnapGene(Version 4.2.4)對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接，獲得每個(gè)品種完整的啟動(dòng)子序列。利用DNAMAN(Version 6.0)軟件分析序列相似性、插入缺失位點(diǎn)和SNP,DnaSp(Version 5.10.01)分析基因多態(tài)性系數(shù),MEGA X分析序列進(jìn)化關(guān)系。運(yùn)用在線軟件PlantCARE(http:∥bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html)對(duì)啟動(dòng)子序列進(jìn)行順式作用元件預(yù)測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 LhTPS基因啟動(dòng)子的獲得

分別以‘Red Life’和‘Entertainer’基因組DNA為模板，經(jīng)過1次反向PCR擴(kuò)增在‘Red Life’中得到1條長(zhǎng)度約為1 000 bp的序列，但‘Entertainer’中無擴(kuò)增條帶 (圖1(a))。將‘Red Life’測(cè)序后獲得的序列與

LsoTPS

-

gDNA

進(jìn)行比對(duì)，該序列位于

LsoTPS

-

gDNA

翻譯起始位點(diǎn)上游703 bp。為了獲得更完整的表達(dá)調(diào)控區(qū)域，以此序列為模板篩選內(nèi)切酶和設(shè)計(jì)引物，繼續(xù)以‘Red Life’基因組DNA為模板，使用2次步移的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得1條長(zhǎng)度約為1 000 bp的DNA序列(圖1(b))。序列比對(duì)結(jié)果表明第2次擴(kuò)增序列與第1次擴(kuò)增序列有95 bp的重疊區(qū)域，位于第1次擴(kuò)增序列上游693 bp，經(jīng)2次序列拼接得到起始密碼子上游1 396 bp非編碼序列。根據(jù)2次反向PCR得到的序列設(shè)計(jì)引物IPCR-LF和 IPCR-LR。以IPCR-LF和 IPCR-LR為引物，以‘Pearl Melanie’‘Red Life’‘Entertainer’‘Friso’‘Urandi’‘Mister Sandman’‘Pink Perfection’‘Orange Planet’DNA為模板進(jìn)行PCR(圖1(c))，再經(jīng)連接和轉(zhuǎn)化等過程，獲得其

LhTPS

啟動(dòng)子序列。

M，DNA標(biāo)準(zhǔn)DL2 000；1,‘Entertainer’;2,‘Red Life’;3,‘Pearl Melanie’;4,‘Friso’;5,‘Urandi’;6,‘Mister Sandman’;7,‘Pink Perfection’;8,‘Orange Planet’。(a)‘Entertainer’和‘Red Life’ LhTPS啟動(dòng)子第一次反向PCR結(jié)果;(b)‘Red Life’LhTPS啟動(dòng)子第二次反向PCR結(jié)果；(c)8個(gè)品種的LhTPS啟動(dòng)子擴(kuò)增產(chǎn)物。 M， DL2 000 DNA Marker； 1, ‘Entertainer’； 2, ‘Red Life’； 3, ‘Pearl Melanie’； 4, ‘Friso’； 5, ‘Urandi’； 6, ‘Mister Sandman’； 7, ‘Pink Perfection’； 8, ‘Orange Planet’. (a) The first inverse-PCR products of LhTPS promoter of ‘Entertainer’ & ‘Red Life’； (b) The second inverse-PCR products of LhTPS promoter of ‘Red Life’； (c) PCR products of LhTPS promoter of 8 lily cultivars.圖1 百合LhTPS基因啟動(dòng)子的擴(kuò)增Fig.1 PCR products of LhTPS promoter of lilies

測(cè)序結(jié)果表明，8個(gè)啟動(dòng)子序列長(zhǎng)度為1 376～1 414 bp；最長(zhǎng)的為東喇百合系列的‘Friso’‘Urandi’的啟動(dòng)子序列，均為1 414 bp；最短的為亞洲百合‘Pearl Melanie’的啟動(dòng)子，僅有1 376 bp；喇叭百合‘Pink Perfection’‘Orange Planet’的啟動(dòng)子長(zhǎng)短一致，均為1 411 bp(表1)。

表1 不同百合品種基因啟動(dòng)子的長(zhǎng)度
Table 1 Length of gene promoters of lily cultivars

