某中藥育發(fā)液在體外微核試驗(yàn)中的遺傳毒性研究

熊明朋，劉寧，龔瑋，劉波

江西省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局中成藥質(zhì)量評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西省藥品與醫(yī)療器械質(zhì)量工程技術(shù)研究中心，江西 南昌 330029

據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，近年來(lái)隨著激烈的社會(huì)競(jìng)爭(zhēng)、電子設(shè)備使用率的增加以及染發(fā)燙發(fā)的流行，中國(guó)脫發(fā)人口已遠(yuǎn)超2 億，防脫育發(fā)類(lèi)產(chǎn)品已越來(lái)越受追捧。浙江某公司生產(chǎn)的育發(fā)液主要由丹參、苦參、何首烏、防風(fēng)、人參根等提取物組成，其在減少油脂分泌的同時(shí)，也能改善毛囊的生理狀態(tài)，促使毛母細(xì)胞恢復(fù)生發(fā)的功能，從而促進(jìn)頭發(fā)的再生，但是其遺傳毒性并未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。遺傳毒性試驗(yàn)用于檢測(cè)通過(guò)不同機(jī)制直接或間接誘導(dǎo)遺傳學(xué)損傷的供試品體內(nèi)和體外的試驗(yàn)，其方法有多種，其中體外哺乳動(dòng)物微核試驗(yàn)可用于檢測(cè)有絲分裂細(xì)胞暴露于供試品期間或之后致染色體斷裂和/或誘發(fā)非整倍體的能力，以評(píng)價(jià)供試品致突變的可能性。本試驗(yàn)將中國(guó)倉(cāng)鼠肺細(xì)胞株（CHL）暴露在一定濃度的育發(fā)液下進(jìn)行體外微核試驗(yàn)，評(píng)價(jià)育發(fā)液的安全性。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 主要試劑

育發(fā)液（浙江某公司生產(chǎn)，批號(hào)：20191101），環(huán)磷酰胺（CP）、絲裂霉素C（MMC）、秋水仙素、胰酶、小牛血清均購(gòu)自Sigma 公司，肌動(dòng)蛋白聚合抑制劑細(xì)胞松弛素B（cytoB）購(gòu)自大連美侖生物技術(shù)有限公司，姬姆薩染液購(gòu)自雷根生物有限公司，MEM 無(wú)血清培養(yǎng)基、MEM 完全培養(yǎng)基購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.2 主要儀器設(shè)備

酶標(biāo)儀（賽默飛世爾科技公司），BX63 雙人共覽熒光顯微鏡（奧林巴斯株式會(huì)社），電子天平［賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司］，二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱（賽默飛世爾科技公司），細(xì)胞計(jì)數(shù)器（上海睿鈺生物科技有限公司），離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）。

1.3 細(xì)胞及代謝活化系統(tǒng)

CHL 細(xì)胞株購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司，大鼠肝S9購(gòu)自瑞德肝臟疾病研究（上海）有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 S9 活化系統(tǒng)的制備取大鼠肝S91.25 mL，分別加入0.40 mol/L 的MgCl20.20 mL、1.65 mol/L 的KCl 0.20 mL、葡萄糖-6-磷酸17.91 mg、氧化型NADP 30.62 mg，最后用MEM 無(wú)血清培養(yǎng)基補(bǔ)足至10 mL。

1.4.2 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞的準(zhǔn)備取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CHL細(xì)胞，PBS 液洗滌3 次，棄去洗滌液，胰酶消化后，調(diào)整為1×105個(gè)/mL，備用。

1.4.3 供試品濃度的確定取育發(fā)液50 μL 加入9.95 mL MEM完全培養(yǎng)基溶解，配成5.000 μL/mL的溶液，再用MEM 完全培養(yǎng)基稀釋成2.500、1.250、0.625、0.313 μL/mL 的系列濃度。

在含對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞的96 孔板中，加入活化系統(tǒng)S9或不加入，接種于含上述5 種濃度梯度的供試品及陰性對(duì)照組（MEM 完全培養(yǎng)基），每組設(shè)4孔，吹打成細(xì)胞懸液，置37 ℃，5%二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 h，棄去原培養(yǎng)基，加入新鮮MEM 完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后，每孔加入20 μL 濃度為5 g/L 的MTT 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后棄去孔內(nèi)液體，加入150 μL 的DMSO，置振蕩器上振蕩10 min，在酶標(biāo)儀上雙波長(zhǎng)（570 nm、630 nm）測(cè)定吸光度，并計(jì)算相對(duì)倍增數(shù)（RPD）。RPD=受試物組細(xì)胞倍增數(shù)/陰性對(duì)照組細(xì)胞倍增數(shù)×100，細(xì)胞毒性=100 -RPD。

