發(fā)光細(xì)菌法評(píng)價(jià)坯革生態(tài)安全性的毒性參照物替代及應(yīng)用

何發(fā)明 ，彭良瓊 ，隆汶君 ，張文華 ，＊

（1.四川大學(xué)皮革化學(xué)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610065;2.四川大學(xué)制革清潔技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610065）

前言

隨著科技和經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，生產(chǎn)過(guò)程潛在的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)越發(fā)引起關(guān)注。針對(duì)化學(xué)物質(zhì)和復(fù)雜的水環(huán)境，通常毒性測(cè)試的受試生物有蚤類[1]、魚類[2]、水藻類[3]和發(fā)光細(xì)菌[4]。其中采用發(fā)光細(xì)菌進(jìn)行生物毒性測(cè)試法以其操作簡(jiǎn)單、實(shí)驗(yàn)周期短、價(jià)格低廉等特點(diǎn)，于 1979 年 被美國(guó)檢驗(yàn)和材料學(xué) 會(huì)（American Society for Testing and Materials）認(rèn)定為“Microtox”測(cè)試 方 法 ， 并 相 繼 成 為 GB/T 15441-1995 和 ISO 11348-3:1998 水質(zhì)急性毒性檢測(cè) 的標(biāo)準(zhǔn)方法，目前被廣 泛 運(yùn)用 于 化學(xué)品[5-6]、以及 食 品[7]、坯革[8]、土 壤[9]等復(fù)雜基質(zhì)的急性毒性測(cè)定。由于活性菌密度會(huì)影響毒性測(cè)試的靈敏度和重現(xiàn)性，發(fā)光細(xì)菌法須用毒性參照物確定測(cè)試菌密度[10]。例如，ISO 11348-3 規(guī)定 K2Cr2O7為標(biāo)準(zhǔn)毒物，而我國(guó)國(guó)標(biāo)以 HgCl2為標(biāo)準(zhǔn)毒物[11]。但無(wú)論是 Cr(VI)或 Hg(II)，特別是 Hg(II)，其自身毒性都比較大，對(duì)人體健康和環(huán)境安全可能造成危害，也提高了測(cè)試機(jī)構(gòu)的日常管理成本[12-13]。因此，選用其他毒性參照物替代是很有必要的。

參比物質(zhì)的選擇原則為價(jià)格低廉，易溶解、形態(tài)穩(wěn)定、對(duì)人和環(huán)境危害低[14]，為了排除顏色對(duì)發(fā)光強(qiáng)度測(cè)定可能帶來(lái)的干擾，參比物質(zhì)最好無(wú)色，因此有色的金屬離子如 Cu(II)，F(xiàn)e(II)，F(xiàn)e(III)，Co(II)，Ni(II)均不適合作為參比物質(zhì)。另外由于發(fā)光細(xì)菌有最適 pH 范圍，例如明亮發(fā)光桿菌在 pH 4～9 范圍內(nèi)發(fā)光強(qiáng)度穩(wěn)定[15]，因此參比物質(zhì)在其 最 適 pH 范圍內(nèi)也應(yīng)該形態(tài)穩(wěn)定或單一。有研究表明，Zn(II)可以作為毒性參比物質(zhì)直觀地表征環(huán)境樣品的毒性[16]，但是缺乏 Zn(II)的無(wú)機(jī)配體對(duì)其毒性測(cè)定的影響，也沒(méi)有在檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)中應(yīng)用。因此本文針對(duì) Zn(II)的無(wú)機(jī)配體 SO42-和 Cl-，研究了其對(duì) Zn(II)的形態(tài)分布、存放穩(wěn)定性和毒性的影響，選取了適當(dāng)?shù)膮⒈忍娲⒉捎么藚⒈忍娲镔|(zhì)測(cè)試了常見(jiàn)鞣劑鞣制坯革的生態(tài)毒性。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

