基于藥代動(dòng)力學(xué)特征定量評(píng)估金絲桃素肝腸首過(guò)效應(yīng)

蘇 遠(yuǎn) 張蒙蒙 姚婷婷 趙 倩 王佳佳 章禮久 方海明

金絲桃素（Hyp）是貫葉連翹中的一種天然生物活性物質(zhì)，藥理活性具有抗炎、抗病毒、抗腫瘤等作用[1]。此外，由于Hyp具有疏水性強(qiáng)、與細(xì)胞膜親和力強(qiáng)、毒性低、光氧化活性高等優(yōu)點(diǎn)，被認(rèn)為是光動(dòng)力療法的一種很有前途的光敏劑，在黑色素瘤等腫瘤光動(dòng)力學(xué)治療方面的潛能越來(lái)越受到關(guān)注和重視[2]。慢性丙型肝炎患者連續(xù)口服0.05 mg·kg-1及0.1 mg·kg-1Hyp，共8周，血漿藥物濃度-時(shí)間曲線下面積和藥物峰濃度均進(jìn)行劑量標(biāo)準(zhǔn)化，呈現(xiàn)出非劑量依賴性[3]。關(guān)于Hyp低BA的原因及潛在原因尚不清楚。已知，首過(guò)代謝是導(dǎo)致藥物口服BA低的重要因素。肝臟代謝是大多數(shù)藥物口服首過(guò)代謝的主要發(fā)生部位。腸道黏膜同肝臟一樣，存在藥物代謝酶和藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，影響藥物吸收和代謝，產(chǎn)生腸道首過(guò)效應(yīng)。腸道首過(guò)效應(yīng)在口服藥物生利用度中的作用亦越來(lái)也受到關(guān)注。本課題前期建立的經(jīng)十二指腸（id）、門靜脈（ipv）以及外周靜脈（iv）置管建立的給藥通路動(dòng)物模型能夠定量評(píng)估藥物肝臟和腸道首過(guò)效應(yīng)[4-5]。而肝臟首過(guò)效應(yīng)還是腸道的首過(guò)效應(yīng)對(duì)Hyp生物利用度的具體影響程度尚不清楚。為此，本研究利用本課題組前期建立的成熟的動(dòng)物給藥模型探討經(jīng)十二指腸、門靜脈以及外周靜脈途徑給予不同劑量的Hyp的藥動(dòng)學(xué)特征及定量估算其肝臟與腸道首過(guò)效應(yīng)，為提高Hyp口服BA提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料 Hyp標(biāo)準(zhǔn)品為成都普瑞法公司產(chǎn)品（純度98%，NO.548-04-9），實(shí)驗(yàn)所用甲醇，乙腈均為色譜純。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器 日本島津LC-20AT型HPLC色譜儀以及LC色譜工作站。上海滬西WH-2微型漩渦混合儀、東京理化公司的氮吹儀等。

1.3 腸道-血管給藥通路動(dòng)物模型的建立 ①實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：Wistar大鼠，平均體質(zhì)量為（250±5）g，雌雄各半，由安徽肥東長(zhǎng)臨河公司提供。②術(shù)前準(zhǔn)備：實(shí)驗(yàn)前，大鼠禁止進(jìn)食食物至少12 h，但可以自由飲水。大鼠經(jīng)3 mL·kg-1的10%水合氯醛腹腔注射麻醉后并仰臥位固定，參照前期文獻(xiàn)方法[4-5]，分別在大鼠頸動(dòng)脈、id、ipv以及iv進(jìn)行置管，留置管末端用肝素帽封管并注射少量125 U·mL-1肝素鈉生理鹽水抗凝防止管腔堵塞。

1.4 Hyp藥代動(dòng)力學(xué)檢測(cè)

1.4.1 血漿Hyp的HPLC檢測(cè)方法學(xué)建立 參照文獻(xiàn)并適當(dāng)改進(jìn)[6]。①大鼠血漿Hyp樣本前處理：參照文獻(xiàn)[6]，精密取大鼠血漿0.1 mL，加入0.3 mL甲醇/吡啶（9∶1）混合液后，渦旋振蕩1 min，14000 r/min離心3 min，取上清液，57 ℃氮?dú)獯蹈?，加?00 μL流動(dòng)相復(fù)溶，再次渦旋振蕩1 min，14000 r/min離心3 min，取上清液20 μL進(jìn)樣分析，HPLC檢測(cè)。②色譜條件：參照之前文獻(xiàn)[6]，LC-20AT型島津HPLC分析系統(tǒng)包括自動(dòng)進(jìn)樣器、熒光檢測(cè)器、溫控箱以及色譜工作站組成。色譜柱：Kromasil C18柱（5 μm，4.6×200 mm）；流動(dòng)相：甲醇/乙腈/1%磷酸二氫鈉=65/30/5；流速：1.0 mL/min；柱溫40 ℃；熒光檢測(cè)激發(fā)波長(zhǎng)315 nm、檢測(cè)波長(zhǎng)590 nm；進(jìn)樣20 μL。

