貴州野生動(dòng)物園一例袋鼠產(chǎn)氣莢膜梭菌的分離鑒定

陳閶崢 湯德元 楊志剛 張 森 韓超逸 晏仁潭 羅 柳

(貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴陽(yáng)，550025)

產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens)是一種革蘭氏陽(yáng)性厭氧菌[1]，廣泛分布于自然界，主要存在于人和動(dòng)物的腸道中，一定條件下可以引起梭菌性肌壞死和腸毒血癥等多種疾病[2]。因其可以分解肌肉組織中的糖分，產(chǎn)生大量的氣體造成組織氣腫，還可以產(chǎn)生莢膜，所以稱為產(chǎn)氣莢膜梭菌，也稱魏氏梭菌。目前，產(chǎn)氣莢膜梭菌已經(jīng)檢測(cè)出20多種毒素，其中最主要的5種致死毒素為α、β、β2、ε和ι，而根據(jù)所含毒素的不同，又可以將產(chǎn)氣莢膜梭菌分為A型(α)、B型(α、β、ε)、C型(α、β)、D型(α、ε)和E型(α、ι)[3-4]。

赤大袋鼠(Macropusrufus)隸屬袋鼠目(Diprotodontia)袋鼠科(Macropodidae)大袋鼠屬，主要生活在澳大利亞和巴布亞新幾內(nèi)亞地區(qū)。2020年12月上旬，貴州野生動(dòng)物園飼養(yǎng)的1只赤大袋鼠突然死亡，通過分析臨床癥狀和病理變化，經(jīng)過實(shí)驗(yàn)室診斷等，明確死因，為今后袋鼠的飼養(yǎng)和疾病預(yù)防工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

貴州野生動(dòng)物園病死赤大袋鼠的心、肝、肺、腎臟和腸道等組織。

1.2 剖檢

對(duì)病死赤大袋鼠病理解剖，觀察心、肺、腎、肝、胰腺和腸道等組織的病理變化。

1.3 細(xì)菌分離純化及鏡檢

在超凈工作臺(tái)內(nèi)，無菌操作，使用接種環(huán)在心、肺、肝、腎、胰腺和腸道等病變組織處取樣，接種于TSC固體培養(yǎng)基(購(gòu)于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)，37 ℃需氧和厭氧條件下培養(yǎng)24～48 h，挑取單個(gè)菌落接種于FTG培養(yǎng)基(購(gòu)于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)，放置于水浴搖床中，37 ℃培養(yǎng)24 h，并吸取菌液進(jìn)行涂片，酒精燈干燥固定后使用革蘭氏染色試劑盒染色鏡檢。

1.4 生化鑒定

操作參考腸道菌科生化鑒定管說明書(青島海博生物技術(shù)有限公司)，在超凈工作臺(tái)內(nèi)，用接種針取純化后的菌液，依次接種于各個(gè)生化鑒定管內(nèi)，包括半固體瓊脂、鳥氨酸脫羧酶肉湯、賴氨酸脫羧酶肉湯、氨基酸脫羧酶對(duì)照、西蒙氏枸櫞酸鹽、硫化氫、尿素酶、蛋白胨水(色氨酸肉湯)、MR-VP、苯丙氨酸、甘露醇、肌醇、山梨醇、蜜二糖、核糖醇(側(cè)金盞花醇)和棉子糖。

1.5 細(xì)菌分子生物學(xué)鑒定

在超凈工作臺(tái)內(nèi)，按說明書使用細(xì)菌基因DNA提取試劑盒(購(gòu)于北京天根生化科技有限公司)提取純化后菌液的DNA，并以此為模板，根據(jù)相關(guān)參考文獻(xiàn)[5]合成16S rDNA基因序列引物(表1)。采用PCR方法，對(duì)其16S rDNA基因目的片段擴(kuò)增，反應(yīng)體系：上、下游引物各1 μL，細(xì)菌DNA 2 μL，用mix補(bǔ)足25 μL。反應(yīng)條件：98 ℃預(yù)變性10 min；98 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。將PCR產(chǎn)物經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳，使用膠回收試劑盒，按說明書操作對(duì)目的條帶回收，送至擎科生物公司測(cè)序。

