火烈鳥腹瀉沙門菌分離鑒定、致病性及耐藥性檢測(cè)

鄧麗玲 汪明權(quán) 李雨芮

(武漢動(dòng)物園，武漢，430000)

火烈鳥(Phoenicopterusruber)是鸛形目(Ciconiiformes)紅鸛科(Phoenicopteridae)的一種大型水鳥，亦稱紅鸛，主要分布于非洲、中南美洲和印度等部分亞熱帶地區(qū)的溫?zé)釒}水湖泊、沼澤及礁湖的淺水地帶，主要靠濾食藻類、小蝦、蛤蜊和昆蟲等生物為生，性怯懦，喜群棲，極具觀賞性，常在動(dòng)物園被人工養(yǎng)殖與繁育[1-3]。

沙門菌(Salmonella)具有廣泛的宿主性，可以感染多種動(dòng)物和人，主要引起不同宿主的敗血癥、腹瀉、腸炎及流產(chǎn)等，感染率和死亡率均較高，是臨床中重要的人畜共患病原菌[1-3]。沙門菌血清型繁多，引起動(dòng)物和人發(fā)病的沙門菌血清型目前有2 523個(gè)，是重要的食源性病原菌，該菌可以通過運(yùn)輸?shù)膭?dòng)物和未煮熟的動(dòng)物食品傳播，對(duì)人的危害也較大，成為公共衛(wèi)生研究的熱點(diǎn)問題[4-5]。目前，服用抗生素是控制沙門菌感染的主要手段之一，抗生素的濫用造成了沙門菌的耐藥現(xiàn)象日趨嚴(yán)重，沙門菌在抗生素的壓力選擇下產(chǎn)生嚴(yán)重的耐藥性及交叉耐藥性，成為多重耐藥菌菌株，給臨床中沙門菌的防控帶來一定的困難，造成藥物殘留，危害生物的身體健康[6-8]。因此，對(duì)沙門菌的合理防控具有重要意義。國內(nèi)關(guān)于獸類、禽類的沙門菌研究較多，但致火烈鳥腹瀉的沙門菌未見報(bào)道。

本研究對(duì)動(dòng)物園中患腹瀉火烈鳥的102份糞便、肛拭子和死亡個(gè)體的肝臟等病料組織進(jìn)行沙門菌分離鑒定，對(duì)其致病性及耐藥性進(jìn)行檢測(cè)，以期為動(dòng)物園中火烈鳥沙門菌的防控提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來源

2016—2020年，采集動(dòng)物園中患腹瀉火烈鳥的糞便、肛拭子和死亡火烈鳥的肝臟等病料組織102份。

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

20 g左右的昆明系小白鼠450只，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，由武漢動(dòng)物園飼養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌分離與鑒定

將火烈鳥的病料組織樣品處理后，接種于沙門菌增菌液(TTB)中，37 ℃震蕩培養(yǎng)8～12 h，取培養(yǎng)的菌液接種于鑒定培養(yǎng)基(沙門菌顯色培養(yǎng)基)中進(jìn)行鑒別培養(yǎng)，在恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)12～18 h，挑單菌落純化培養(yǎng)，進(jìn)一步觀察形態(tài)，進(jìn)行生化特性鑒定。

1.2.2 細(xì)菌PCR鑒定

參考胡建樂[9]、吳曉君等[10]的方法，根據(jù)GenBank中沙門菌基因序列設(shè)計(jì)沙門菌鑒定引物invA，F(xiàn)：5′-ACAGTGCTCGTTTACGACCTGAAT-3′，R：5′-AGACGACTGGTACTGATCGATAAT-3′，引物片段大小為241 bp，沙門菌的鑒定引物由深圳華大基因股份有限公司合成。分離得到的菌株采用水煮法提取基因組DNA，以提取的基因組DNA為模板，用鑒定引物進(jìn)行PCR鑒定。將分離菌株的PCR產(chǎn)物回收送華大基因測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與GenBank中登錄的參考株同源性比對(duì)鑒定。判定標(biāo)準(zhǔn)：同源性≥99.0%，可以定義到種的水平；若在97.0%～98.9%，定義到屬的水平；若小于97.0%，定義為科的水平。

1.2.3 致病性試驗(yàn)

從火烈鳥的病料組織中分離的菌株純化培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，采用平板菌落計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)菌落，每株分離菌株通過灌胃攻毒方式攻毒5只小白鼠，劑量為0.25 mL(107cfu/mL)，對(duì)照組的小白鼠灌胃等量的無菌營養(yǎng)肉湯，觀察6 d，每天記錄小白鼠的發(fā)病與死亡情況，對(duì)攻毒死亡的小白鼠剖檢并進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定。

1.2.4 藥敏試驗(yàn)

參照美國臨床檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(NCCLS)推薦的標(biāo)準(zhǔn)K-B紙片法進(jìn)行操作與結(jié)果判定。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)

