基于SCoT 標(biāo)記的大豆種質(zhì)遺傳多樣性研究

王雪嬌，蘇二虎，賈利敏，趙曉宇，郭嘉華，周宇，王新華，李強(qiáng)

（內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010031）

大豆起源于我國(guó)，栽培歷史悠久，經(jīng)長(zhǎng)期自然進(jìn)化、人工馴化，產(chǎn)生了豐富的遺傳種質(zhì)資源[1]。目標(biāo)起始密碼子多態(tài)性（Start codon targeted polymorphism，SCoT）標(biāo)記是2009 年Collard 等[2]發(fā)明的新型目的基因分子標(biāo)記，其原理是根據(jù)植物基因中的ATG 翻譯起始位點(diǎn)側(cè)翼保守序列，設(shè)計(jì)18bp 單引物對(duì)基因組進(jìn)行擴(kuò)增，可能產(chǎn)生候選功能基因區(qū)的多態(tài)性標(biāo)記。它結(jié)合了ISSR、RAPD 標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)，成本低廉、操作簡(jiǎn)單、多態(tài)性高、通用性強(qiáng)，可獲得豐富的遺傳信息，并能有效的產(chǎn)生與性狀關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記，有利于輔助育種[3]；SCoT 標(biāo)記不僅可以作為SSR、ISSR、AFLP、RAPD 的有效補(bǔ)充，而且是一種能跟蹤性狀的新的分子標(biāo)記[4]。目前已在水稻、龍眼、芒果、花生、羅漢松、葡萄等作物上應(yīng)用[5-9]。該次試驗(yàn)對(duì)151 份大豆種質(zhì)進(jìn)行了多態(tài)性擴(kuò)增，分析品種間、不同地理來(lái)源群體間的遺傳關(guān)系，以期為今后的標(biāo)記輔助育種及性狀關(guān)聯(lián)位點(diǎn)的發(fā)掘奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選取151 份國(guó)內(nèi)外不同地理來(lái)源大豆代表性品種。國(guó)內(nèi)品種主要來(lái)源于黑龍江42 個(gè)、吉林40 個(gè)、內(nèi)蒙古15個(gè)、遼寧9 個(gè)、其他省區(qū)13 個(gè)、國(guó)外品種32 個(gè)。

1.2 SCoT 引物及PCR 反應(yīng)體系

82 個(gè)SCoT 引物，1～36 號(hào)引物參照Collard 等[2]，37～80號(hào)引物參照Luo 等[6]，81～82 號(hào)引物參照熊發(fā)前等[7]設(shè)計(jì)的引物，所有引物由上海生工生物工程有限公司合成。SCoT-PCR 反應(yīng)體系為20 μL，包括Mg2+濃度2.0 mmol/L、dNTPs 濃度為0.2 mmol/L、Taq 酶用量為1.5 U、引物濃度為0.250 μmol/L、DNA 模板用量為30 ng。

1.3 電泳及檢測(cè)

取10 μL 擴(kuò)增產(chǎn)物，加入2 μL 6×loading buffer，在1.5%瓊脂糖凝膠（含核酸染料）中電泳，以D2000 Marker作標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量進(jìn)行對(duì)照，在SN-NJ0601 凝膠成像系統(tǒng)觀察記錄并采集圖像。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用人工識(shí)別的方法，對(duì)清晰穩(wěn)定的主帶進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，在相同遷移位置上有帶賦值為“1”，無(wú)帶賦值為“0”，建立原始數(shù)據(jù)矩陣。