1.6 產(chǎn)氣莢膜梭菌分型

根據(jù)文獻(xiàn)[5]設(shè)計(jì)相關(guān)毒力基因的特異性引物，以純化細(xì)菌的DNA為模板，用PCR技術(shù)分別對(duì)不同毒素基因的目的片段進(jìn)行擴(kuò)增(表1)。其中α、β、ε和ι的反應(yīng)條件是：98 ℃預(yù)變性10 min；98 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸6 min。β2的反應(yīng)條件是：98 ℃預(yù)變性5 min；98 ℃變性30 s，45 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。

表1 產(chǎn)氣莢膜梭菌16S rDNA和主要毒素基因的特異性引物

1.7 藥敏試驗(yàn)

將純化菌液接種于培養(yǎng)基中并涂勻，選取青霉素、頭孢氨芐、頭孢曲松、新霉素、苯唑西林、卡那霉素氨芐西林、羧芐西林、丁胺卡那、四環(huán)素、多西環(huán)素、頭孢唑林、米諾環(huán)素和慶大霉素等藥敏紙片(購(gòu)于杭州微生物試劑有限公司)，將藥敏紙片貼于培養(yǎng)基上并標(biāo)明藥敏種類，具體操作方法參照說明書，將培養(yǎng)基置于37 ℃厭氧培養(yǎng)24～48 h，觀察結(jié)果。

1.8 動(dòng)物試驗(yàn)

選擇10只生長(zhǎng)狀態(tài)大致相同的雄性小鼠，隨機(jī)分成2組(實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組)，每組各5只。在超凈工作臺(tái)內(nèi)，實(shí)驗(yàn)組每只小鼠腹腔注射0.2 mL FTG液體培養(yǎng)基內(nèi)懸液，對(duì)照組小鼠腹腔注射等量生理鹽水，將2組小鼠放于相同條件下的2個(gè)鼠籠中飼養(yǎng)，觀察小鼠狀態(tài)。

2 結(jié)果與分析

2.1 剖檢結(jié)果

剖檢后，可見病死赤大袋鼠的肝臟明顯腫大，邊緣質(zhì)脆，表面有斑點(diǎn)狀出血；腸道內(nèi)部嚴(yán)重出血，腸系膜淋巴結(jié)腫大；胰腺壞死；胃部充氣膨脹，胃黏膜脫落、出血；心包囊內(nèi)有大量積液。

2.2 細(xì)菌形態(tài)觀察

培養(yǎng)24～48 h后，厭氧培養(yǎng)基中可見灰白色、表明光滑、濕潤(rùn)、半透明的菌落生長(zhǎng)，具有溶血特征。將分離純化后的細(xì)菌革蘭氏染色，顯微鏡下可見細(xì)菌為革蘭氏陽(yáng)性，菌體呈短桿狀，兩端鈍圓，有莢膜，初步鑒定為產(chǎn)氣莢膜梭菌。

2.3 細(xì)菌生化特性鑒定結(jié)果

該細(xì)菌可以發(fā)酵棉子糖、蜜二糖、山梨醇和甘露醇等糖類，產(chǎn)生氣體；MR-VP、尿素酶、西蒙氏枸櫞酸鹽和半固體瓊脂等實(shí)驗(yàn)結(jié)果呈陰性(表2)。這些生化鑒定結(jié)果與產(chǎn)氣莢膜梭菌的生物學(xué)特性相符，表明該菌極有可能是產(chǎn)氣莢膜梭菌。

表2 生化試驗(yàn)結(jié)果

2.4 細(xì)菌分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

以純化細(xì)菌DNA為模板，使用16S rDNA特異性引物成功擴(kuò)增產(chǎn)物，使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，獲得長(zhǎng)度約為600 bp的片段條帶(圖1)，與目的片段的長(zhǎng)度基本符合。通過測(cè)序分析，與GenBank公布的產(chǎn)氣莢膜梭菌ATCC 13124標(biāo)準(zhǔn)菌株的16S rDNA核苷酸序列進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)二者的同源性高達(dá)99.33%，確定該細(xì)菌是產(chǎn)氣莢膜梭菌。通過GenBank比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該菌與炫舞梭菌(Clostridiumtarantellae)、撒丁島梭菌(C.sardiniense)等菌株具有親緣關(guān)系。使用MEGA 5.0軟件中的NJ法構(gòu)建進(jìn)化樹，可以看出分離株CCB與序列號(hào)為NR104741.1的菌株親緣關(guān)系最接近(圖2)。