品種Cultivar啟動(dòng)子Promoter長(zhǎng)度/bpSize品種Cultivar啟動(dòng)子Promoter長(zhǎng)度/bpSizePearl MelanieLpmTPS-pro1 376FrisoLfTPS-pro1 414Red LifeLrlTPS-pro1 403UrandiLuTPS-pro1 414Pink PerfectionLppTPS-pro1 411Mister SandmanLmsTPS-pro1 412Orange PlanetLopTPS-pro1 411EntertainerLeTPS-pro1 397

2.2 LhTPS啟動(dòng)子序列的多態(tài)性和系統(tǒng)進(jìn)化

DNAMAN比對(duì)發(fā)現(xiàn)，8個(gè)序列相似性為90.26%，存在核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)404個(gè)，大于5 bp的插入缺失有6處(Indel 1～6)，插入和缺失主要發(fā)生在亞洲百合和東方百合

LpmTPS

-pro、

LrlTPS

-pro和

LeTPS

-pro序列上(圖2)。就每一類群而言，2個(gè)亞洲百合間的啟動(dòng)子序列差異最大(表2)，單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)有76個(gè)，核酸多態(tài)性指數(shù)為0.053；2個(gè)喇叭百合啟動(dòng)子序列差異最小，單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)僅4個(gè)，核酸多態(tài)性指數(shù)最低，僅0.003；東喇百合單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)和核酸多態(tài)性指數(shù)介于亞洲百合和喇叭百合之間；東方百合因只有一個(gè)品種‘Entertainer’，無法計(jì)算核酸多態(tài)性，故沒有在表2 中列出。

表2 基因啟動(dòng)子的核酸多態(tài)性
Table 2 Nucleotide diversity of promoters

類型Group品種Cultivar單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)/個(gè)SNP site核酸多態(tài)性指數(shù)Nucleotidediversity (π)單倍型數(shù)量Number ofhaplotype單倍型多樣性Haplotypediversity (Hd)亞洲百合Pearl Melanie,Red Life760.05321喇叭百合Pink Perfection,Orange Planet 40.00321東喇百合Friso,Urandi,Mister Sandman650.03031

以8個(gè)百合品種

LhTPS

啟動(dòng)子核酸序列進(jìn)行進(jìn)化樹分析，可將8個(gè)品種分為4組，喇叭百合‘Pink Perfection’和‘Orange Planet’的啟動(dòng)子

LppTPS

-pro和

LopTPS

-pro為T組，東喇百合‘Friso’和‘Urandi’的啟動(dòng)子

LfTPS

-pro和

LuTPS

-pro為OT組，亞洲百合‘Pearl Melanie’和‘Red Life’的啟動(dòng)子

LpmTPS

-pro和

LrlTPS

-pro為A組，東方百合‘Entertainer’的啟動(dòng)子

LeTPS

-pro自成一組，為O組(圖3)。值得注意的是東喇百合‘Mister Sandman’與2個(gè)亞洲百合序列相似性更高，也被歸為A組。

2.3 LhTPS基因啟動(dòng)子順式作用元件

通過PlantCARE對(duì)啟動(dòng)子序列進(jìn)行順式作用元件分析，發(fā)現(xiàn)8個(gè)品種的

LhTPS

啟動(dòng)子都包括核心元件，如TATA-box和CAAT-box，主要負(fù)責(zé)基因轉(zhuǎn)錄起始的準(zhǔn)確性及高效性；還包括應(yīng)答元件，如ABRE、ARE、GATA-motif、I-box、G-box、W-box、MYC、TCT-motif和TC-rich repeats等，能被轉(zhuǎn)錄因子識(shí)別和結(jié)合，決定基因轉(zhuǎn)錄的特異性。應(yīng)答元件又可分為生長(zhǎng)發(fā)育、光響應(yīng)、脅迫響應(yīng)和激素響應(yīng)四類元件。生長(zhǎng)發(fā)育類別中，有7種順式作用元件，涉及胚乳表達(dá)(AAGAA-motif和GCN4-motif)、芽表達(dá)(As-1 element)、晝夜節(jié)律(Circadian)、開花(MRE)、衰老(W-box)和玉米醇溶蛋白代謝(O2-site)，其中O2-site占比例最高，為49%(圖4(a))。光響應(yīng)類別中，有9種順式作用元件，包括G-box、I-box、TCT-motif、GATA-motif、Box4、GT1-motif、TCCC-motif、Chs-CMA1a和ATCT-motif，其中G-box占比最大，為31%(圖4(b))。脅迫響應(yīng)類別有6種順式作用元件，分別與厭氧誘導(dǎo)(ARE)、防御應(yīng)激(TC-rich repeats、STRE)、脫水(DRE)和創(chuàng)傷(WRE3和WUN-motif)相關(guān)，其中STRE所占的比例最高，為42%(圖4(c))。激素響應(yīng)類別中的元件包括脫落酸(ABRE、ABRE3a、ABRE4)、生長(zhǎng)素(TGA-element)、赤霉素(P-box、TATC-box)、茉莉酸甲酯(MeJA，CGTCA-motif、TGACG-motif、MYC和MYB)和水楊酸(TCA-element、TCA)應(yīng)答元件，其中響應(yīng)MeJA的順式作用元件占比最大，為44%(圖4(d))，這可能預(yù)示著百合