用Excel 2003 計(jì)算總條帶數(shù)多態(tài)性條帶數(shù)、多態(tài)性條帶百分率及多態(tài)性信息含量。應(yīng)用Popgene1.32 軟件計(jì)算有效等位基因數(shù)（Ne）、Nei’s 基因多樣性指數(shù)（H）、香農(nóng)信息指數(shù)（I）、不同群體間的Nei’s 遺傳一致度和遺傳距離等，并根據(jù)Nei’s 遺傳一致度采用非加權(quán)成對(duì)算術(shù)平均法（UPGMA）在Ntsys-pcVer.2.10 軟件中繪制群體間聚類關(guān)系圖。應(yīng)用POWERMARKER Version 3.25 軟件根據(jù)Nei’s（1983）遺傳距離，繪制個(gè)體間聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 SCoT 引物篩選及多態(tài)性分析

結(jié)合圖1 和表1 可以看出，82 條引物中有41 條引物能擴(kuò)增出清晰且豐富的多態(tài)性條帶，共擴(kuò)增出275 個(gè)條帶，其中，182 個(gè)具有多態(tài)性，多態(tài)性條帶百分率為66.18%。引物的多態(tài)性變幅為46.15%～100.00%，每條引物檢測(cè)的位點(diǎn)數(shù)為1～13 個(gè)，平均位點(diǎn)數(shù)為6.71 個(gè)，平均多態(tài)性位點(diǎn)4.44 個(gè)；不同引物的總條帶數(shù)、多態(tài)性條帶數(shù)差異較大，總帶數(shù)最多的引物是SC34、SC63，都為13 條；多態(tài)性條帶數(shù)最多的引物是SC17，為9 條；多態(tài)性條帶百分率最大的引物是SC21、SC82，均為100%，最低的是SC34，為46.15%。不同引物的多態(tài)信息含量（PIC）的變異范圍為0.246～0.956，平均為0.656，表明SCoT 標(biāo)記能較好地反映151 份大豆品種的遺傳多樣性。

圖1 引物SC31 對(duì)18 個(gè)大豆品種的SCoT-PCR 擴(kuò)增結(jié)果

表1 SCoT 引物在151 個(gè)大豆種質(zhì)中的擴(kuò)增結(jié)果及多態(tài)性

2.2 不同地理來(lái)源大豆品種的遺傳多樣性分析

從表2 可知，大豆資源品種群水平上的遺傳多樣性高于6 個(gè)地理來(lái)源群體的平均水平。品種群水平上的有效等位基因數(shù)（Ne）、Nei’s 基因多樣性指數(shù)（H）和香農(nóng)信息指數(shù)（I）分別為1.7227、0.4081 和0.5948；不同地理來(lái)源群體水平上分別為1.6657、0.3812 和0.5619；說(shuō)明不同地理來(lái)源大豆群體的遺傳多樣性有較大的差異。6 個(gè)不同地理來(lái)源大豆品種的有效等位基因數(shù)（Ne）變異在1.647 5～1.685 1，遼寧的有效等位基因數(shù)（Ne）最多，為1.685 1，接下來(lái)依次為國(guó)外、其他省區(qū)、吉林、黑龍江、內(nèi)蒙古。Nei’s 基因多樣性指數(shù)（H）是衡量品種間遺傳多樣性最常用的指標(biāo)之一，能夠反映物種等位基因的豐富度和均勻程度，其變異范圍為0.373 2～0.387 9，表現(xiàn)為遼寧>國(guó)外>吉林>其他省區(qū)>黑龍江>內(nèi)蒙古；香農(nóng)信息指數(shù)（I）變異范圍為0.552 4～0.568 2，表現(xiàn)為遼寧>國(guó)外>吉林>其他省區(qū)>黑龍江>內(nèi)蒙古；各項(xiàng)指標(biāo)均以遼寧最高，內(nèi)蒙古最低。綜合比較分析各項(xiàng)遺傳多樣性指數(shù)可以看出，黑龍江和內(nèi)蒙古品種的遺傳多樣性較低，遼寧和國(guó)外品種具有較高的遺傳多樣性。

