小飛鼠微衛(wèi)星位點(diǎn)的篩選及遺傳特征分析

田新民 楊孟平 宋雅祺 劉小慧 廉明棟 陳 紅

(牡丹江師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，牡丹江，157011)

小飛鼠(Pteromysvolans)隸屬哺乳綱(Mammalia)嚙齒目(Rodentia)鼯鼠科(Pteromyidae)飛鼠屬，為樹棲夜行滑行類物種，主要分布于歐亞大陸北部，國(guó)內(nèi)主要分布在東北、華北、西北等北方林區(qū)[1-3]。由于不合理的森林采伐，森林生境趨于破碎化甚至喪失，已導(dǎo)致全球許多地區(qū)的小飛鼠種群處于瀕危狀態(tài)[4-5]。作為森林可持續(xù)經(jīng)營(yíng)的重要指示和傘護(hù)物種[6]，我國(guó)也將其列為“易?！迸c“三有”重點(diǎn)保護(hù)的野生動(dòng)物[7-8]。目前，國(guó)外在小飛鼠巢址選擇、家域、擴(kuò)散、遺傳多樣性和分子系統(tǒng)進(jìn)化等領(lǐng)域已開展系列研究[9-13]，為該物種的科學(xué)保護(hù)提供了參考，而我國(guó)對(duì)小飛鼠生態(tài)學(xué)領(lǐng)域的研究基本空白。

保護(hù)遺傳學(xué)研究在揭示瀕危物種遺傳適應(yīng)與瀕危機(jī)制、實(shí)現(xiàn)物種的精準(zhǔn)保護(hù)與管理方面發(fā)揮了重要的作用，微衛(wèi)星分子標(biāo)記以選擇中性、多態(tài)性高及共顯性等優(yōu)點(diǎn)，在保護(hù)遺傳學(xué)領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用[14]。由于微衛(wèi)星側(cè)翼序列在物種間的高度保守性，表現(xiàn)出近緣物種間的引物通用性，從而可實(shí)現(xiàn)從近緣物種微衛(wèi)星中篩選出目標(biāo)物種的位點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)該物種的群體遺傳學(xué)研究[15-16]，相比其他篩選策略，這是一種低成本與高效率的方法。本研究對(duì)小飛鼠其他亞種、近緣物種的微衛(wèi)星位點(diǎn)進(jìn)行測(cè)試篩選，構(gòu)建小飛鼠東北亞種(P.v.arsenjevi)的微衛(wèi)星分析系統(tǒng)，藉以為該亞種的保護(hù)遺傳學(xué)領(lǐng)域深入研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣本與DNA提取

在伊春市五營(yíng)區(qū)龍江松鼠養(yǎng)殖場(chǎng)共收集30只自然死亡的小飛鼠，此樣本均為東北亞種野外個(gè)體的繁殖后代。從這些個(gè)體的腿部取肌肉組織，采用血液/細(xì)胞/組織基因組DNA試劑盒(天根，北京)提取基因組DNA。用ND-1000紫外分光光度計(jì)(Nanodrop，USA)測(cè)定DNA濃度，稀釋至10 ng/μL，4 ℃存放備用。

1.2 PCR擴(kuò)增

根據(jù)GenBank中已報(bào)道的微衛(wèi)星位點(diǎn)，結(jié)合文獻(xiàn)[17-22]，選取鼯鼠科小飛鼠指名亞種(P.v.volans)、北美飛鼠(Glaucomyssabrinus)、海南小飛鼠(Hylopetesphayrei)和赤頰林飛鼠(H.sagitta)，以及松鼠科(Sciuridae)北松鼠(Sciurusvulgaris)5個(gè)物種中擴(kuò)增效果較好的34對(duì)引物(表1)，以小飛鼠東北亞種的DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增。采用不同退火梯度，對(duì)微衛(wèi)星位點(diǎn)初步篩選；成功擴(kuò)增的位點(diǎn)，上游引物5′端進(jìn)行熒光標(biāo)記(Fam、Hex、Tamra或Rox)。擴(kuò)增體系20.0 μL：5 U/μL ExTaqDNA聚合酶(TaKaRa，Japan)0.1 μL，10×Buffer 2 μL，2.5 mmol/L dNTPs 1.6 μL，10 μmol/L上下游引物各0.5 μL，模板DNA 1.5 μL，超純水13.8 μL。PCR反應(yīng)條件均為：94 ℃，4 min；(94 ℃，30 s；50～59 ℃，30 s；72 ℃，30 s)× 35 個(gè)循環(huán)；72 ℃，10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，其中熒光標(biāo)記引物成功擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物用ABI 3730XL測(cè)序儀(Applied Biosystems Inc.，America)進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測(cè)，判讀等位基因大小。所有的引物合成和基因分型均由上海生工完成。

表1 鼯鼠科和松鼠科物種的微衛(wèi)星位點(diǎn)信息

續(xù)表1

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用軟件GENALEX 6[23]計(jì)算各位點(diǎn)的等位基因數(shù)、觀測(cè)雜合度和期望雜合度；Excel microsatellite tool kit[24]計(jì)算各位點(diǎn)的多態(tài)信息含量(polymorphic information content，PIC)。采用軟件GENEPOP 4.0[25]測(cè)算各位點(diǎn)是否符合Hardy-Weinberg平衡，位點(diǎn)間的連鎖不平衡情況和概率檢驗(yàn)使用馬爾可夫鏈法(Markov chain method)，參數(shù)設(shè)置：dememorization=10 000；batch=20；iteration=5 000，以Bonferroni法對(duì)檢驗(yàn)的顯著性進(jìn)行修正。對(duì)于多態(tài)性位點(diǎn)，采用軟件GIMLET 1.3.3[26]計(jì)算位點(diǎn)的個(gè)體聯(lián)合判別率(probability of identity，PID)，PID指無親緣關(guān)系或同胞個(gè)體之間具有相同基因型的概率。

