蘿卜肉質(zhì)根糖含量相關(guān)性狀的關(guān)聯(lián)位點(diǎn)分析

高明剛，劉 鎰，王瑞華，韓 敏，李媛媛

(濰坊學(xué)院 生物與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院 山東省高校生物化學(xué)與分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濰坊 261061)

蘿卜(Raphanussativus)是原產(chǎn)于我國(guó)的一種以肉質(zhì)根為主要食用部位的大眾化蔬菜，其營(yíng)養(yǎng)豐富，應(yīng)用廣泛，可熟食、生食和加工，并具有較高的藥用價(jià)值，被譽(yù)為“小人參”。蘿卜肉質(zhì)根中的糖含量是決定蘿卜品質(zhì)和商品價(jià)值的重要因子，不僅顯著影響其營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)，還與風(fēng)味品質(zhì)、加工品質(zhì)等密切相關(guān)[1]。在蘿卜選育過(guò)程中主要依賴品嘗鑒評(píng)對(duì)該性狀進(jìn)行選擇，缺乏準(zhǔn)確性和預(yù)見(jiàn)性，且蘿卜辣味常常掩蓋甜味，造成選擇結(jié)果錯(cuò)誤[2]。因此從分子水平開(kāi)展蘿卜肉質(zhì)根糖含量相關(guān)性狀研究，并開(kāi)發(fā)有效的分子標(biāo)記具有非常重要的現(xiàn)實(shí)意義。

目前，有關(guān)植物糖含量性狀機(jī)理的研究已經(jīng)取得了較大的進(jìn)展。Islam等[3]從柑橘中克隆了編碼蔗糖合酶(sucrose synthase,SUSY)的6個(gè)基因，發(fā)現(xiàn)這些基因與柑橘果實(shí)的糖含量密切相關(guān)。在西瓜[4]和甜瓜[5]中的研究也發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)編碼液泡膜糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(tonoplast sugar transporter,TST)的基因能夠增加果實(shí)中的可溶性糖含量。Sui等[6]通過(guò)全基因組關(guān)聯(lián)分析(genome-wide association studies,GWAS)鑒定出來(lái)源于10個(gè)基因的35個(gè)SNP(single nucleotide polymorphisms)標(biāo)記與大豆蔗糖含量緊密關(guān)聯(lián)。Tieman等[7]基于GWAS技術(shù)在番茄9號(hào)和11號(hào)染色體中檢測(cè)到2個(gè)與葡萄糖和果糖含量顯著關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)，并對(duì)位于9號(hào)染色體的位點(diǎn)進(jìn)行深入分析，發(fā)現(xiàn)位于Lin5基因366位的SNP位點(diǎn)突變，由天冬酰胺(Asn)突變?yōu)樘於彼?Asp)，且突變植株中糖含量更高。

相對(duì)于其他植物，蘿卜肉質(zhì)根糖含量的研究進(jìn)展則嚴(yán)重滯后，目前仍主要集中在不同條件下糖含量的變化[8-11]、最適遺傳模型[1,12]等研究。本試驗(yàn)以134份蘿卜品種為研究材料，分別于2015-2017年在山東濰坊種植，在收獲期對(duì)其肉質(zhì)根的果糖、葡萄糖、蔗糖、可溶性總糖含量和甜度值進(jìn)行分析，利用SSR標(biāo)記進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，檢測(cè)與蘿卜肉質(zhì)根糖含量性狀顯著關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)，以期為蘿卜品質(zhì)改良提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選用來(lái)自不同地區(qū)的蘿卜品種共134份，作為自然群體。其中，北京品種34份，山東品種25份，湖北品種11份，廣東品種8份，河北品種6份，吉林、江蘇、天津和浙江品種各5份，遼寧品種4份，河南、重慶、四川品種各3份，沈陽(yáng)品種2份，江西、福建、安徽品種各1份，外國(guó)品種12份(表1)。134份蘿卜品種于2015年、2016年和2017年連續(xù)3年種植在山東濰坊寒亭區(qū)試驗(yàn)場(chǎng)。每年8月中旬播種，待蘿卜肉質(zhì)根成熟時(shí)，每個(gè)品種取3個(gè)蘿卜，洗凈擦干后，切取肉質(zhì)根中間部分進(jìn)行混合取樣。樣品貯藏于-20 ℃?zhèn)錅y(cè)。