表2 不同地理來(lái)源群體遺傳多樣性分析

2.3 不同地理來(lái)源大豆品種群的遺傳一致度和聚類分析

從表3 可以看出，6 個(gè)大豆地理來(lái)源群的遺傳一致度分布為0.860 4～0.965 7，平均為0.920 4，其中內(nèi)蒙古和黑龍江大豆種質(zhì)群的遺傳一致度最高，為0.965 7，遺傳距離最近；而國(guó)外和其他省區(qū)大豆種質(zhì)群遺傳一致度最低，為0.858 0，遺傳距離最遠(yuǎn)。

表3 基于SCoT 標(biāo)記的不同地理來(lái)源大豆種質(zhì)群的遺傳一致度和遺傳距離

為了進(jìn)一步揭示不同地理來(lái)源群體的親緣關(guān)系，根據(jù)種質(zhì)群間的Nei’s 遺傳一致度，利用UPGMA 法進(jìn)行聚類分析，從圖2 可以看出，遺傳相似系數(shù)在0.925 處6 個(gè)種質(zhì)群明顯的分為2 大類，即國(guó)內(nèi)和國(guó)外品種，表明國(guó)內(nèi)外大豆品種間的親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)。進(jìn)一步細(xì)分，國(guó)內(nèi)群在遺傳相似系數(shù)為0.937 處，又可分為3 個(gè)亞類，即：黑龍江、內(nèi)蒙古、吉林品種聚為一類，遼寧、其他省區(qū)品種各為一類。聚類結(jié)果與地理分布有一定的相關(guān)性。

圖2 基于SCoT 標(biāo)記的6 個(gè)不同地理來(lái)源群體UPGMA聚類分析結(jié)果

2.4 參試大豆種質(zhì)聚類分析

第Ⅰ類群共23 份材料，占參試材料的15.2%，包括其他省區(qū)9 個(gè)，吉林和遼寧各5 個(gè)，內(nèi)蒙古3 個(gè)，國(guó)外1 個(gè)；第2 類群共33 份材料，占參試材料的21.9%，主要為國(guó)外品種，包括國(guó)外大豆品種26 個(gè)，占參試國(guó)外材料的81.3%，吉林4 個(gè)，黑龍江、遼寧、內(nèi)蒙古各1 個(gè)。第Ⅱ類群主要為含有國(guó)外血緣的大豆品種，包括26 份國(guó)外引進(jìn)材料，吉林的吉引81 號(hào)、黑龍江的嫩豐15 號(hào)、內(nèi)蒙古的蒙豆14 等；吉林的公野03-5570、公野04-L15、吉育89 號(hào)都具有野生大豆血緣，國(guó)際上公認(rèn)中國(guó)是大豆的起源國(guó)，初步推測(cè)國(guó)外大豆品種是由我國(guó)野生大豆馴化，因此血緣較近。第Ⅲ類群共95 份材料，占參試材料的62.9%，包括黑龍江41 個(gè)，吉林30 個(gè)，內(nèi)蒙古11 個(gè)，國(guó)外5 個(gè)，遼寧和其他省區(qū)各4 個(gè)。

由圖3 進(jìn)一步可以看出，國(guó)內(nèi)、外品種明顯的分開，如：第Ⅱ類群33 份材料中有26 份為國(guó)外品種，表明國(guó)內(nèi)、外種質(zhì)資源遺傳基礎(chǔ)差異較大；具有野生大豆血緣的品種與國(guó)外種質(zhì)聚為一類，如：第Ⅱ類群中的公野03-5570、公野04-L15、吉育89 等與國(guó)外品種聚在一起；地方品種和育成品種明顯分開，小粒、褐色種皮、黑色種皮大豆等地方品種大多聚為一類，如：第Ⅲ類群的第三亞類11 份材料有10 份為地方品種；具有共同血緣的品種大多聚在一起，如：第Ⅲ類群的第二亞類中，具有金元血緣的元寶金、荊山璞、豐收6 號(hào)、牡豐1 號(hào)聚在一起；具有合豐35 血緣的黑農(nóng)53、合豐47、合豐50 聚在一起；相同育種單位品種大多聚在一起，如：吉林49 與吉育72、黑農(nóng)53 與黑農(nóng)2號(hào)、公野03-5570 與公野04-L15 等聚在一起；遼寧品種與其他省區(qū)品種大多聚為一類。