酵母浸粉、胰蛋白胨，購(gòu)于北京博興 生 物 技術(shù)有限公司；HgCl2，購(gòu)于姜堰市環(huán)球試劑廠；ZnSO4·7H2O、ZnCl2、NaCl、Na2HPO4·12H2O、K2HPO4·3H2O、丙三醇均為分析純，購(gòu)于成都金山化學(xué)試劑 有限公司。明亮發(fā)光桿菌 T3 變種凍干粉，自制；鞣制坯革，自制，包括鉻鞣革、甲醛鞣革、兩性鞣劑 T 鞣革和有機(jī)膦鞣革。

Lumi Fox6000 生物毒性測(cè)試儀，ZWY-2012C恒溫培養(yǎng)震蕩箱，UV-1800BPC 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) ，LDX-50KBS 高 壓 蒸 汽 滅 菌 鍋 ， 梅 特 勒FE20-Five Easy Plus TM pH 計(jì)，E3000YB 電子天平，CJ- 2FD 潔凈工作臺(tái)，Retsch SM 100 切割研磨儀。所用設(shè)備生產(chǎn)廠見(jiàn)文獻(xiàn)[17]。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)光細(xì)菌的培養(yǎng)

培養(yǎng)基按照文獻(xiàn)[18]配置，將明亮發(fā)光桿菌凍干粉加入 3% NaCl 復(fù)蘇，復(fù)蘇后按照文獻(xiàn)優(yōu)化培養(yǎng)[18]，在第二次接種后培養(yǎng) 18 h，立即用于毒性測(cè)試。

1.2.2 Visual Minteq 模擬計(jì)算

模擬不考慮氣相、氧化還原反應(yīng)以及吸附反應(yīng)，溫度設(shè)置為 25 ℃，采用熱力學(xué)平衡原理，硫酸鋅和氯化鋅的濃度設(shè)置為其對(duì)發(fā)光細(xì)菌的 EC50值[19]。各模擬體系離子強(qiáng)度 I＜＜4 mol/L?？紤]到參比物質(zhì)pH 的測(cè)試范圍為 4～9，pH 掃描范圍為 1～14。

1.2.3 菌密度的測(cè)定

取第二次接種后的新鮮菌液，加入 3%NaCl 溶液進(jìn)行稀釋，配置成不同菌密度的菌懸液。菌密度的測(cè)定方法見(jiàn)文獻(xiàn)[10]，分別以 0.1 mg/L 的 HgCl2和EC50值的 ZnSO4溶液作為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，測(cè)試其相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度穩(wěn)定在（50±10）%的菌密度范圍。

1.2.4 參比物質(zhì)生態(tài)毒性的測(cè)定

以 0.1 mg/L HgCl2作為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照樣，以 3% NaCl作為標(biāo)準(zhǔn)空白樣，每個(gè)濃度梯度設(shè)置三個(gè)平行，各濃度均采用 3%的氯化鈉溶液配制。

1.2.5 鞣制坯革的生態(tài)安全性測(cè)定

參照文獻(xiàn)[17]的方法制備坯革樣品浸提液，抽濾，調(diào)節(jié)濾液 pH 為 7，加入 NaCl 使濾液的 NaCl 為 30 g/L，并用 30 g/L 的 NaCl 進(jìn)行梯度稀釋，然后選用替代參比物質(zhì)作為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，3%的 NaCl 作為空白對(duì)照，進(jìn)行毒性測(cè)定。每個(gè)樣品設(shè)置三個(gè)平行。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用 Origin 8.0 擬合樣品濃度及相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度獲得劑量 - 效應(yīng)曲線，計(jì)算其 EC50（明亮發(fā)光桿菌相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度為 50%時(shí)的濃度）。高的 EC50值表明樣品對(duì)發(fā)光細(xì)菌的毒性小。