1.4.4 體外細(xì)胞微核試驗(yàn)［1-2］（1）培養(yǎng)3 h 方案。在含對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞的接種板中，加入適量MEM 完全培養(yǎng)基后，當(dāng)加入活化系統(tǒng)S9時(shí)，各孔加入3 種梯度（5.000 μg/mL、2.500 μg/mL、1.250 μg/mL）的供試品、陽(yáng)性對(duì)照物（60 μg/mL CP）、陰性對(duì)照物（空白MEM 完全培養(yǎng)基），每組1 孔；當(dāng)不加入活化系統(tǒng)S9時(shí)，各孔加入3 種梯度（5.000 μg/mL、2.500 μg/mL、1.250 μg/mL）的供試品、陽(yáng)性對(duì)照物（0.6 μg/mL MMC、1.0 μg/mL 秋水仙素）、陰性對(duì)照物（空白MEM 完全培養(yǎng)基），每組設(shè)2 孔，吹打成細(xì)胞懸液，置37 ℃，5%二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 h，棄去原培養(yǎng)基，加入新鮮MEM 完全培養(yǎng)基和cytoB，繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后收集細(xì)胞，并進(jìn)行消化、低滲、固定、滴片、染色，顯微鏡下各組觀察2 000 個(gè)雙核細(xì)胞，計(jì)算微核細(xì)胞率。微核細(xì)胞率=具有微核的雙核細(xì)胞數(shù)/雙核細(xì)胞數(shù)。

（2）培養(yǎng)24 h 方案。在含對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞的接種板中，加入適量MEM 完全培養(yǎng)基和cytoB，不加入活化系統(tǒng)S9，各孔加入3 種梯度（5.000 μg/mL、2.500 μg/mL、1.250 μg/mL）的供試品、陽(yáng)性對(duì)照物（0.4 μg/mL MMC）、陰性對(duì)照物（MEM 完全培養(yǎng)基），每組設(shè)2 孔，吹打成細(xì)胞懸液，置37 ℃，5%二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，棄去原培養(yǎng)基，加入新鮮MEM 完全培養(yǎng)基和cytoB，繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后收集細(xì)胞，并進(jìn)行消化、低滲、固定、滴片、染色，顯微鏡下各組各觀察2 000 個(gè)雙核細(xì)胞，計(jì)算微核細(xì)胞率。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理采用Excel 2010 軟件，使用SPSS 19.0 軟件作χ2檢驗(yàn)，將樣品各劑量組微核細(xì)胞率與陰性對(duì)照進(jìn)行比較，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 供試品溶解情況

各濃度的供試品在MEM 完全培養(yǎng)基中未見(jiàn)沉淀。

2.2 供試品細(xì)胞毒性

供試品細(xì)胞毒性見(jiàn)表1，供試品在有活化系統(tǒng)和無(wú)活化系統(tǒng)的情況下，其細(xì)胞毒性均小于10%。

表1 供試品細(xì)胞毒性結(jié)果

2.3 體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞微核試驗(yàn)結(jié)果

體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞微核試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，供試品組在有活化系統(tǒng)和無(wú)活化系統(tǒng)情況下，與陰性對(duì)照相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），陽(yáng)性對(duì)照組與陰性對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

表2 體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞微核試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

本研究所使用的育發(fā)液主要由丹參、苦參、何首烏、防風(fēng)、人參根等提取物組成，卷柏、何首烏，丹參等藥材配伍經(jīng)常用于促進(jìn)頭發(fā)生長(zhǎng)和治療脂溢性脫發(fā)［3-4］。盡管何首烏、丹參在成品膠囊中被證實(shí)無(wú)遺傳毒性［5-6］，苦參在一種水溶液中無(wú)明顯致突變作用［7］，人參粉劑也未顯示有遺傳毒性［8］，但是卷柏、防風(fēng)以及該育發(fā)液中藥提取物按照一定比例配伍，并按一定工藝加工的成品的安全性并未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。根據(jù)《化妝品注冊(cè)備案管理辦法》，育發(fā)類(lèi)產(chǎn)品屬于特殊用途化妝品，其遺傳毒性試驗(yàn)是必做項(xiàng)目之一，因此，本試驗(yàn)選擇體外哺乳動(dòng)物微核試驗(yàn)研究其遺傳毒性。

在有活化系統(tǒng)或無(wú)活化系統(tǒng)的情況下，CHL 細(xì)胞暴露在不同濃度的育發(fā)液下，細(xì)胞毒性均遠(yuǎn)小于50%，說(shuō)明在該系列濃度下，供試品沒(méi)有毒性，在以后的試驗(yàn)中，我們將考慮增加供試品濃度，直至最高劑量能引起50%～60%的細(xì)胞毒性以及其他形式的遺傳毒性研究［9-10］。在同一個(gè)劑量組下，使用活化系統(tǒng)的劑量組，相比于不使用活化系統(tǒng)的劑量組，供試品的細(xì)胞毒性更低，但相差不大，表明育發(fā)液中某些物質(zhì)不排除經(jīng)活化系統(tǒng)發(fā)生了改變，能促使毒性降低，但在體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞微核試驗(yàn)，使用活化系統(tǒng)的劑量組，相比于不使用活化系統(tǒng)的劑量組，供試品的微核率更高。并且，同一個(gè)劑量組下，不管是劑量組還是空白對(duì)照組，培養(yǎng)24 h 方案比培養(yǎng)3 h 方案的微核率都有稍許增加，暗示隨著接觸時(shí)間的增加，細(xì)胞本身的自然突變能力增加，而非供試品誘導(dǎo)突變的能力增加。另外，供試品各劑量組在有活化系統(tǒng)和無(wú)活化系統(tǒng)情況下，與陰性對(duì)照相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），陽(yáng)性對(duì)照組與陰性對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），表明供試品在5.000 μL/mL、2.500 μL/mL、1.250 μL/mL 的情況下，體外對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞致突變性為陰性。

本研究表明，某中藥育發(fā)液在5.000 μL/mL、2.500 μL/mL、1.250 μL/mL 的情況下，體外對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞沒(méi)有致突變性。