貴州茂蘭喀斯特地區(qū)隱紋花松鼠秋季食性分析

楊舒晗 蔡延芳 王野影 胡燦實(shí) 張明明 粟海軍*

(1.貴州大學(xué)林學(xué)院，貴陽，550025；2.貴州大學(xué)生物多樣性與自然保護(hù)研究中心，貴陽，550025；3.貴州師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴陽，550025；4.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴陽，550025)

食物是野生動物生存的第一要素，生境食物條件與動物覓食行為的共同作用，影響著野生動物個體或種群的分布格局與生存適合度[1-2]，覓食生態(tài)學(xué)是動物行為生態(tài)學(xué)的重要研究內(nèi)容。動物的食性和覓食行為受遺傳基因、生活史階段、種間及種內(nèi)競爭等因素影響，常形成十分固定的食譜結(jié)構(gòu)和行為模式[3]，因此，掌握物種的食性或覓食行為，是進(jìn)一步開展物種生態(tài)學(xué)研究與保護(hù)管理的重要基礎(chǔ)。

隱紋花松鼠(Tamiopsswinhoei)是廣泛分布于我國南方各省森林、林緣和灌木生境的一種松鼠科(Sciuridae)花松鼠屬物種[4]。它是一種生性靈活機(jī)警、代謝率高、捕食行為頻繁的雜食性動物[5]。對于隱紋花松鼠的研究十分少見，主要集中在亞種層次的分類學(xué)及生物學(xué)描述上[5-7]，生態(tài)學(xué)上僅有對其棲息環(huán)境、活動規(guī)律、生活習(xí)性等一般性描述[8-9]，對其深入細(xì)致的食性分析尚為空白。對松鼠科動物食性的相關(guān)報道中，采用的研究方法包括直接觀察法、解剖法、糞便顯微組織分析法和胃容物分析法等，其中胃容物分析法是國內(nèi)外研究嚙齒動物(Rodetia)食性的主要方法[10]，但傳統(tǒng)的胃容物檢測方法效率低、誤差大[11]。為了準(zhǔn)確揭示隱紋花松鼠的食性，本研究運(yùn)用高通量測序技術(shù)測定隱紋花松鼠樣本胃容物，以期更為精確地探索喀斯特地區(qū)隱紋花松鼠的食性組成，為今后深入研究這一物種提供基礎(chǔ)資料。

1 研究區(qū)概況

采樣地位于貴州省黔南苗族布依族自治州黔、桂交界處的荔波縣翁昂鄉(xiāng)(圖1)，選擇2個采樣斑塊(25°13′ N，107°58′ E)，采樣面積約48 hm2，平均海拔780 m，為典型石灰?guī)r地區(qū)。該區(qū)域?qū)儆谥衼啛釒Ъ撅L(fēng)濕潤氣候區(qū)，平均氣溫為15.3 ℃，1月和7月平均氣溫分別為5.2、23.5 ℃，生長期237 d；全年降水量約1 750 mm，集中分布在4—10月。該區(qū)域與荔波世界自然遺產(chǎn)地及茂蘭國家級自然保護(hù)區(qū)相鄰，水熱條件好，森林植被組成多為典型的中亞熱帶石灰?guī)r常綠落葉闊葉混交林，區(qū)內(nèi)原生林保存較為完整。茂蘭被譽(yù)為是地球同緯度地區(qū)原生性最強(qiáng)、最具代表性的喀斯特森林生態(tài)系統(tǒng)[12-13]。

圖1 研究地位置圖Fig.1 Location map of the study area 注：A.研究區(qū)域在貴州省的位置；B.研究區(qū)域樣品采集點(diǎn)；C.采樣地實(shí)景 Note：A，The location of study area in Guizhou Province.B，Sampling sites in the study area.C，The overall landscape view of the study site

2 材料與方法

2.1 材料

2017年10—12月，在貴州荔波茂蘭喀斯特林區(qū)通過籠捕法收集隱紋花松鼠，隨機(jī)布籠共捕獲19只個體，根據(jù)批準(zhǔn)的獵取限額取8只成年活體作采樣標(biāo)本(編號WA1～WA4采自斑塊1；編號WA5～WA8采自斑塊2，均雌雄各半)，其余放歸。樣本經(jīng)CO2氣體處死后，進(jìn)行常規(guī)生物學(xué)測量(性別、體重、體長、尾長、后足長和耳長)，隨后立即解剖，取胃置于5%的福爾馬林溶液中固定[14]，冰箱中-20 ℃保存。測定的樣本信息見表1。