表1 供試的134份蘿卜品種Table 1 A total of 134 radish varieties used in this study

表1(續(xù)) Continued table 1

表1(續(xù)) Continued table 1

1.2 糖含量測(cè)定

采用高效液相色譜(HPLC)法測(cè)定蘿卜肉質(zhì)根中的蔗糖、果糖和葡萄糖含量。糖提取和HPLC測(cè)定步驟參照李媛媛等[13]的方法?？扇苄钥偺呛?total sugar content,TS)=果糖+葡萄糖+蔗糖[14]。甜度值(sweetness index,SI)=蔗糖含量×1.00+果糖含量×1.75+葡萄糖含量×0.70[15]。

1.3 表型數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

利用SPSS 20.0軟件對(duì)134份蘿卜品種的5個(gè)糖含量性狀(蔗糖、果糖、葡萄糖、TS和SI)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)、方差分析和相關(guān)性分析。各性狀的廣義遺傳力根據(jù)公式HB2=σg2/(σg2+σe2)計(jì)算，其中HB2表示廣義遺傳力，σg2表示遺傳方差，σe2表示環(huán)境方差[16]。

1.4 SSR標(biāo)記分析

采用CTAB小樣法[17]提取蘿卜葉片DNA。SSR引物預(yù)篩選用1.2%瓊脂糖，SSR引物垂直電泳篩選和群體擴(kuò)增檢測(cè)用6%聚丙烯酰胺凝膠，顯色方法為銀染法。本試驗(yàn)所選用的400對(duì)SSR引物均來(lái)源于公開(kāi)發(fā)表的文獻(xiàn)[18-22]。引物序列由青島擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成。

SSR產(chǎn)物群體擴(kuò)增的聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果統(tǒng)計(jì)采用“0，1”法，有條帶為“1”，無(wú)條帶為“0”。同一個(gè)引物擴(kuò)增產(chǎn)物在材料中的不同位點(diǎn)，按照條帶長(zhǎng)度由大到小分別記為“a”、“b”、“c”等。利用PowerMarker V3.25軟件[23]對(duì)SSR分子標(biāo)記數(shù)據(jù)進(jìn)行多態(tài)性分析，計(jì)算基因多樣性指數(shù)與多態(tài)性信息含量(polymorphism information content,PIC)。

1.5 群體結(jié)構(gòu)分析和關(guān)聯(lián)分析

基于獲得的SSR分子標(biāo)記數(shù)據(jù)，利用Structure 2.3.4軟件[24]進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析。將起始不作數(shù)迭代和不作數(shù)迭代后的MCMC分別設(shè)置為50 000和500 000次，類群數(shù)K設(shè)置為1～10，重復(fù)5次，以獲取材料相應(yīng)的Q矩陣。然后根據(jù)Evanno等[25]的方法確定群體的最佳K值。

利用Spagedi程序[26]計(jì)算134份蘿卜品種的Kinship矩陣。將得到的Q矩陣和Kinship矩陣作為協(xié)變量，利用Tassel 3.0軟件[27]的混合線性模型(MLM)對(duì)標(biāo)記與所測(cè)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，P≤0.01認(rèn)為標(biāo)記與性狀存在顯著關(guān)聯(lián)。

1.6 電子定位

根據(jù)SSR引物序列，利用Primer-BLAST在線程序(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)與蘿卜基因組序列進(jìn)行序列比對(duì)，獲取各標(biāo)記位點(diǎn)在基因組上的定位信息。

