兩例黃金蟒死亡病例的病理診斷分析

田馨媛 陳海良 李 勝 劉天龍*

(1.中國農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，北京，100193；2.北京綠野晴川動物園有限公司，北京，102602；3.大興區(qū)畜禽繁育改良指導站，北京，102602)

黃金蟒(Pythonbivittatus)也稱白化緬甸蟒，屬國家二級重點保護野生動物[1]和《瀕危野生動植物種國際貿(mào)易公約》(CITES)附錄Ⅱ限制國際貿(mào)易的受保護動物。緬甸蟒作為變溫動物，在外界環(huán)境溫度低于所需最低溫度或發(fā)生劇烈變化時極易發(fā)生消化道和呼吸系統(tǒng)疾病，感染性肺炎是最嚴重的疾病之一[2]。本研究對2條死亡的圈養(yǎng)黃金蟒進行了病理學檢查，在肺臟中分離出1株銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)與1株糞產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenesfaecalis)，對2菌株的耐藥情況進行了研究。黃金蟒的死亡原因最終診斷為上述2種細菌引起的化膿性肺炎，希望本研究可以為圈養(yǎng)蛇類的飼養(yǎng)管理、疾病防治和野生蛇類的保護提供參考。

1 材料與方法

1.1 病例背景

病例來自北京野生動物園，其中雌黃金蟒冬眠后，持續(xù)狀態(tài)不佳、精神沉郁，雄黃金蟒后發(fā)病，癥狀相似，后食欲廢絕，最終死亡。

1.2 組織病理學檢查

對死亡黃金蟒尸體剖檢，取主要臟器在4%甲醛溶液中充分固定后，常規(guī)方法制作石蠟切片，HE染色，重點觀察肺臟、心臟、肝臟、腎臟、脾臟和雌性輸卵管的組織病理學變化。

1.3 細菌分離培養(yǎng)與鏡檢

肺臟、肝臟和腎臟細菌劃線培養(yǎng)，用普通營養(yǎng)瓊脂37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，并使用NB肉湯增菌培養(yǎng)，分離出2種細菌，對分離獲得的細菌單菌落進行革蘭染色和鏡檢。

1.4 體外藥敏試驗(紙片法)

取2種細菌的純培養(yǎng)物倍比稀釋、涂布，選擇1×106cfu/mL的細菌懸液，用8種藥敏紙片做藥物敏感性試驗，測量抑菌圈直徑，確定2種分離菌株對各種藥物的敏感性。

1.5 細菌16S rRNA基因序列測定與同源性比對

將分離到的2菌株純培養(yǎng)物提供給北京六合華大基因科技有限公司進行基因組DNA提取及16S rRNA基因擴增。PCR擴增引物為27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)。PCR擴增反應體系(總體積25 μL)：PCR Mix 21 μL，上、下游引物各1 μL，模板2 μL。PCR反應條件：96 ℃預變性5 min；96 ℃變性20 s，62 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環(huán)；72 ℃終延伸10 min；4 ℃保存。目標條帶大小為1 500 bp左右。PCR產(chǎn)物檢測及純化：取3 μL PCR產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠檢測，觀察條帶性狀。PCR產(chǎn)物純化按照磁珠純化標準流程操作。將純化后的 PCR 產(chǎn)物上機檢測，測序引物分別使用V4-515F(5′-GTGCCAGCAGCCGCGGTAA-3′)和V4-806R(5′-GGACTACCAGGGTATCTAA-3′)，測序結(jié)果在NCBI-BLAST中比對。

2 結(jié)果與分析

2.1 剖檢變化

尸體剖檢發(fā)現(xiàn)雌黃金蟒泄殖孔流出紅色液體，伴有惡臭氣味。剝離皮膚后發(fā)現(xiàn)胸腹腔壁淤血、壞死(圖1A)；打開胸腹腔見肺臟廣泛性壞死、化膿，在肺的中央管腔內(nèi)有柱狀膿性分泌物(圖1B、C，膿性分泌物如B箭頭處所示)；輸卵管壞死，化膿嚴重，可見數(shù)枚腐爛卵。

圖1 黃金蟒尸體剖檢結(jié)果Fig.1 Autopsy results of the golden python

2.2 黃金蟒的組織病理學檢查

黃金蟒肺臟可見肺泡腔狹窄，肺泡壁增厚，肺泡腔內(nèi)有粉紅色滲出物(圖2A)，部分區(qū)域可見大量細菌團塊(圖2B)。一蟒肝臟肝索紊亂，肝細胞廣泛性變性、壞死，脂褐素沉著(圖2C)，另一蟒肝臟局部出血、肝細胞脂肪變性(圖2D)。脾臟紅髓與白髓分界不清(圖2E)。腎臟可見腎小球毛細血管基膜增厚(圖2F)，腎小管上皮細胞變性、壞死、脫落、細胞核溶解，間質(zhì)增寬見粉紅色液體(圖2G)。雌蟒輸卵管黏膜上皮結(jié)構(gòu)破壞、脫落，黏膜肌層間有大量細菌團塊，黏膜下層水腫(圖2H)。心肌腫脹、斷裂(圖2I)。