表1 隱紋花松鼠樣本信息

2.2 胃容物基因組DNA 的提取

使用OMEGA Soil DNA Kit(D5625-01)提取DNA，用紫外分光光度計測定隱紋花松鼠樣本A260值，計算濃度，通過A260/A280值鑒定DNA和RNA純度，0.8%瓊脂電泳驗(yàn)證完整性。

2.3 目的基因片段的PCR擴(kuò)增與測序

用引物Z1aF(5′-ATGTCACCACCAACAGAGACTAAAGC-3′)和hp2R(5′-CGTCCTTTGTAACGATCAAG-3′)對葉綠體rbcL基因進(jìn)行擴(kuò)增。用引物COⅠintF(5′-GGWACWGGWTGAACWGTWTAYCCYCC-3′)和COⅠjgHC02198(5′-TANACYTCNGGRTGNCCRAARAAYCA-3′)對線粒體COⅠ基因進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系的總體積為25.00 μL，其中包括5×reaction buffer 5.00 μL，5×GC buffer 5.00 μL，dNTP(10 mmol/L)0.50 μL，正向引物(10 μmol/L)1.00 μL，反向引物(10 μmol/L)1.00 μL，DNA模板1.00 μL，ddH2O 11.25 μL，Q5 high-fidelity DNA polymerase 0.25 μL。擴(kuò)增rbcL和COⅠ基因片段反應(yīng)程序?yàn)椋?8 ℃預(yù)變性5 min；98 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環(huán)；72 ℃終延伸5 min，4 ℃保溫。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，用Axygen凝膠回收試劑盒回收目的片段。利用Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit對PCR產(chǎn)物在Microplate reader(BioTek，F(xiàn)Lx800)上定量，然后按照每個樣品所需的數(shù)據(jù)量混樣。之后送至上海派森諾生物科技股份有限公司平臺測序。

3 數(shù)據(jù)處理與分析

下機(jī)數(shù)據(jù)經(jīng)過疑問序列的剔除及序列數(shù)統(tǒng)計后得到有效數(shù)據(jù)。應(yīng)用QIIME軟件對序列按照97%的序列相似度歸并和操作分類單元聚類分析，產(chǎn)生OTU表并與UNITE數(shù)據(jù)庫(Release 5.0，https：//unite.ut.ee)、Silva數(shù)據(jù)庫(Release115，http：//www.arb-silva.de)、Greengenes數(shù)據(jù)庫(Release 13.8，http：//greengenes. secondgenome.com)比對分類分析，所用平臺為QIIME軟件(Quantitative Insights Into Microbial Ecology，v1.8.0，http：//qiime.org)統(tǒng)計后得到個體樣本分類鑒定結(jié)果。

為了檢驗(yàn)試驗(yàn)測序結(jié)果的深度，基于OTU聚類分析結(jié)果對貴州荔波茂蘭喀斯特地區(qū)的隱紋花松鼠樣本做稀釋性曲線分析。為了揭示隱紋花松鼠胃容物的組成，首先在滿足正態(tài)分布的前提下，對隱紋花松鼠外形進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；其次，使用QIIME軟件，獲取各樣本在科屬分類水平上的植物和動物群落的組成和相對豐度分布，揭示隱紋花松鼠的食性組成。

4 結(jié)果與分析

4.1 OTU劃分與分類地位鑒定

分別選取隱紋花松鼠葉綠體rbcL基因片段、線粒體COⅠ基因片段，對其胃內(nèi)容物的植物組成和動物組成進(jìn)行組分分析鑒定。在植物鑒定中，經(jīng)Illumina高通量測序共從8個樣品中獲得目的片段539 008條，樣品的序列數(shù)最低為50 153條，最高為93 291條，經(jīng)過聚類共獲得295個OTU。在動物鑒定中，共從8個樣品中獲得目的片段264 983條，樣品的序列數(shù)最低為29 819條，最高為37 116條，經(jīng)過聚類共獲得1 000個OTU。