在沙門菌顯色培養(yǎng)基上，疑似沙門菌的分離菌株長出邊緣整齊、大小一致的藍(lán)紫色菌落，染色鏡檢可見無莢膜、兩端鈍圓的陰性短桿菌，通過生化試驗(yàn)初步鑒定分離的89株菌株為沙門菌。

2.2 細(xì)菌PCR鑒定

對(duì)生化試驗(yàn)初步鑒定的89株沙門菌，用invA基因引物對(duì)進(jìn)行PCR鑒定。結(jié)果顯示，從臨床中分離的89株沙門菌菌株均擴(kuò)增出大約為241 bp的目的條帶，與預(yù)期相符(圖1)。這89株沙門菌invA基因測(cè)序結(jié)果與GenBank參考株的同源性均在97.9%～99.9%，說明其為沙門菌。

圖1 細(xì)菌PCR鑒定結(jié)果Fig.1 PCR identification results of bacteria 注：M.DL2000 DNA Marker；1.空白對(duì)照；2～9.分離菌株 Note：M，DL2000 DNA Marker.1，Blank control.2-9，Isolated strains

2.3 細(xì)菌致病性

攻毒組的小白鼠采食量減少，精神沉郁，扎堆與寒顫，水樣腹瀉，個(gè)別的出現(xiàn)急性死亡。試驗(yàn)結(jié)束(6 d)，對(duì)照組小白鼠健康存活，未出現(xiàn)發(fā)病及死亡情況。通過細(xì)菌分離鑒定，從發(fā)病死亡的小白鼠體內(nèi)分離得到沙門菌。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)75株沙門菌能引起小鼠發(fā)病。

2.4 藥敏試驗(yàn)

對(duì)分離的75株致病性沙門菌藥敏試驗(yàn)，結(jié)果由表1可知，這些沙門菌耐藥性嚴(yán)重，對(duì)鏈霉素、阿莫西林、氨芐西林、新霉素、慶大霉素、氟苯尼考、阿米卡星、磺胺間甲氧嘧啶和紅霉素9種藥物耐藥率較高，為77.3%～98.7%；對(duì)多西環(huán)素、環(huán)丙沙星、氨曲南、大觀霉素和多黏菌素5種藥物的耐藥率為45.3%～64.0%；對(duì)頭孢噻呋、頭孢噻肟、恩諾沙星和林可霉素4種藥物的耐藥率較低，為13.3%～22.7%。

表1 火烈鳥腹瀉沙門菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2.5 多重耐藥性

由表2可知，臨床中分離的75株沙門菌呈現(xiàn)多重耐藥性，耐17種藥物有1株，耐16、7種藥物各3株，耐15、9、6種藥物各4株，耐14、8種藥物各有6株，耐13種藥物有5株，耐12、11、10 種藥物分離菌株最多，分別占分離菌株的16.0%、18.7%和17.3%。

表2 火烈鳥腹瀉沙門菌的多重耐藥性檢測(cè)結(jié)果

3 討論

禽類是沙門菌主要的感染宿主，也是攜帶者、傳播者。沙門菌既能水平傳播，又能垂直傳播，攜帶沙門菌的禽類可以通過多種途徑傳染給其他禽類或通過卵傳播給下一代，沙門菌在不同禽類養(yǎng)殖過程中廣泛傳播，危害較大[6-9]。沙門菌具有多種血清型且具有地區(qū)性，給疫苗研制帶來一定困難，也是導(dǎo)致該菌在禽類養(yǎng)殖過程中廣泛流行的一個(gè)重要的因素[9-12]。因此，對(duì)沙門菌凈化與防控具有重要的意義，2016—2020年，筆者在動(dòng)物園患腹瀉火烈鳥的糞便、肛拭子和死亡火烈鳥的肝臟等102份病料組織中分離得到89株沙門菌，其中75株沙門菌對(duì)小白鼠具有致病性，說明動(dòng)物園中火烈鳥沙門菌感染嚴(yán)重，存在一定的潛在威脅。動(dòng)物園中火烈鳥感染的沙門菌可能來源于環(huán)境中的糞便或者水源，在防控時(shí)應(yīng)該注意糞便的無公害化處理和環(huán)境消毒，以及水源的凈化與消毒。

沙門菌耐藥性問題很普遍，通過多種途徑在動(dòng)物和人之間傳播，經(jīng)成為公共衛(wèi)生問題[13-14]。本研究表明，分離的75株沙門菌對(duì)常用的抗生素產(chǎn)生了很強(qiáng)的耐藥性，呈現(xiàn)多重耐藥性，耐12、11、10種藥物的分離菌株最多，說明動(dòng)物園中火烈鳥源沙門菌耐藥性是普遍存在的，應(yīng)該引起重視，注意環(huán)境凈化與病情防控，合理使用抗生素。