LhTPS

受MeJA誘導(dǎo)。2個(gè)亞洲百合在起始密碼子上游400 bp之內(nèi)的G-box、CGTCA-motif、MYC作用元件中的序列與其它百合啟動(dòng)子中的序列不一致，是潛在的研究位點(diǎn)。主要順式作用元件標(biāo)注于圖2。

A：亞洲百合組；O：東方百合組；T：喇叭百合組；OT：東喇百合組。 A： Asiatic group; O： Oriental group; T： Trumpet group; OT： Orienpet group.圖3 LhTPS啟動(dòng)子系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.3 Phylogenetic tree of LhTPS promoters at the gene level

(a)、(b)、(c)和(d)分別表示生長(zhǎng)發(fā)育、光響應(yīng)、脅迫響應(yīng)和激素響應(yīng)相關(guān)順式作用元件數(shù)量及占比。

3 討 論

3.1 啟動(dòng)子克隆方法因基因而異

基于PCR擴(kuò)增的染色體步移技術(shù)提供了克隆已知序列側(cè)翼未知啟動(dòng)子的有效方法，常用的包括反向PCR法、外源接頭介導(dǎo)PCR法和半隨機(jī)引物PCR法等。百合基因組大(約36 Gb)，重復(fù)序列多，其全基因組數(shù)據(jù)至今尚未發(fā)布，克隆啟動(dòng)子有一定難度。在百合中，分別采用接頭PCR法、反向PCR法、接頭PCR和FPNI-PCR結(jié)合的方法克隆到

CHS

、

ANS

和

GPAT

基因啟動(dòng)子。本研究前期嘗試過半隨機(jī)引物PCR法，但止步于157 bp處。采用反向PCR法首先在‘Red Life’中獲得成功，但在‘Entertainer’中止步于第一步PCR。將克隆到的

TPS

啟動(dòng)子序列比對(duì)南京農(nóng)業(yè)大學(xué)滕年軍團(tuán)隊(duì)蘭州百合基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(數(shù)據(jù)尚未發(fā)表)，與基因ctg009323_np12121的相似性最高，為89.21%。在引物設(shè)計(jì)的位置存在多處變異位點(diǎn)(圖5)，可見品種或種不同，基因可能不同，啟動(dòng)子克隆的方法需在實(shí)踐的過程中進(jìn)行調(diào)整。

藍(lán)色陰影表示100%的相似性；點(diǎn)表示用于最佳對(duì)齊的間隙。 The blue shades represent 100% concordance; The dots indicate the gap for the optimal alignment.圖5 不同材料TPS啟動(dòng)子序列比對(duì)Fig.5 The promoter of TPS from different accessions

3.2 啟動(dòng)子多樣性可用于系統(tǒng)進(jìn)化研究和香型分類

基因多樣性是植物在長(zhǎng)期適應(yīng)生存環(huán)境和發(fā)展進(jìn)化的過程中獲得的，這種多樣性可能存在于基因的編碼區(qū)和非編碼區(qū)，存在于核DNA和細(xì)胞器DNA?；诤颂求w完整葉綠體基因組序列、ITS序列、細(xì)胞質(zhì)基因組序列和其他來自核基因組的分子標(biāo)記，對(duì)百合野生資源和品種所進(jìn)行的分子系統(tǒng)學(xué)研究均基本認(rèn)同百合野生資源分為Martagon、Sinomartagon、Archelirion、Pseudolirium、Lilium、Leucolirion 和Oxypetalum 7個(gè)組，由其衍生出的品種屬于A、O、T、麝香百合(L)、LA、OT和LO等雜種系。本研究獲得了8個(gè)百合品種的