4.2 隱紋花松鼠食物的科屬分類多樣性

通過OTU聚類確定隱紋花松鼠攝食植物有73科109屬，樣品中殼斗科(Fagaceae)、樟科(Lauraceae)、平蘚科(Neckeraceae)、胡桃科(Juglandaceae)、毛茛科(Ranunculaceae)、山茱萸科(Cornaceae)、木犀科(Oleaceae)、扁萼苔科(Radulaceae)、提燈蘚科(Mniaceae)、錦蘚科(Sematophyllaceae)、五加科(Araliaceae)、石竹科(Caryophyllaceae)、衛(wèi)茅科(Celastraceae)、木靈蘚科(Orthotrichaceae)、罌粟科(Papaveraceae)、錦葵科(Malvaceae)、番荔枝科(Annonaceae)、禾本科(Poaceae)、耳葉苔科(Frullaniaceae)和十字花科(Brassicaceae)的總相對讀長豐度為0.953 3～0.997 2(圖2)，其中殼斗科相對讀長豐度最大(0.030 9～0.964 5)，然后為樟科(0.003 6～0.487 3)、平蘚科(0.001 2～0.277 0)、胡桃科(0.003 7～0.368 8)、毛茛科(0.001 2～0.174 4)、山茱萸科(0.001 9～0.242 2)、木犀科(0.000 9～0.220 9)、扁萼苔科(0.000 5～0.086 1)、提燈蘚科(0.000 2～0.081 1)、錦蘚科(0.000 1～0.045 7)、五加科(0.000 6～0.007 6)、石竹科(0.000 2～0.035 9)、衛(wèi)茅科(0.000 3～0.031 4)、木靈蘚科(0～0.020 6)、罌粟科(0.000 1～0.023 0)、錦葵科(0～0.016 6)、番荔枝科(0.000 1～0.016 5)、禾本科(0～0.013 2)、耳葉苔科(0～0.012 2)和十字花科(0～0.010 6)。

圖2 茂蘭隱紋花松鼠胃容物樣品中平均相對讀長豐度最高的20科植物Fig.2 The top 20 plant families with the highest average relative read abundance in the samples of stomach content of Tamiops swinhoei in Maolan

由圖3可見，在屬水平上，樣品中櫟屬(Quercus)、杯托樟屬(Aiouea)、狄氏蘚屬(Dixonia)、煙包樹屬(Engelhardia)、山茱萸屬(Cornus)、素馨屬(Jasminum)、唐松草屬(Thalictrum)、鐵線蓮屬(Clematis)、扁萼苔屬(Radula)、絲瓜蘚屬(Pohlia)、刺疣蘚屬(Trichosteleum)、南洋參屬(Polyscias)、孩兒參屬(Pseudostellaria)、衛(wèi)矛屬(Euonymus)、木靈蘚屬(Orthotrichum)、荷青花屬(Hylomecon)、棉屬(Gossypium)、瓜馥木屬(Fissistigma)、耳葉苔屬(Frullania)和蕓薹屬(Brassica)的總相對讀長豐度為0.952 8～0.995 6，其中櫟屬的相對讀長豐度最高(0.028 2～0.963 2)，然后為杯托樟屬(0.003 5～0.482 9)、狄氏蘚屬(0.001 2～0.277 0)、煙包樹屬(0.003 7～0.368 8)、山茱萸屬(0.001 9～0.242 2)、素馨屬(0.000 9～0.220 9)、唐松草屬(0.000 7～0.172 5)、鐵線蓮屬(0.000 4～0.140 5)、扁萼苔屬(0.000 5～0.086 1)、絲瓜蘚屬(0.000 2～0.081 1)、刺疣蘚屬(0.000 1～0.045 6)、南洋參屬(0.000 6～0.007 6)、孩兒參屬(0.000 2～0.035 9)、衛(wèi)矛屬(0.000 3～0.031 2)、木靈蘚屬(0～0.020 6)、荷青花屬(0.000 1～0.023 0)、棉屬(0～0.016 6)、瓜馥木屬(0.000 1～0.016 1)、耳葉苔屬(0～0.012 2)和蕓薹屬(0～0.010 6)。

圖3 茂蘭隱紋花松鼠胃容物樣品中平均相對讀長豐度最高的20屬植物Fig.3 The top 20 genre with the highest average relative read abundance in the samples of stomach content of Tamiops swinhoei in Maolan