2 結(jié)果與分析

2.1 134份蘿卜品種肉質(zhì)根中的糖含量分析

分別于2015―2017年連續(xù)3年田間種植134份蘿卜品種，利用HPLC法測(cè)定成熟蘿卜肉質(zhì)根中的果糖、葡萄糖和蔗糖含量，計(jì)算蘿卜肉質(zhì)根中可溶性總糖含量和甜度值，同時(shí)根據(jù)不同年份間的數(shù)據(jù)，對(duì)以上5個(gè)性狀的基因型方差、環(huán)境方差、變異系數(shù)和廣義遺傳力進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果如表2所示。表2表明，連續(xù)3年內(nèi)5個(gè)糖含量相關(guān)性狀及其平均值都呈現(xiàn)出了較大的變異，變異均達(dá)到極顯著水平(P≤0.01)。各個(gè)性狀的廣義遺傳力為30.67%～60.10%，其中甜度值的廣義遺傳力最高(60.10%)，其次為葡萄糖(53.79%)、可溶性總糖(48.51%)和果糖(40.73%)，而蔗糖的廣義遺傳力最小，僅為30.67%。

相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，除果糖與蔗糖為顯著正相關(guān)外(P≤0.05)，其他性狀之間都表現(xiàn)出極顯著正相關(guān)關(guān)系(P≤0.01)(表3)，表明各種糖含量相關(guān)性狀間存在互相聯(lián)系，某種程度上可能存在相同或相似的調(diào)控基因。

表2 134份蘿卜品種肉質(zhì)根中糖含量相關(guān)性狀表型數(shù)據(jù)Table 2 Statistics of phenotypic traits for sugar variables in 134 radish varieties

表3 134份蘿卜品種肉質(zhì)根中5個(gè)糖含量性狀間的相關(guān)性Table 3 Correlation coefficients among five sugar variables in 134 radish varieties

2.2 134份蘿卜品種的SSR標(biāo)記分析

根據(jù)公開(kāi)發(fā)表的SSR標(biāo)記信息，設(shè)計(jì)合成400對(duì)SSR引物。經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳初步檢測(cè)，得到能擴(kuò)增出清晰條帶的199對(duì)SSR引物；再對(duì)199對(duì)SSR引物進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，最終選用了重復(fù)性好、條帶清晰的156對(duì)SSR引物。再用156對(duì)SSR引物對(duì)134份蘿卜材料進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)獲得了349個(gè)多態(tài)性標(biāo)記。圖1給出了部分標(biāo)記瓊脂糖凝膠電泳篩選、聚丙烯酰胺凝膠電泳篩選及群體擴(kuò)增結(jié)果。

對(duì)獲得的349個(gè)多態(tài)性標(biāo)記進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，平均每對(duì)引物擴(kuò)增得到2.237個(gè)等位變異，變異值為1～4個(gè)。SSR引物的PIC為0.106～0.864，平均為0.498；基因多樣性指數(shù)為0.112～0.877，平均值為0.542(圖2)。

A.瓊脂糖凝膠電泳篩選的部分標(biāo)記；B.聚丙烯酰胺凝膠電泳篩選的部分標(biāo)記；C.引物PR039在部分材料中的擴(kuò)增檢測(cè)。a，b.表型差異大的2份材料；1～44.包含134份蘿卜品種的自然群體中的部分材料；M.分子量標(biāo)準(zhǔn)A.Screening of partial markers by agarose gel electrophoresis;B.Screening of partial markers by PAGE electrophoresis; C.PCR products electrophoresis of marker PR039 in partial varieties.a,b.Varieties with extremely different phenotypic traits；1-44.Partial of 134 cultivars in radish natural population;M.Marker

圖2 156對(duì)SSR標(biāo)記的基因多樣性(A)與多態(tài)性信息含量(B)頻數(shù)分布圖Fig.2 Gene diversity (A) and PIC frequency (B) profiles of 156 SSR markers