LhTPS

啟動(dòng)子序列，利用這些序列所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹對(duì)所研究百合材料進(jìn)行分類，其結(jié)果與傳統(tǒng)分類結(jié)果基本一致，即亞洲百合啟動(dòng)子聚為一類，喇叭百合啟動(dòng)子聚為一類，東喇百合啟動(dòng)子聚為一類，而東方百合啟動(dòng)子單獨(dú)為一類。

TPS

基因負(fù)責(zé)將底物轉(zhuǎn)化為萜類物質(zhì)。雖然本研究并未涉及香氣成分檢測(cè)，但在百合香型分類研究中，OT類‘Pink Perfection’‘Orange Planet’的香型均為Musky scent，A類‘Pearl Melanie’的香型為Faint scented。百合香型分類研究中雖未檢測(cè)‘Red Life’的香氣，但事實(shí)上研究人員難以察覺到‘Red Life’的味道，因此，可以認(rèn)為‘Pearl Melanie’和‘Red Life’均為Faint scented香型?？梢娨?p>LhTPS

基因啟動(dòng)子序列的這兩類百合的分類結(jié)果與百合的香型分類一致。有趣的是，‘Mister Sandman’雖為OT類百合，但只有部分實(shí)驗(yàn)人員從嗅覺感知到其輕微的香味(Faint scented)，這表明依據(jù)啟動(dòng)子序列將其歸入亞洲百合組也與香型分類一致，也表明‘Mister Sandman’可能與2個(gè)亞洲百合有更近的親緣關(guān)系，但這樣的結(jié)果也可能是由于實(shí)驗(yàn)所用樣本太少造成，需要后續(xù)克隆更多材料的

LhTPS

啟動(dòng)子以進(jìn)行驗(yàn)證。

3.3 LhTPS啟動(dòng)子的多樣性可能影響基因功能

順式作用元件分析表明，8個(gè)啟動(dòng)子均含有負(fù)責(zé)基因轉(zhuǎn)錄起始的準(zhǔn)確性及高效性、負(fù)責(zé)生長(zhǎng)調(diào)控和應(yīng)激響應(yīng)的元件。在海島棉、青蒿和鐵皮石斛等物種中均發(fā)現(xiàn)

TPS

基因能受到植物激素、蟲害或病害的誘導(dǎo)，認(rèn)為

TPS

啟動(dòng)子屬于誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，百合

LhTPS

基因啟動(dòng)子也可能屬于誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。MeJA作為天然存在的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，可能參與了揮發(fā)性成分等次生代謝物的產(chǎn)生，并在生物和非生物脅迫的防御機(jī)制中發(fā)揮作用。多個(gè)研究表明，啟動(dòng)子區(qū)存在的G-box可以與茉莉酸信號(hào)通路的CGTCA或MYC元件互作，從而誘導(dǎo)

TPS

基因的上調(diào)表達(dá)，進(jìn)而增加單萜類揮發(fā)性化合物的產(chǎn)量。王紅的研究表明LoMYC2對(duì)百合花香物質(zhì)形成有積極的作用。8個(gè)百合啟動(dòng)子順式作用元件的分析表明，激素響應(yīng)類別中響應(yīng)MeJA的作用元件占比最多，預(yù)示著百合

LhTPS

可能受MeJA誘導(dǎo)。近起始密碼子端亞洲百合CGTCA-motif和MYC作用元件中的序列與其它百合啟動(dòng)子中的序列不一致，這也許與亞洲百合無香的表型相關(guān)。G-box、CGTCA-motif和MYC是否是后續(xù)研究的重點(diǎn)，尚需通過啟動(dòng)子瞬時(shí)表達(dá)及基因短截試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

4 結(jié) 論

本研究首次克隆到8個(gè)百合品種的

TPS

啟動(dòng)子序列，發(fā)現(xiàn)品種間的啟動(dòng)子序列存在豐富的多態(tài)性，并可用于百合系統(tǒng)分類研究。雖然本研究分析了啟動(dòng)子順式作用元件，并基于分析結(jié)果和前人的研究推測(cè)MeJA順式作用元件可能是

TPS

基因受到轉(zhuǎn)錄調(diào)控的關(guān)鍵元件，但并沒有進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，后續(xù)需構(gòu)建瞬時(shí)表達(dá)載體，檢測(cè)啟動(dòng)子對(duì)相關(guān)信號(hào)通路的響應(yīng)情況，為理解萜烯合成的調(diào)控機(jī)制提供較為直接的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。