通過OTU聚類確定隱紋花松鼠攝食動物有82科120屬，由圖4可見，樣品中刺蛾科(Limacodidae)、蝽科(Pentatomidae)、匍蠊科(Blaberidae)、步行蟲科(Carabidae)、葉甲科(Chrysomelidae)、海蛄蝦科(Thalassinidae)、偽瓢蟲科(Endomychidae)、蠓科(Ceratopogonidae)、思蒂格諾盲蛛科(Stygnopsidae)、蚊科(Culicidae)、廁蠅科(Fanniidae)、天?？?Cerambycidae)、蝗科(Acrididae)和麗蠅科(Calliphoridae)的總相對讀長豐度為0.000 5～0.848 7，其中刺蛾科相對讀長豐度最大(0～0.780 0)，然后為蝽科(0～0.186 8)、匍蠊科(0～0.074 8)、步行蟲科(0～0.071 6)、葉甲科(0～0.034 5)、海蛄蝦科(0～0.031 6)、偽瓢蟲科(0～0.031 7)、蠓科(0～0.026 8)、思蒂格諾盲蛛科(0～0.012 3)、蚊科(0～0.020 9)、廁蠅科(0～0.015 1)、天?？?0～0.005 3)、蝗科(0～0.007 8)和麗蠅科(0～0.003 2)。

圖4 茂蘭隱紋花松鼠胃容物樣品中平均相對讀長豐度最高的14科動物Fig.4 The top 14 animal families with the highest average relative read abundance in the samples of stomach content of Tamiops swinhoei in Maolan

由圖5可見，在屬水平上，樣品中Natada、茶翅蝽屬(Halyomorpha)、Nebria、Thyant、海蛄蝦屬(Thalassina)、Indalmus、庫蠓屬(Culicoides)、庫蚊亞屬(Culex)、廁蠅屬(Fannia)、通緣步甲屬(Pterostichus)和雛蝗屬(Chorthippus)的總相對讀長豐度為0.000 3～0.814 2，其中Natada的相對讀長豐度最大(0～0.814 2)，然后為茶翅蝽屬(0～0.186 8)、Nebria(0～0.071 6)、Thyanta(0～0.034 5)、海蛄蝦屬(0～0.031 7)、Indalmus(0～0.026 8)、庫蠓屬(0～0.012 3)、庫蚊亞屬(0～0.015 1)、廁蠅屬(0～0.005 3)、通緣步甲屬(0～0.007 8)和雛蝗屬(0～0.004 3)。

圖5 茂蘭隱紋花松鼠胃容物樣品中平均相對讀長豐度最高的11屬動物Fig.5 The top 11 genre with the highest average relative read length and abundance in the samples of stomach content of Tamiops swinhoei in Maolan

5 討論

動物食性分析方法的精確性直接關(guān)系到食性相關(guān)理論的研究水平，也關(guān)乎食性結(jié)果應(yīng)用于動物保護(hù)的實(shí)踐[15]，所以選擇合適的食性研究方法至關(guān)重要。胃容物分析法是通過采集的胃樣，分析食物組成，以準(zhǔn)確確定動物食性的一種方法[16]。高通量測序是DNA測序技術(shù)發(fā)展中的重大突破，可以對數(shù)百萬個DNA分子同時測序[17-19]，避免分離或純化的過程便可得到豐富的物種信息，只需對PCR產(chǎn)物直接測序[20]，從而可忽略動物本身序列產(chǎn)生的影響[21]，以獲取信息量大、成效快等特點(diǎn)被廣泛地應(yīng)用于動物食性研究中[22-24]。采用胃容物高通量測序技術(shù)分析嚙齒動物食性，相對于傳統(tǒng)食性分析方法，具有不依賴于研究者的經(jīng)驗(yàn)和主觀判斷，不受食物消化程度和硬質(zhì)殘留比例的局限等優(yōu)點(diǎn)，大幅提高了食物物種辨識的準(zhǔn)確度和可信度[11，20]，可最大限度地揭示食物種類組成[25]，獲得物種所消耗的不同食物相對量的定量數(shù)據(jù)[11，20]。但高通量測序技術(shù)也存在一定的缺陷性和不確定性，擴(kuò)增區(qū)域的選擇、模板DNA的質(zhì)量、PCR、讀長的清晰度和解析度、數(shù)據(jù)庫的完善及該技術(shù)本身等均會對研究結(jié)果產(chǎn)生一定的影響。