2.3 134份蘿卜品種的群體結(jié)構(gòu)分析

利用軟件Structure 2.3.4對(duì)134個(gè)蘿卜品種的群體結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。模擬類群數(shù)設(shè)為K，當(dāng)K=1～10時(shí)，ΔK在K=2時(shí)出現(xiàn)最高峰(圖3-A)，因此將這些蘿卜材料劃分為2個(gè)亞群(Pop1和Pop2)，群體結(jié)構(gòu)圖如圖3-B所示。其中亞群1(Pop1)包含46個(gè)蘿卜品種，對(duì)應(yīng)表1中1～46號(hào)品種；亞群2(Pop2)包含88個(gè)蘿卜品種，對(duì)應(yīng)表1中47～134號(hào)品種，且亞群分類與地理來(lái)源無(wú)明顯對(duì)應(yīng)關(guān)系。

圖3 134 份蘿卜品種的K值與ΔK值變化圖(A)和群體結(jié)構(gòu)圖(B)Fig.3 Magnitude of ΔK as a function of K (A) and population structure (B) for 134 radish varieties

2.4 SSR標(biāo)記與蘿卜品種糖含量性狀的關(guān)聯(lián)分析

基于混合線性模型MLM(Q+K)，利用獲得的349個(gè)多態(tài)性標(biāo)記對(duì)2015-2017年3年內(nèi)134份蘿卜肉質(zhì)根糖含量相關(guān)性狀及其3年平均值進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果(表4)發(fā)現(xiàn)，5個(gè)糖含量相關(guān)性狀共關(guān)聯(lián)到61個(gè)位點(diǎn)，其中與葡萄糖含量關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)最多，達(dá)16個(gè)；與果糖含量關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)最少，為9個(gè)。單個(gè)關(guān)聯(lián)標(biāo)記位點(diǎn)解釋的表型變異值為5.19%～16.29%。

由表4可見(jiàn)，與果糖含量關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)有9個(gè)，2015年關(guān)聯(lián)3個(gè)，2016年關(guān)聯(lián)1個(gè)，2017年關(guān)聯(lián)2個(gè)，3年平均值關(guān)聯(lián)5個(gè)，其中標(biāo)記NRSr_417b在2017年和3年平均值中能同時(shí)被檢測(cè)到，標(biāo)記PR015a在2015年和3年平均值中也能同時(shí)被檢測(cè)到。與葡萄糖含量關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)有16個(gè)，2015年關(guān)聯(lián)7個(gè)，2017年關(guān)聯(lián)5個(gè)，3年平均值關(guān)聯(lián)4個(gè)，但在2016年未檢測(cè)到關(guān)聯(lián)標(biāo)記，且沒(méi)有1個(gè)標(biāo)記能夠被重復(fù)檢測(cè)到。與蔗糖含量關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)有13個(gè)，2015年關(guān)聯(lián)6個(gè)，2016年關(guān)聯(lián)1個(gè)，2017年關(guān)聯(lián)4個(gè)，3年平均值關(guān)聯(lián)9個(gè)，其中標(biāo)記NRSr_730b在2015年、2017年和平均值中能同時(shí)被檢測(cè)到，NRSr_767a、NRSr_71d和NRSr_230b 3個(gè)標(biāo)記在2017年和平均值中能同時(shí)被檢測(cè)到，NRSr_240c和NRSr_389a 2個(gè)標(biāo)記在2015年和平均值中能同時(shí)被檢測(cè)到。與可溶性總糖含量關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)有10個(gè)，2015年檢測(cè)到4個(gè)，2017年檢測(cè)到5個(gè)，平均值檢測(cè)到1個(gè)，而2016年未檢測(cè)到關(guān)聯(lián)位點(diǎn)，且沒(méi)有1個(gè)關(guān)聯(lián)位點(diǎn)能夠被重復(fù)檢測(cè)到。與甜度值關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)有13個(gè)，其中2015年檢測(cè)到4個(gè)關(guān)聯(lián)位點(diǎn)，2016年檢測(cè)到1個(gè)關(guān)聯(lián)位點(diǎn)，2017年檢測(cè)到5個(gè)關(guān)聯(lián)位點(diǎn)，平均值檢測(cè)到4個(gè)關(guān)聯(lián)位點(diǎn)，標(biāo)記NRSr_417b在2017年和平均值中能同時(shí)被檢測(cè)到。