1.4.2 Hyp不同給藥途徑下藥動(dòng)學(xué)特征及肝臟-腸道首過(guò)代謝評(píng)估 每種給藥途徑分別設(shè)置低、中、高三個(gè)劑量組，每組6只大鼠。實(shí)驗(yàn)前夜禁食、自由飲水，經(jīng)id給予Hyp（100 mg·g-1，200 mg·g-1，400 mg·kg-1，實(shí)驗(yàn)前用0.1%羧甲基纖維素鈉溶液配成所需濃度）；ipv （50 mg·kg-1，100 mg·kg-1，200 mg·kg-1）和iv（50 mg·kg-1，100 mg·kg-1，200 mg·kg-1）給藥，并且于給藥前（0 min）及給藥后1 min、5 min、10 min、20 min、40 min、60 min、90 min、120 min和180 min經(jīng)頸動(dòng)脈缺血0.3 mL。每個(gè)缺血時(shí)間點(diǎn)經(jīng)頸動(dòng)脈取血后，均經(jīng)股靜脈注射等量生理鹽水。血標(biāo)本經(jīng)離心后取上清液-80 ℃保存，采取上述HPLC方法測(cè)定Hyp血藥濃度。

1.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析 血漿藥物濃度-時(shí)間曲線（C-t）下面積（AUC）、半衰期（T1/2）、清除率（CL）等藥動(dòng)學(xué)參數(shù)采用DAS2.0藥動(dòng)學(xué)軟件分析，達(dá)峰時(shí)間（Tmax）、峰濃度（Cmax）等根據(jù)實(shí)測(cè)值取平均值。BA、肝臟提取率（Eh）以及腸道提取率（Ei）參照文獻(xiàn)方法計(jì)算[5-6]，即：BA=（AUCid/Doseid）/（AUCiv/Doseiv）；Eh=1-AUCipv/AUCiv；Ei=1-AUCid/AUCipv，其 中，AUCid為 經(jīng)id途 徑AUC值、Doseid為經(jīng)id途徑給藥劑量；AUCipv為經(jīng)ipv途徑AUC值、Doseipv為經(jīng)ipv途徑給藥劑量；AUCiv為經(jīng)iv途徑AUC值、Doseiv為經(jīng)iv途徑給藥劑量。采用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，劑量資料采取均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，One-Way ANOVA分析考察組間的差別，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同給藥途徑下Hyp藥動(dòng)學(xué)特征及腸道首過(guò)代謝評(píng)價(jià)

2.1.1 經(jīng)靜脈給予不同劑量的Hyp的C-t曲線及藥動(dòng)學(xué)參數(shù)分析 經(jīng)外周靜脈給予（50～200）mg·kg-1Hyp，其C-t曲線及藥動(dòng)學(xué)參數(shù)分別見(jiàn)圖1和表1。由表1可見(jiàn)，各劑量間AUCiv值隨Hyp藥物劑量升高而升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但劑量標(biāo)準(zhǔn)化后AUCiv值不呈劑量依賴性，T1/2、CL差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 經(jīng)靜脈給予不同劑量的Hyp藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（n=6）

圖1 靜脈給予不同劑量的Hyp 藥物濃度-時(shí)間（C-t）曲線（n=6）

2.1.2 經(jīng)門脈給予不同劑量的Hyp的C-t曲線及藥動(dòng)學(xué)參數(shù)分析 經(jīng)門脈給予（50-200）mg·kg-1Hyp，其C-t曲線曲線及藥動(dòng)學(xué)參數(shù)分別見(jiàn)圖2和表2。由表2可見(jiàn)，AUCipv值隨Hyp藥物劑量升高而升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但劑量標(biāo)準(zhǔn)化后AUCipv值不呈劑量依賴性；與同劑量外周靜脈AUC值相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。各劑量間T1/2、CL差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖2 經(jīng)門脈給予不同劑量的Hyp藥物濃度-時(shí)間（C-t）曲線（n=6）