圖1 樣品16S rDNA擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Results of 16S rDNA amplification 注：M.DL2000 DNA Maker；1.陰性對(duì)照；2.樣品 Note：M，DL2000 DNA Maker.1，Negative control.2，Sample

圖2 產(chǎn)氣莢膜梭菌16S rDNA基因核苷酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree of 16S rDNA gene nucleotide sequence of Clostridium perfringens

2.5 產(chǎn)氣莢膜梭菌分型結(jié)果

以產(chǎn)氣莢膜梭菌5種主要毒素基因的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到的產(chǎn)物置于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，只有毒素基因cpa擴(kuò)增出了目的條帶(圖3)，長(zhǎng)度約為324 bp，與目的片段基本符合。將其PCR產(chǎn)物測(cè)序后進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，結(jié)果顯示，該序列與GenBank中的α毒素基因序列同源性達(dá)100%，證實(shí)其為產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素，并確定了該分離菌株的分型為產(chǎn)氣莢膜梭菌A型。

圖3 產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素基因分型擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 Genotyping and amplification of Clostridium perfringens toxin 注：M.DL2000 DNA Marker；1.cpb基因；2.cpb2基因；3.cpa基因；4.etx基因；5.iap基因 Note：M，DL2000 DNA Marker.1，cpb gene.2，cpb2 gene.3，cpa gene.4，etx gene.5，iap gene

2.6 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

青霉素、苯唑西林、四環(huán)素、多西環(huán)素、米諾環(huán)素和紅霉素對(duì)該菌形成的抑菌圈直徑>24 mm(表3)，說明這些藥物對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌的生長(zhǎng)有極強(qiáng)的抑制作用。

表3 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2.7 動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)組小鼠在48 h內(nèi)全部死亡。通過解剖觀察，死亡小鼠體內(nèi)臟器產(chǎn)生大量氣泡，腸道黏膜有嚴(yán)重充血、出血癥狀，肝臟充血腫大、質(zhì)脆。挑取腸道內(nèi)容物進(jìn)行涂片染色，可見革蘭氏陽(yáng)性桿菌，為短桿狀，兩端鈍圓，與注射的菌株形態(tài)相同。

3 討論

本病例利用細(xì)菌分離鑒定、生化試驗(yàn)、PCR技術(shù)和藥敏試驗(yàn)等方法，分離純化得到1株產(chǎn)氣莢膜梭菌A型毒株。在日常生活中，產(chǎn)氣莢膜梭菌普遍存在于動(dòng)物的腸道中，當(dāng)動(dòng)物身體健康、抵抗力較強(qiáng)時(shí)，腸道內(nèi)的各種微生物菌群相對(duì)穩(wěn)定，產(chǎn)氣莢膜梭菌一般不會(huì)導(dǎo)致疾病[6]，只有當(dāng)飼養(yǎng)條件達(dá)不到要求，飼料營(yíng)養(yǎng)不均衡，抵抗力降低或發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)時(shí)等[7]，產(chǎn)氣莢膜梭菌才會(huì)大量繁殖，引起動(dòng)物食物中毒、氣性壞疽、腸毒血癥，以及分泌性、壞死性和出血性腸炎，最終導(dǎo)致急性死亡。產(chǎn)氣莢膜梭菌是條件致病菌，患病無明顯的季節(jié)性，一般病程極短，很難得到有效治療，病死率極高[8]。

根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果，產(chǎn)氣莢膜梭菌對(duì)青霉素、四環(huán)素、多西環(huán)素和紅霉素等藥物極為敏感，與已報(bào)道的產(chǎn)氣莢膜梭菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果相符，說明此類藥物可用于臨床上發(fā)病動(dòng)物的治療[9-10]。貴州冬季氣候較冷，晝夜溫差較大，極易導(dǎo)致袋鼠疾病的發(fā)生。在動(dòng)物園的日常管理中，袋鼠要避寒保暖，加強(qiáng)飼養(yǎng)和清潔管理，定期對(duì)圈舍進(jìn)行消毒，避免病原物滋生，確保飼料營(yíng)養(yǎng)配比均衡，增強(qiáng)免疫力。當(dāng)動(dòng)物園內(nèi)發(fā)生該疾病時(shí)，采集本地分離菌株，滅活后在全園動(dòng)物中緊急接種[11]，可以有效避免該病在動(dòng)物園內(nèi)傳播。