表4 134份蘿卜品種糖含量性狀顯著相關(guān)的SSR位點(diǎn)Table 4 Loci associated with sugar variables of 134 varieties

表4(續(xù)) Continued table 4

此外，本研究中還發(fā)現(xiàn)14個(gè)分子標(biāo)記具有“一因多效”現(xiàn)象(表5)。如標(biāo)記NRSr_292能同時(shí)與果糖、葡萄糖、可溶性總糖含量及甜度值4個(gè)性狀關(guān)聯(lián)，標(biāo)記NRSr_71d和NRSr_730b能同時(shí)與葡萄糖、蔗糖、可溶性總糖含量及甜度值相關(guān)聯(lián)。

表5 與糖含量性狀顯著相關(guān)的“一因多效”標(biāo)記信息Table 5 Pleiotropic markers associated with sugar variables

3 討論與結(jié)論

前人研究表明，許多植物的糖含量相關(guān)性狀是典型的數(shù)量性狀，由多個(gè)基因控制[28-31]。本研究也發(fā)現(xiàn)，不同蘿卜材料中蔗糖、果糖、葡萄糖、TS和SI都表現(xiàn)出連續(xù)性變化趨勢(shì)，基本符合正態(tài)分布，因此認(rèn)為蘿卜肉質(zhì)根中這5個(gè)糖含量相關(guān)性狀也是數(shù)量性狀，是由多個(gè)基因共同作用的。糖含量相關(guān)性狀的遺傳力研究是對(duì)其進(jìn)行遺傳改良的基礎(chǔ)，此類研究受到了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注[30-33]。本研究發(fā)現(xiàn)，蔗糖、果糖、葡萄糖、可溶性總糖(TS)和甜度值(SI)的廣義遺傳力(HB2)分別為30.67%，40.73%，53.79%，48.51%和60.10%。這與任喜波等[12]在蘿卜中的研究結(jié)果(可溶性糖、果糖和蔗糖的HB2分別為44.29%，50.08%和47.24%)相近。以上結(jié)果表明，蘿卜中糖含量相關(guān)性狀是典型的數(shù)量性狀，雖受環(huán)境影響較大，但也有較強(qiáng)的遺傳效應(yīng)。

關(guān)聯(lián)分析是從分子水平研究數(shù)量性狀的主要方法之一。目前，該方法已應(yīng)用于植物糖含量相關(guān)性狀機(jī)理研究。如Ferro等[34]利用80 591個(gè)SNPs標(biāo)記進(jìn)行GWAS分析，發(fā)現(xiàn)有3個(gè)標(biāo)記與四倍體藍(lán)莓的可溶性固形物含量密切相關(guān)。Fickett等[31]研究發(fā)現(xiàn)56個(gè)標(biāo)記與甘蔗糖含量相關(guān)性狀緊密關(guān)聯(lián)。Sui等[6]通過(guò)GWAS分析鑒定出了來(lái)源于10個(gè)基因的35個(gè)SNP標(biāo)記與大豆蔗糖含量緊密關(guān)聯(lián)。Tieman等[7]在9號(hào)和11號(hào)染色體中檢測(cè)到2個(gè)與番茄葡萄糖和果糖含量顯著關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)。

