基于 Cu(II)離子的復(fù)合抑制劑可降低酶脫毛過程中膠原纖維的水解

李鶴 ，周雪偉 ，程海明 ，2＊

（1.四川大學(xué)制革清潔技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室; 四川 成都 610065；2.四川大學(xué)皮革化學(xué)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室; 四川 成都 610065）

制革過程是將動(dòng)物皮通過一系列物理 、化學(xué)和機(jī) 械處 理 ，加 工 成 成 品 皮 革 ，其 中 脫 毛 是 制 革 過 程不可缺少的工序之一。傳統(tǒng)灰堿法脫毛采用硫化鈉（硫氫化鈉）以及石灰，使動(dòng)物毛發(fā)和表皮溶解至脫毛浴液中。硫化物、石灰的使用，致使傳統(tǒng)灰堿法脫毛產(chǎn)生大量固體懸浮物、硫離子污染。廢水中硫離子的存在，有釋放有毒氣體 H2S 的風(fēng)險(xiǎn)，而毛蛋白的溶解導(dǎo)致廢水中有機(jī)污染物濃度極高，加劇了廢水處理難度[1-2]。隨著國(guó)家環(huán)保政策的完善和人們對(duì)環(huán)保的日益關(guān)注，傳統(tǒng)制革行業(yè)采用清潔生產(chǎn)技術(shù)以降低污染迫在眉睫。

生物酶制劑保毛脫毛 可 從 源 頭上減少灰堿 法脫毛帶來的各類污染。然而，酶脫毛技術(shù)由于存在工藝難控制、容易導(dǎo)致皮膠原纖維過度水解、松面、爛面等成革缺陷，而尚未在制革行業(yè)得到大范圍推廣。目前市售的工業(yè)酶制劑通常成分復(fù)雜，包含多種 酶 組分 ，其中 膠 原 水 解 酶 成 分 的 存 在 ，被 認(rèn) 為 是酶脫毛過程中膠原纖維過度水解，對(duì)粒面造成損傷甚至是成革松面、爛面的根本原因。因此，如何盡量減 少 酶 制 劑 對(duì) 皮 膠 原 纖 維 的 過 度 水 解 是 酶 脫 毛 重點(diǎn)研究方向之一[3-5]。

選 育 膠 原 酶 組 分 含 量 低 的 脫 毛 專 用 酶 制 劑 可減輕皮膠原的過度水解。宋金枝等人通過基因工程手段獲得低膠 原 水解活 力 的 Wb600-KerT 蛋 白酶 ，采用涂酶法對(duì)山羊皮進(jìn)行脫毛實(shí)驗(yàn)，在角蛋白酶濃度 160 U/mL 加少量 硫 化鈉或者單獨(dú)使 用 角蛋白酶濃度 320 U/mL 時(shí)可以完全脫毛[6]。降低酶脫毛時(shí)的溫度也可減輕膠原酶對(duì)皮膠原的水解。高曉麗等人在 20～25 ℃下進(jìn)行酶脫毛實(shí)驗(yàn)，比 38～40 ℃下進(jìn)行酶 脫 毛 實(shí) 驗(yàn) 皮 損 傷 少 ， 脫 毛 廢 液 中 羥 脯 氨 酸 含 量低，但該方法導(dǎo)致酶脫毛時(shí)間大大延長(zhǎng)[7]。脫毛過程中添加膠原酶抑制劑也能抑制酶對(duì)皮膠原的水解 。陳 梅 等人 篩 選膠原 酶 抑制 劑 來降低 蛋 白酶 K 對(duì) 膠原的水解，結(jié)果表明，控制酶脫毛體系中 Cu(II)離子濃度為 6 mmol/L，酶脫毛液中羥脯氨酸含量?jī)H為對(duì)照組的一半，成革粒面清晰。但 Cu(II)離子的加入減緩了蛋白酶 K 的脫毛速率；控制酶脫毛體系中水楊酸根 離子濃度為 20 mmol/L，可加快提高了脫 毛速率，但其羥脯氨酸含量高于對(duì)照組。這表明在脫毛實(shí)驗(yàn)中，膠原酶抑制劑對(duì)蛋白酶的膠原酶組分和酪蛋白酶組分的水解能力均產(chǎn)生影響[8]。江明芳等人考察了丙二酸鈉、丁二酸鈉、EDTA、兒 茶 素、沒食子酸鈉等 材料對(duì) AS1.398 酶 脫毛過程中粒面?zhèn)?害 的影 響 ，結(jié)果發(fā)現(xiàn) EDTA 使膠原酶和酪蛋白水解酶都完全失去活性，而二元羧酸鹽和植物多酚類化合物的加入對(duì)酪蛋白活性的影響較小，卻能明顯減少酶脫毛過程中的粒面?zhèn)?。?AS1.398 蛋白酶脫毛體系中，外加一 定 濃度的 二 價(jià)金 屬 離 子如 Zn (II)、Mn (II)、Mg (II)離子顯示出抑制皮膠原的水解，明顯降低了皮革的爛面和松面現(xiàn)象[9-10]。同時(shí)，有研究表明一定濃度的Zn(II)、Fe(II)、Cr(III)、Cu (II) 離 子 顯 示 出 對(duì) AS1.398 蛋白酶水解酪蛋白活力的抑制，而在酶脫毛體系中酪蛋白活力的降低會(huì)導(dǎo)致脫毛速率的下降[11]。