本研究結(jié)果中，攝食植物中的杯托樟屬，通過查找其分布發(fā)現(xiàn)，該屬物種主要分布在新熱帶界，而古北界及東洋界一帶暫無分布記錄，分析其首要原因可能是國內(nèi)對于該屬物種缺乏研究，相關(guān)報道非常少；其次可能是物種注釋的問題，按照97%的序列相似度歸并的分析標(biāo)準(zhǔn)會影響到高通量測序?qū)δ承┪锓N鑒別的精準(zhǔn)度，導(dǎo)致該屬的分辨率不夠清晰，注釋到近緣屬物種的情況。在攝食動物中，也存在此現(xiàn)象。對此，可考慮采取其他方法與之相結(jié)合達(dá)到更優(yōu)的鑒定結(jié)果。劉剛等[11]曾表明，在同一個研究中，通過開展高通量測序與另一種食性分析方法的結(jié)合是驗(yàn)證數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性的有效途徑，已有學(xué)者證實(shí)，通過與攝像機(jī)結(jié)合等方式可起到互補(bǔ)驗(yàn)證作用[15]，因此，本研究結(jié)果還需結(jié)合其他食性分析方法，做進(jìn)一步地補(bǔ)充和驗(yàn)證。雖然高通量測序技術(shù)還存在一定的局限，但不斷完善和具備的定量特征，以及各種分析軟件的日漸成熟，目前仍然可被廣泛應(yīng)用于食物組成的評估研究[15]。

在已有研究報道中，采取野外觀察和夾日法捕獲花鼠(Eutamiassibiricus)對其頰囊食物在解剖鏡下分類，對胃解剖發(fā)現(xiàn)花鼠春季主要取食多年生早春雜草，夏季主要取食漿果和經(jīng)濟(jì)類水果，也取食一些小型動物及昆蟲，秋季主要取食向日葵(Helianthusannuus)種子和大田作物，冬季進(jìn)入間歇性冬眠[26]。本研究結(jié)果表明，貴州荔波茂蘭喀斯特地區(qū)隱紋花松鼠為雜食性動物，攝食植物多達(dá)73科109屬，其中櫟屬、杯托樟屬、狄氏蘚屬、煙包樹屬、山茱萸屬、素馨屬、唐松草屬、鐵線蓮屬、扁萼苔屬和絲瓜蘚屬為其偏好性植物，且殼斗科櫟屬為最重要的食物來源；攝食動物82科120屬，其中Natada、茶翅蝽屬和Nebria取食量在動物食源中占比相對更大，表明隱紋花松鼠攝食食物類型豐富，是偏植食性雜食動物。

荔波茂蘭地區(qū)為典型喀斯特中亞熱帶喀斯特森林生態(tài)系統(tǒng)，林分保存較好，以天然次生林為主，尤其殼斗科植物豐富[27]，果實(shí)熱量高，適口性好，極易被取食，果期10—11月，與本研究采集樣本的時間耦合，該時期食物資源豐富，可為接下來入冬的隱紋花松鼠生存提供保障。本研究在測量樣本信息時發(fā)現(xiàn)，2個采樣斑塊的樣本在體重上有著明顯差異(斑塊1樣本平均體重109.3 g，而斑塊2樣本平均體重僅為66.4 g)，樣本經(jīng)生殖器和妊娠檢驗(yàn)，均為成體(雌性排除妊娠情況)，年齡差異應(yīng)不可能造成如此懸殊的情況，從兩地個體的食性構(gòu)成(圖3，圖4)來看，未發(fā)現(xiàn)兩采樣斑塊種群食性有明顯特征差異，這一現(xiàn)象有待進(jìn)一步采樣并探究其原因。

嚙齒動物取食食譜受自然環(huán)境中食物資源狀況影響，不同季節(jié)資源狀況可能也不盡相同[28]。本次采集隱紋花松鼠樣本的時間為10—12月，如果要全面了解各季節(jié)時段的食性，還需連續(xù)采集不同季節(jié)的樣本，進(jìn)一步研究全年的食性規(guī)律。