本研究利用SSR標(biāo)記對(duì)蘿卜肉質(zhì)根5個(gè)糖含量相關(guān)性狀進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析，共關(guān)聯(lián)到61個(gè)位點(diǎn)。單個(gè)關(guān)聯(lián)標(biāo)記位點(diǎn)的貢獻(xiàn)率為5.19%～16.29%，絕大多數(shù)位點(diǎn)的貢獻(xiàn)率在10%以下。這可能是因?yàn)樵撐稽c(diǎn)本身為微效等位基因所致，也可能是因?yàn)樵撐稽c(diǎn)并非真正的目標(biāo)位點(diǎn)，而只是與目標(biāo)位點(diǎn)處于同一LD水平[35]。此外，也有研究表明，在自然群體中檢測(cè)到的單個(gè)效應(yīng)值會(huì)相對(duì)偏小[36]。

在與葡萄糖關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)中，NRSr_663b標(biāo)記是一個(gè)EST-SSR標(biāo)記，經(jīng)過(guò)電子定位，發(fā)現(xiàn)其位于基因ERD6-like4(sugar transporter ERD6-like4)中。ERD6-like是一類單糖轉(zhuǎn)運(yùn)子[37]。Yamada等[38]推測(cè)，該類基因可能具有通過(guò)與植物細(xì)胞中的液泡轉(zhuǎn)化酶協(xié)同反應(yīng)來(lái)調(diào)節(jié)糖的再分配和細(xì)胞滲透壓的作用。Zhang等[39]研究認(rèn)為，BnERD6-like14可能參與了油菜中庫(kù)器官的糖卸載過(guò)程。本研究中，ERD6-like4(NRSr_663b)是葡萄糖3年平均值的關(guān)聯(lián)位點(diǎn)，可以解釋變異率的5.38%。推測(cè)該基因可能參與了蘿卜肉質(zhì)根中葡萄糖含量的形成。

Fickett等[31]研究發(fā)現(xiàn)，與甘蔗糖含量相關(guān)性狀關(guān)聯(lián)的SNP標(biāo)記中，大多數(shù)標(biāo)記存在“一因多效”現(xiàn)象。本研究發(fā)現(xiàn)，糖含量相關(guān)性狀之間存在明顯的相關(guān)關(guān)系，在遺傳基礎(chǔ)上也存在“一因多效”，如位于3號(hào)染色體的NRSr_292標(biāo)記同時(shí)與果糖、葡萄糖、可溶性總糖、甜度值密切相關(guān)；分別位于4號(hào)和9號(hào)染色體的NRSr_71d和NRSr_730b，也都與葡萄糖、蔗糖、可溶性總糖和甜度值關(guān)聯(lián)。該結(jié)果表明，蘿卜肉質(zhì)根糖含量相關(guān)性狀之間存在一定的遺傳相關(guān)性。

本研究中，僅有1個(gè)與蔗糖含量相關(guān)的標(biāo)記(NRSr_730b)能夠在不同年份中被檢測(cè)到。這表明蘿卜糖含量性狀的分子機(jī)理具有很大的復(fù)雜性，環(huán)境和基因型的互作可能對(duì)糖含量相關(guān)性狀影響較大，且這些關(guān)聯(lián)位點(diǎn)的檢測(cè)與環(huán)境條件和試驗(yàn)條件密切相關(guān)。

綜上，本研究在包含134份蘿卜品種的自然群體中，利用349個(gè)SSR標(biāo)記對(duì)蘿卜肉質(zhì)根果糖、葡萄糖、蔗糖、可溶性總糖含量和甜度值進(jìn)行了GWAS分析。在P≤0.01閾值下共獲得了61個(gè)關(guān)聯(lián)位點(diǎn)，單個(gè)位點(diǎn)貢獻(xiàn)率為5.19%～16.29%，其中有14個(gè)關(guān)聯(lián)位點(diǎn)存在“一因多效”現(xiàn)象。