綜合以上研究表明，某些無(wú)機(jī) 金屬離子和小分子有機(jī)配體均可抑制膠原酶組分活力。為了減少脫毛 過 程 中 酶 對(duì) 皮 膠 原 纖 維 的 過 度 水 解 并 保 證 脫 毛效 率 ，本 研 究在 前 期 工 作 基 礎(chǔ) 上 ，考 察 金 屬 離 子 和小分子有機(jī)配體復(fù)合抑制劑對(duì) AS1.398 蛋白酶對(duì)底物 分 別 為膠 原纖 維和 酪素 蛋白 的 水 解 活 力 的 影 響 ，并將篩選出的復(fù)合抑制劑用于黃牛皮酶脫毛過程。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料和主要儀器

鹽腌黃牛皮，購(gòu)于成都地區(qū)；AS1.398 中性蛋白酶（50 000 U/g 活 力），云南 陸 良 酶 制 劑 廠 ；酪 素 、水楊酸鈉、丁二酸鈉，分析純，成都金山化學(xué)試劑有限公司；硫酸銅、氯化鋅、三氯化鐵，分析純，成都市科隆化學(xué)品有限公司；膠原纖維，實(shí)驗(yàn)室自制；用于制革工藝的試劑均為工業(yè)級(jí)，其他試劑均為分析純。

HZS-HA 型水 浴 振蕩器，哈爾濱東聯(lián)電子 技 術(shù)開發(fā)有限公司；UV1900 型紫外分光光度計(jì)，上海菁華科技儀器有限公司；STENI 型自控溫四聯(lián)轉(zhuǎn)鼓，中國(guó)無(wú)錫 新 達(dá)輕工機(jī)械有限公 司 ；JSM-7500F 型掃描電鏡，日本電子株式會(huì)社。

1.2 酶活力的測(cè)定

在 40 ℃下，pH=7.2，以 2% 酪素為底物，采用福林法測(cè)定 AS1.398 酶對(duì)酪蛋白的水解活力[12]，根據(jù)酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酶活力。在 40 ℃下，pH=7.5，以自制膠原纖維為底物，采用茚三酮法測(cè)定 AS1.398 酶對(duì)膠原纖維的水解活力[13]，根據(jù)亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酶活力。