表2 經(jīng)門脈給予不同劑量的Hyp藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（n=6）

2.1.3 經(jīng)十二指腸給予不同劑量的Hyp的C-t曲線及藥動(dòng)學(xué)參數(shù)分析 經(jīng)十二指腸給予（100-400）mg·kg-1Hyp，其C-t曲線及藥動(dòng)學(xué)參數(shù)分別見(jiàn)圖3和表3。由表3可見(jiàn)，id給予不同劑量Hyp，均約在20 min內(nèi)達(dá)到血藥峰濃度，AUCid值隨Hyp劑量升高而升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但顯著低于同劑量門脈及外周靜脈AUC值，劑量標(biāo)準(zhǔn)化后AUCid值呈劑量非依賴性。各劑量間Tmax、T1/2、CL/F值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 經(jīng)十二指腸給予不同劑量的Hyp藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（n=6）

圖3 經(jīng)十二指腸給予不同劑量的Hyp藥物濃度-時(shí)間（C-t）曲線（n=6）

2.2 id給予不同劑量Hyp的BA、Eh和Ei值分析 id給予（100～200）mg·kg-1Hyp后，其BA、Eh和Ei見(jiàn)表4。

表4 id給予不同劑量Hyp的BA，Eh和Ei值分析（n=6）

3 討 論

口服給藥由于其方便性和副作用小，是目前臨床中最常用的給藥途徑，但口服給藥面臨的問(wèn)題是存在生物利用度，甚至一些藥物因口服生物利用度低而導(dǎo)致應(yīng)用受限制?？诜o藥生物利用度低除了藥物腸道吸收以及藥物劑型的影響因素以外，經(jīng)歷顯著的首過(guò)效應(yīng)是主要原因。明確藥物首過(guò)效應(yīng)的發(fā)生部位以及可能的機(jī)制對(duì)于提高藥物生物利用度具有重要價(jià)值。

肝臟和腸道是首過(guò)效應(yīng)主要發(fā)生部位，但進(jìn)行藥物首過(guò)效應(yīng)研究過(guò)程中如何甄別肝臟和（或）腸道首過(guò)代謝部位以及作用程度存在困難。本課題組前期建立經(jīng)腸道、門靜脈以及外周靜脈置管建立的腸道血管給藥途徑的動(dòng)物模型能夠定量評(píng)價(jià)藥物腸道首過(guò)效應(yīng)發(fā)生部位及進(jìn)行機(jī)制研究，該方法成熟可靠、重復(fù)性好。利用該模型，我們定量評(píng)價(jià)了不同藥物的肝臟和腸道首過(guò)代謝[4-8]。通過(guò)前期的研究，本課題組掌握了通過(guò)HPLC測(cè)定大鼠血漿中Hyp含量，該方法專屬性好、靈敏度高、可靠性強(qiáng)[6]。本研究中，我們經(jīng)IVAP大鼠模式給予同劑量Hyp，十二指腸、門靜脈以及外周靜脈Hyp的AUC值隨劑量增加而增加，劑量標(biāo)準(zhǔn)化以后AUC值不呈現(xiàn)劑量依賴性，但十二指腸AUC值顯著低于門靜脈和外周靜脈AUC值，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。AUCipv略低于AUCiv，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，增加Hyp劑量不能顯著提高絕對(duì)生物利用度。Hyp經(jīng)歷了顯著的首過(guò)效應(yīng)，肝臟提取率占17%左右，而腸道提取率占88%～94%，腸道是Hyp首過(guò)效應(yīng)主要發(fā)生部位。

對(duì)某些藥物而言，腸道首過(guò)效應(yīng)起主要作用[9-10]。因此，腸道首過(guò)效應(yīng)在低口服生物利用度中的作用不容忽視，且抑制腸道CYP3A4代謝酶及P-糖蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)體酶活性可能是提高口服藥物生物利用度的有效途徑[4，6]。有研究證實(shí)[10]，貫葉金絲桃的活性成分能誘導(dǎo)細(xì)胞色素P450（CYP）3A4酶及腸道P-糖蛋白（P-gp）的轉(zhuǎn)運(yùn)活性，改變經(jīng)胃腸道吸收藥物的代謝過(guò)程，影響藥物口服生物利用度。因此，是否可以使用抑制CYP3A4代謝酶及P-gp活性的藥物，提高金絲桃素口服生物利用度，我們后續(xù)將進(jìn)行這方面研究。