圖2 黃金蟒組織病理學鏡檢顯微圖片F(xiàn)ig.2 Histopathological examination results of golden pythons

2.3 分離細菌的培養(yǎng)特征與細胞形態(tài)

死亡黃金蟒的肺、肝和腎細菌分離培養(yǎng)結(jié)果見圖3C-E。結(jié)果顯示，連續(xù)37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后，在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上出現(xiàn)了2種菌落(菌株A、B)。取肺組織中分離的細菌進一步分離培養(yǎng)，菌株A生長為較大的、扁平、濕潤的乳黃色菌落，邊緣為波浪形，并可產(chǎn)生綠色色素(圖3A)；菌株B生長為較小的乳白色圓形菌落，菌落中央隆起、邊緣扁平(圖3B)。

圖3 黃金蟒各器官內(nèi)細菌分離培養(yǎng)結(jié)果Fig.3 Results of bacterial isolation and culture in various organs of the golden python

對2種細菌進行革蘭染色，鏡檢結(jié)果顯示，菌株A、B均為紅色，即革蘭陰性；形態(tài)近似，均為短桿狀，單個或成對排列。

2.4 體外藥敏試驗(紙片法)結(jié)果

分離到的銅綠假單胞菌菌株對恩諾沙星、氟苯尼考、氯霉素、慶大霉素、新霉素、卡那霉素和多黏菌素B 7種藥物完全敏感，對阿奇霉素具有耐藥性；分離到的糞產(chǎn)堿桿菌菌株對以上8種藥物完全敏感。(表1)。

表1 藥敏試驗結(jié)果

2.5 16S rRNA基因測序與同源性比對

根據(jù)北京六合華大基因科技有限公司提供的報告，菌株A和菌株B的16S rRNA序列與NCBI-BLAST的序列進行比對的結(jié)果如表2所示，菌株A與銅綠假單胞菌的親緣關系最接近(99.93%)，菌株B與糞產(chǎn)堿桿菌的親緣關系最接近(100.00%)，可以判定菌株A為銅綠假單胞菌，菌株B為糞產(chǎn)堿桿菌。

表2 菌株A和菌株B的16S rRNA基因序列同源性比對結(jié)果(各摘錄報告內(nèi)前3條結(jié)果)

3 討論

2例黃金蟒的病理學檢查結(jié)果顯示，雌性黃金蟒在難產(chǎn)后，輸卵管中的卵發(fā)生腐敗，引起重化膿性輸卵管炎，輸卵管結(jié)構(gòu)被破壞，推測病原菌進入血管引發(fā)菌血癥或膿毒敗血癥，導致多器官的化膿性炎和化膿灶的產(chǎn)生。2條黃金蟒均出現(xiàn)了化膿性肺炎，肺組織內(nèi)見大量細菌，肺泡狹窄或充滿滲出物，呼吸功能受到嚴重損害。最終2條黃金蟒因細菌大量代謝產(chǎn)物的毒性作用及呼吸困難死亡。黃金蟒各器官中分離到的銅綠假單胞菌菌落數(shù)量較多，致病性相對糞產(chǎn)堿桿菌強，推斷2條黃金蟒的死亡主要由銅綠假單胞菌感染引起，糞產(chǎn)堿桿菌在此病例中為繼發(fā)感染的可能性較大。

銅綠假單胞菌又稱綠膿桿菌，是一種革蘭陰性、專性需氧的條件致病菌，在環(huán)境中廣泛存在，也可見于人和多種動物的皮膚、腸道等。銅綠假單胞菌感染可造成各組織器官的感染、膿腫和敗血癥等，其中化膿性肺炎為較典型的病變[3-7]。糞產(chǎn)堿桿菌也是一種革蘭陰性、專性需氧的條件致病菌，在水和土壤中廣泛分布，存在于人和多種動物的腸道中[8]。通常，糞產(chǎn)堿桿菌對家兔和小鼠的致病性較弱[9-10]，但在人和動物中也存在由糞產(chǎn)堿桿菌單獨感染引起的呼吸系統(tǒng)感染、泌尿系統(tǒng)感染、角膜炎、膿腫和敗血癥等[11-15]。銅綠假單胞菌與糞產(chǎn)堿桿菌均可感染人或動物引發(fā)多種疾病，動物園管理人員應注重環(huán)境衛(wèi)生，定期消毒。接觸和治療患肺炎蛇，以及對懷疑患肺炎死亡的蛇進行剖檢時，注意個人防護。繁殖蛇類應通過拍攝X線片等方式檢查雌蛇是否難產(chǎn)，若發(fā)生難產(chǎn)應及時幫助雌蛇將卵排出或手術取出，以免引發(fā)細菌感染。

藥敏試驗結(jié)果表明，北京野生動物園內(nèi)感染兩黃金蟒的銅綠假單胞菌與糞產(chǎn)堿桿菌的耐藥情況不明顯，在蛇類發(fā)生具有類似癥狀的感染時，可以選擇使用相應的敏感藥物治療。