1.3 抑制劑對(duì)酶活力的影響

用上述方法測(cè)定了抑制劑對(duì) AS1.398 酶活力的影響。臨反應(yīng)前，配制單一抑制劑、復(fù)合抑制劑,分別與 AS1.398 酶溶液在反應(yīng)溫度下恒溫水浴 30 min 后測(cè)量酶活，以省略加抑制劑步驟測(cè)量酶活為對(duì)照組。不同濃度均設(shè)置 3 次平行實(shí)驗(yàn)，然后用相對(duì)活性來評(píng)價(jià)抑制劑的影響，相對(duì)酶活由等式（1）計(jì)算出來的:

1.4 酶脫毛實(shí)驗(yàn)

鹽腌黃牛皮經(jīng)過常規(guī)浸水去肉工序，沿背脊線對(duì)稱切成 25 cm × 30 cm 的皮塊，較長(zhǎng)的一側(cè)平行于背脊線。酶脫毛的工藝參數(shù)為：溫度 35 ℃，液比1.5，pH 8.0（Na2CO3調(diào)節(jié)）。

投皮入鼓，在加入酶制劑脫毛前，先加入復(fù)合抑制劑，首先加入稱量的 CuSO4，以 6 r/min 轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)動(dòng) 10 min，控制浴液中 Cu(II)離子濃度為 5 mmol/L；再加入定量的第二抑制劑，再轉(zhuǎn)動(dòng) 10 min。加入AS1.398 中性蛋白酶，酶用量為 200 U/g 皮，開始酶脫毛，轉(zhuǎn)動(dòng) 30 min 后停 30 min，然后每 60 min 轉(zhuǎn)動(dòng)5 min，觀察脫毛情況，收集脫毛液測(cè)定其中的總蛋白(TP)、羥脯氨酸(Hyp)和多糖的含量。脫毛實(shí)驗(yàn)組依次 為 (A): 5 mmol/L Cu (II) + 10 mmol/L Fe (III)、(B): 5 mmol/LCu(II) + 3 mmol/L 水楊酸鈉、(C): 5 mmol/L Cu(II) + 20 mmol/L 丁二酸鈉、(D): 5 mmol/L Cu(II)。脫毛結(jié)束后按照常規(guī)工藝對(duì)裸皮浸灰、脫灰、浸酸、鉻鞣、提堿、中和加脂工序獲得坯革，干燥振軟后測(cè)定其物理機(jī)械性能。按照以上工藝，省略抑制劑加步驟酶脫毛(E)以及常規(guī)灰堿法脫毛(F)作為對(duì)照組。

1.5 脫毛液分析

脫毛液以 8000 r/min 離心 5 min 并稀釋。采用Lowry 法測(cè)定總蛋白（TP）含量[14]。采用氯胺 T 法測(cè)定羥脯氨酸（Hyp）含量[15]。采用硫酸苯酚法測(cè)定多糖含量[16]。

1.6 掃描電鏡觀察

脫毛結(jié)束后，取 5 cm×5 cm 裸皮樣品，置于 10%中性福爾馬林中固定 24 h。皮樣經(jīng)干燥和噴金處理，使用 JSM-7500F 型掃描電鏡在 15 kV 下觀察粒面。

1.7 物理機(jī)械性能測(cè)試

坯革試樣經(jīng) 20 ℃、相對(duì)濕度 65%的空氣調(diào)節(jié)48 h，采用 QB/T2710-2018 標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定抗張強(qiáng)度和撕裂強(qiáng)度。

2 結(jié)果與討論

2.1 單一抑制劑對(duì)酶活力的影響

以酪蛋白和膠原纖維作為底物，在 40 ℃下測(cè)定 AS1.398 酶對(duì)兩種底物的水解活力隨抑制劑濃度的變化，其 中 抑 制劑濃度為 0 ～20 mmol/L，結(jié) 果 分別如表 1、表 2 所示。

表1 抑制劑對(duì) AS1.398 蛋白酶水解酪蛋白活力的影響Tab.1 The effect of the inhibitors on casein hydrolytic of AS1.398 protease

表2 抑制劑濃度對(duì) AS1.398 蛋白酶水解膠原纖維活力的影響Tab.2 The effect of the inhibitors on collagen fiber hydrolytic of AS1.398 protease