2 結(jié)果與分析

PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，共有14個(gè)位點(diǎn)有明確的符合微衛(wèi)星片段大小的擴(kuò)增產(chǎn)物，占篩選位點(diǎn)總數(shù)的41.2%。毛細(xì)管電泳(表2)顯示，上述14個(gè)位點(diǎn)均能進(jìn)行準(zhǔn)確的基因型判斷，但是位點(diǎn)Hlep26和GLSA48只有1個(gè)等位基因。其余12個(gè)位點(diǎn)Pvol10、Pvol41、PvolE1、PvolE5、PvolE6、PvolE10、Scv3、Hlep59、Hlep72、Hlep80、Hph17和ScnFO35的等位基因8～16個(gè)，多態(tài)信息含量為0.757～0.902，均為高度多態(tài)性位點(diǎn)，占可擴(kuò)增位點(diǎn)的85.7%(12/14)。

12個(gè)高度多態(tài)性位點(diǎn)的觀測(cè)雜合度為0.500～0.950，期望雜合度為0.775～0.909，其中，有6個(gè)位點(diǎn)(Pvol41、PvolE6、Hlep59、Hlep72、Hph17和ScnFO35)符合Hardy-Weinberg平衡(P=0.123～0.998)；其余6個(gè)位點(diǎn)(Pvol10、PvolE1、PvolE5、PvolE10、Scv3和Hlep80)都偏離Hardy-Weinberg平衡(P<0.05)，皆呈現(xiàn)不同程度的雜合度不足(表2)。在12個(gè)位點(diǎn)中，均未檢測(cè)到連鎖不平衡現(xiàn)象。Gimlet分析顯示，12個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的個(gè)體聯(lián)合判別率很高，2只個(gè)體具有相同基因型的無偏概率為3.49×10-22；即使全同胞個(gè)體，錯(cuò)誤判別概率Prod(sibs)也只有1.44×10-6。多態(tài)性最高的前6個(gè)位點(diǎn)(Hlep59、PvolE1、PvolE5、Pvol10、Pvol41和Hlep72)擴(kuò)增失敗時(shí)，全同胞錯(cuò)誤判別概率也只上升到0.16%(圖1)。

表2 14個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)在小飛鼠種群中的遺傳特征

圖1 12個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)按照個(gè)體聯(lián)合判別率順序的個(gè)體基因型相似概率曲線Fig.1 Probability of identity(PID)curve generated 12 microsatellite loci

3 討論

微衛(wèi)星側(cè)翼序列的保守性，是近緣物種間位點(diǎn)交叉擴(kuò)增的基礎(chǔ)，為許多物種的遺傳管理提供了極大的便利[14-16，27-29]。本研究選擇了鼯鼠科與松鼠科中5個(gè)物種(小飛鼠指名亞種、北美飛鼠、海南小飛鼠、赤頰林飛鼠和北松鼠)內(nèi)高多態(tài)性的34個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)，在小飛鼠東北亞種內(nèi)共獲得12個(gè)具有多態(tài)性的位點(diǎn)，成功率為35.3%，其中，同物種小飛鼠指名亞種的位點(diǎn)在東北亞種內(nèi)多態(tài)性擴(kuò)增成功率最高，為85.7%(6/7)；同為鼯鼠科不同屬的海南小飛鼠和赤頰林飛鼠的成功率次之，為75.0%(7/8)；松鼠科的北松鼠最低，為12.5%(1/8)。由此可以看出，近緣種基因組序列相似度高，交叉擴(kuò)增成功概率高，而遠(yuǎn)源種之間情況呈相反的趨勢(shì)[15]。例外的是，在鼯鼠科的北美飛鼠11個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)內(nèi)，僅有1個(gè)位點(diǎn)能夠擴(kuò)增成功，并無多態(tài)性。

本研究檢測(cè)到12個(gè)多態(tài)性微衛(wèi)星位點(diǎn)，其中有6個(gè)位點(diǎn)偏離Hardy-Weinberg平衡。相關(guān)研究認(rèn)為，導(dǎo)致位點(diǎn)和群體偏離Hardy-Weinberg平衡的原因有很多，如種群亞結(jié)構(gòu)、近親交配、遷入和遷出等[29-30]。在這6個(gè)位點(diǎn)中，均呈現(xiàn)一定程度的雜合度不足。本研究樣本來自籠養(yǎng)的繁殖個(gè)體，可能受到近親交配的影響，導(dǎo)致了位點(diǎn)偏離Hardy-Weinberg平衡。得到的12個(gè)位點(diǎn)均為高度多態(tài)性位點(diǎn)(PIC值>0.5)，其個(gè)體聯(lián)合判別率很高；僅使用相比多態(tài)性略低的6個(gè)位點(diǎn)(PvolE6、PvolE10、Scv3、Hlep80、Hph17和ScnFO35)，全同胞錯(cuò)誤判別概率也小于1%(0.16%)。因此，本研究篩選的12個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，可作為非損傷性遺傳取樣個(gè)體識(shí)別的參考位點(diǎn)，也可為小飛鼠東北亞種群體遺傳學(xué)研究與管理提供重要的分子標(biāo)記。