圖3 151 份大豆種質(zhì)基于SCoT 位點(diǎn)的UPGMA 聚類結(jié)果

3 討論與結(jié)論

Collard 等[2]認(rèn)為，在水稻種質(zhì)資源及回交群體中SCoT標(biāo)記多態(tài)性豐富，是一種實(shí)用、有效的方法，特別是對(duì)缺乏基因組信息的物種更具特殊價(jià)值；韓國(guó)輝等[10]在柑橘中也得到了類似的結(jié)果；該次研究也利用SCoT 標(biāo)記分析了大豆種質(zhì)資源及F2 后代材料，品種間、后代中多態(tài)性豐富；羅聰?shù)萚6]開展了芒果SCoT 和ISSR 分子標(biāo)記比較研究，發(fā)現(xiàn)SCoT 分子標(biāo)記多態(tài)性條帶比率高于ISSR 分子標(biāo)記，其聚類結(jié)果比ISSR 標(biāo)記更能準(zhǔn)確反映芒果品種間的親緣關(guān)系；熊發(fā)前等[7]研究發(fā)現(xiàn)，SCoT 標(biāo)記在花生屬試材中多態(tài)性豐富，多態(tài)性比率達(dá)67.01%，而在花生栽培種中只有33.84%，栽培種花生遺傳基礎(chǔ)狹窄；本研究也證實(shí)了SCoT 標(biāo)記在檢測(cè)多態(tài)性位點(diǎn)上明顯強(qiáng)于ISSR 標(biāo)記，與羅聰?shù)慕Y(jié)果一致。郭大龍等[9]利用SCoT 標(biāo)記研究葡萄遺傳多樣性指出，SCoT 標(biāo)記多態(tài)性高達(dá)93.1%，引物平均PIC 為0.82，能很好的檢測(cè)葡萄遺傳變異信息；該次研究引物多態(tài)性比率為66.18%，引物平均PIC 為0.656，較郭大龍等結(jié)果略低，不同物種中SCoT 標(biāo)記檢測(cè)的遺傳變異信息存在一定的差異。

該次研究聚類分析發(fā)現(xiàn)，國(guó)內(nèi)、外品種明顯的分開，表明國(guó)內(nèi)、外種質(zhì)資源遺傳基礎(chǔ)差異較大，可以利用國(guó)外種質(zhì)拓寬中國(guó)大豆遺傳基礎(chǔ)；具有野生大豆血緣的國(guó)內(nèi)育成品種與國(guó)外種質(zhì)聚為一類；地方品種和育成品種明顯分開，小粒、褐色種皮、黑色種皮大豆等地方品種大多聚為一類，這可能與這些地方品種含有與籽粒大小、種皮顏色、品質(zhì)、抗性等特異基因有關(guān)；具有共同血緣的品種大多聚在一起；相同育種單位品種大多聚在一起，這可能與育種者使用少數(shù)幾個(gè)骨干親本、后代選擇經(jīng)驗(yàn)相似及相同的種植環(huán)境有關(guān)；遼寧品種與其他省區(qū)品種大多聚為一類，可能因?yàn)槎际侵惺?、中晚熟品種，各育種單位種質(zhì)資源相互交流，且生態(tài)類型接近。SCoT 分子標(biāo)記技術(shù)多態(tài)性水平較高，信息含量豐富，可有效揭示大豆種質(zhì)資源的遺傳多樣性，該次研究結(jié)果可為大豆種質(zhì)資源科學(xué)評(píng)價(jià)和利用提供理論依據(jù)和參考。