金屬離子對(duì) AS1.398 酶活力的影響結(jié)果顯示，其水解酪蛋白活力隨 Cu(II)、Zn(II)、Fe(III)三種金屬離子濃度的增加而降低，濃度為 5 mmol/L 時(shí)能保持至少62.0%的酪蛋白水解活力。當(dāng)加入的金屬離子濃度增至 20 mmol/L 時(shí)，AS1.398 酶對(duì)酪蛋白的水解活力分別 只 剩 余 33.6%（Cu (II) 離 子）、3.2%（Zn (II) 離 子）和9.3%（Fe(III)離子）。而這三種金屬離子對(duì) AS1.398 酶水解膠原纖維的抑制作用隨離子濃度增加而緩慢增強(qiáng)。當(dāng) Cu(II)、Zn(II)和 Fe(III)離子濃度為 5 mmol/L 時(shí)，AS1.398 酶 對(duì) 膠 原 纖 維 的 水 解 活 力 分 別 為 39.4% 、65.7%和 48.1%；當(dāng)離子濃度增至 20 mmol/L，AS1.398酶水解膠原纖維的活力只 剩 余 17.6%（Cu(II)離子）、21.1%（Zn(II)離子）和 16.4%（Fe(III)離子）?？赡苁且?yàn)榻饘匐x子替代了膠原酶組分活性中心具有催化作用的 Zn(II)離子，這種替代反應(yīng)造成了活性部位結(jié)構(gòu)改變，導(dǎo)致酶活性降低[17-18]。綜上，加入 5 mmol/L Cu(II)離子時(shí)，AS1.398 酶水解酪蛋白活力保留 87.8%，同時(shí)水解膠原纖維活力剩余不足 40%。因此，為了保留較高的酪蛋白活力和較低的膠原纖維水解活力，本實(shí)驗(yàn)選擇 5 mmol/L Cu(II)離子為復(fù)合抑制劑之一，并在此基礎(chǔ)上選擇第二種抑制劑。

有機(jī)小分子配體對(duì) AS1.398 酶活力的影響結(jié)果顯示，當(dāng)水楊酸鈉的濃度在 2 mmol/L 以內(nèi)時(shí)，其對(duì)AS1.398 酶水解酪蛋白活力有一定的激活作用。當(dāng)體系中水楊酸鈉濃度繼續(xù)升高時(shí)，顯示出對(duì)酪蛋白水解活力的抑制，并隨水楊酸鈉濃度升高抑制作用增強(qiáng)，當(dāng)濃度為 10 mmol/L 時(shí)，酪蛋白水解活力幾乎只剩余一半。水楊酸鈉濃度對(duì) AS1.398 酶水解膠原纖維活力抑制效果明顯且?guī)缀醪浑S濃 度的改變而產(chǎn)生明顯的變化，當(dāng)其濃度為 1～20 mmol/L 時(shí)，水解膠原纖維活力保持在 40%左右。至于丁二酸鈉，在實(shí)驗(yàn)測(cè)試濃度下，幾乎不影響 AS1.398 酶水解酪蛋白的活力，而能有效抑制其對(duì)膠原纖維的水解活力。水楊酸鈉和丁二酸鈉的羧基能通過絡(luò)合膠原酶活性中心的催化 Zn(II)離子，影響酶與膠原的結(jié)合能力，降低了膠原酶的活力[19]。

2.2 復(fù)合抑制劑對(duì)酶活力的影響

以膠原纖維和酪蛋白作為底物，Cu(II)離子濃度為 5 mmol/L 時(shí)，在 40 ℃下測(cè)定 AS1.398 酶對(duì)兩種底物的水解活力隨 第 二 種抑制劑濃度的變 化 ，結(jié)果分別如圖 1、圖 2 所示。從圖 1 可看出，與單一抑制劑（5 mmol/L Cu(II)）比較，添加第二種抑制劑能顯著提高對(duì)膠原纖維水解活力的抑制。當(dāng)?shù)诙N抑制劑濃度為 5 mmol/L 時(shí)，水解膠原纖維相對(duì)活力分 別 為：22.2%（Zn (II)離 子）、21.5%（Fe (III) 離子）、5.0%（水楊酸鈉）和 10.0%（丁二酸鈉）。隨第二種抑制劑濃度的增大，抑制效果有逐漸增強(qiáng)的趨勢(shì)，而當(dāng)?shù)诙N抑制劑為 10 mmol/L 小分子有機(jī)配體時(shí)抑制效果減弱，這可能是因?yàn)榉磻?yīng)體系中的 Cu(II)離子與小分子有機(jī)配體發(fā)生反應(yīng)，而形成的配合物抑制酶活效果稍弱于消耗掉的 Cu (II)離子和小分子有機(jī)配體，使得該濃度下的復(fù)合抑制劑對(duì)酶活的抑制效果減弱。

圖1 基于 5 mmol/L Cu(II)離子復(fù)合抑制劑對(duì) AS1.398 酶水解膠原纖維活力的影響Fig. 1 The effect of compounding inhibitors on AS1.398 protease hydrolysis of collagen fiber

蛋白酶對(duì)酪蛋白的水解活力在酶脫毛過程中起主要脫毛作用[3]。由圖 2 可知，與單一抑制劑（5 mmol/L Cu (II)） 比較，添加不同的第二種抑制劑對(duì)AS1.398 酶水解酪蛋白活力的作用有不同的影響：第二種抑制劑為 Zn(II)離子和水楊酸鈉時(shí)，能進(jìn)一步抑制酪蛋白水解活力；而第二種抑制劑為丁二酸鈉時(shí)，酪蛋白水解相對(duì)活力則被提高；此外，第二種抑制劑為 Fe(III)離子時(shí)，在濃度為 5 mmol/L 以內(nèi)時(shí)，酪蛋白水解活力得到釋放，但當(dāng) Fe (III) 離子濃度為 10 mmol/L 時(shí)，酪蛋白水解活力為 67.7%，F(xiàn)e(III)離子濃度升高至 20 mmol/L 時(shí)，相對(duì)活力僅為 1.7%。

圖2 基于 5 mmol/L Cu(II)離子復(fù)合抑制劑對(duì) AS1.398酶水解酪蛋白活力的影響Fig. 2 The effect of compounding inhibitors on AS1.398 protease hydrolysis of casein

綜上，選擇對(duì)膠原纖維水解活力低于 20%且對(duì)酪蛋白水解活力高于 65%的復(fù)合抑制劑進(jìn)行酶脫毛實(shí)驗(yàn)，脫毛實(shí)驗(yàn)組依次為(A): 5 mmol/L Cu(II) + 10 mmol/L Fe(III)、(B): 5 mmol/L Cu(II) + 3 mmol/L 水楊酸鈉、(C): 5 mmol/L Cu(II) + 20 mmol/L 丁二酸鈉、(D):5 mmol/L Cu(II)、(E): 不加抑制劑酶脫毛、(F): 常規(guī)灰堿法脫毛。

2.3 酶脫毛情況

使用溫度為 35 ℃，初始 pH 為 8.0，酶用量為 200 U/g 皮的條件進(jìn)行脫毛實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表 3 所示。結(jié)果顯示，與對(duì)照組 E（5 mmol/L Cu(II)）相比，實(shí)驗(yàn)組A（5 mmol/L Cu(II) + 10 mmol/L Fe(III)）嚴(yán)重影響了酶脫毛速率，在第 9 小時(shí)毛根有明顯松動(dòng)，直到脫毛結(jié)束時(shí)仍有許多小毛脫不凈。實(shí)驗(yàn)組 B（5 mmol/L Cu(II)+ 3 mmol/L 水楊酸鈉）、實(shí)驗(yàn)組 C（5 mmol/L Cu(II) + 20 mmol/L 丁二酸鈉）和實(shí)驗(yàn)組 D（5 mmol/L Cu(II)）脫毛4～5 h 后，毛可以很容易被去除。與實(shí)驗(yàn)組 D 和對(duì)照組 E 相比，使用 Cu(II)與小分子有機(jī)配體復(fù)合抑制劑的實(shí)驗(yàn)組 B 和實(shí)驗(yàn)組 C 能減少小毛的殘留，并增強(qiáng)了酶脫毛過程中對(duì)蛋白和多糖的水解。

表3 復(fù)合抑制劑對(duì)酶脫毛的影響Tab.3 The effect of compounding inhibitors on enzymatic unhairing

脫毛后的皮塊樣品經(jīng)過干燥噴金處理，在掃描電鏡下觀察 AS1.398 酶對(duì)粒面的水解程度，結(jié)果見圖 3。與灰堿法 F 相比，實(shí)驗(yàn)組 A 粒面和毛孔結(jié)構(gòu)在酶的長(zhǎng)時(shí)間作用下被嚴(yán)重破壞。實(shí)驗(yàn)組 B、實(shí)驗(yàn)組D 和實(shí)驗(yàn)組 E 粒面的清晰度不如實(shí)驗(yàn)組 C，這與脫毛液中的 Hyp 含量結(jié)果一致。

圖3 脫毛皮樣粒面掃描電鏡圖(A): 5 mmol/L Cu(II) + 10 mmol/L Fe(III)、(B): 5 mmol/L Cu(II) + 3 mmol/L 水楊酸鈉、(C): 5 mmol /L Cu(II) + 20 mmol/L 丁二酸鈉、(D): 5 mmol/L Cu(II)、(E): 不加抑制劑酶脫毛、(F): 常規(guī)灰堿法脫毛Fig. 3 SEM observations on grain morphologies of enzymaticunhaired samples(A): 5 mmol/L Cu(II) + 10 mmol/L Fe(III); (B): 5 mmol/L Cu(II) + 3 mmol/L salicylate; (C): 5 mmol/L Cu(II) + 20 mmol/L succinate; (D): 5 mmol/L Cu(II); (E): enzymatic unhairing without inhibitors; (F):traditional sulfide-lime unhairing

坯革物理機(jī)械性能測(cè)試結(jié)果表明酶脫毛革樣的抗張強(qiáng)度和撕裂強(qiáng)度均稍低于常規(guī)灰堿法脫毛（表 4）。使用 Cu(II)離子和小分子有機(jī)配體復(fù)合抑制劑脫毛的實(shí)驗(yàn)組 B 和 C，革樣撕裂強(qiáng)度有一定提高，其中實(shí)驗(yàn)組 C 組與灰堿法 F 相當(dāng)。而酶脫毛革樣的抗張強(qiáng)度說明酶脫毛后后續(xù)工序的工藝調(diào)整仍需進(jìn)一步研究。

表4 坯革力學(xué)性能Tab.4 Physical and machinal properties of crust leather

3 結(jié)論

本研究以 5 mmol/L Cu(II)離子為復(fù)合抑制劑的一種，考察了第二種抑制劑對(duì) AS1.398 酶水解活力的影響，并在此基礎(chǔ)上選出復(fù)合抑制劑進(jìn)行黃牛皮酶脫毛實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，一定濃度的 Cu(II) + Fe(III)、Cu(II) + 水楊酸鈉和 Cu(II) + 丁二酸鈉復(fù)合抑制劑可以有效抑制 AS1.398 酶對(duì)膠原纖維的水解能力，并維持較高的酪蛋白水解能力。脫毛應(yīng)用實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，采用 5 mmol/L Cu(II) + 20 mmol/L 丁二酸鈉復(fù)合抑制劑進(jìn)行酶脫毛，可保證脫毛時(shí)長(zhǎng)不增加而脫毛完成時(shí)小毛殘留少，皮革粒面清晰度高。