2 結(jié)果與討論

2.1 無(wú)機(jī)配體對(duì)溶液中鋅離子形態(tài)分布的影響

運(yùn)用 Visual Minteq 軟件，基于熱力學(xué)平衡，計(jì)算 ZnSO4和 ZnCl2中 Zn 的形態(tài)隨 pH 變化的分布，結(jié)果見(jiàn)圖 1 (a)，(b)。水溶液的模擬結(jié)果表明，ZnSO4和 ZnCl2中 Zn 主要存在形態(tài)一致，不受陰離子的影響。在 pH 1～7 范圍內(nèi)，鋅以單核鋅離子存在，其主要組分為約占 99%的 Zn(II)。但在 pH 7～14 范圍內(nèi)，鋅的成分復(fù)雜且隨 pH 增加主要成分變化較大。例如 pH 為 10 時(shí)，鋅主要以 96%的溶膠態(tài) Zn(OH)2(aq)存在；pH=12 時(shí)，鋅主要以 67%的[Zn(OH)3]-存在，其次是 19%溶膠態(tài) Zn(OH)2(aq)和 13%的[Zn(OH)4]2-。

圖1 Zn 的形態(tài)隨 pH 的分布a：1.23 mg/L 的 ZnSO4；b：0.92 mg/L 的 ZnCl2；c：1.23 mg/L 的 ZnSO4 +30 g/L 的NaCl；d：0.92 mg/L 的 ZnSO4 +30 g/L 的 NaClFig.1 The distribution of zinc species with pHa: 1.23 mg/L zinc sulfate; b: 0.92 mg/L zinc chloride; c: 1.23 mg/L zinc sulfate and 30 g/L sodium chloride; d: 0.92 mg/L of zinc chloride and 30 g/L of sodium chloride

考慮到明亮發(fā)光桿菌屬于需鹽菌，需要添加3%的 NaCl 才能維持其生長(zhǎng)，在測(cè)試過(guò)程也需要維持 3%的滲透壓，因此進(jìn)一步計(jì)算了 ZnSO4和 ZnCl2在 30 g/L 氯化鈉溶液中，Zn 隨 pH 的形態(tài)分布，如圖 1(c)，(d)。結(jié)果表明，鹽介質(zhì)對(duì) ZnCl2的形態(tài)分布幾乎沒(méi)有影響，但 ZnSO4溶液的形態(tài)組分增加。ZnSO4的鹽溶液在 pH 1～8 范圍內(nèi)，除了占比 65%的Zn2+，還有占比約 25%的 [ZnCl]+以及 5%的溶膠態(tài)ZnCl2(aq)和 3%的 Zn(OH)2(aq)，但這幾種形態(tài)在 pH 1～8 范圍內(nèi)組成恒定。而 ZnCl2的鹽溶液在 pH 1～8范圍內(nèi)成分仍為 99%的 Zn(II)。pH 8～14 范圍內(nèi)，Zn的成分復(fù)雜且隨 pH 增加主要成分變化較大。例如pH 為 10 時(shí)，Zn 主要以溶膠態(tài) Zn (OH)2(aq)（占比94%）存在，還有少量[Zn(OH)3]-（占比約 4%）；pH=12時(shí)，鋅主要以[Zn(OH)3]-存在，占比 62%，其次是溶膠態(tài) [Zn (OH)4]2-（占 比 24%）和 Zn (OH)2(aq)（占 比12%）。對(duì)比 c，d 在 pH 為 1～8 范圍內(nèi)的形態(tài)分布，其形態(tài)組成隨 pH 結(jié)構(gòu)單一，都可以作為毒性測(cè)試的參比物質(zhì)。

2.2 無(wú)機(jī)配體對(duì)鋅鹽存放的穩(wěn)定性影響

ZnCl2的吸濕能力極強(qiáng)，在空氣中極易潮解[20]。因此，通過(guò)分析天平對(duì)ZnSO4和 ZnCl2的質(zhì)量與時(shí)間的關(guān)系進(jìn)行了研究，如圖 2。結(jié)果表明，稱取16.02 mg ZnCl28 min 后達(dá)到平衡為 17.18 mg，增長(zhǎng)率為 7%，稱量誤差很大，會(huì)導(dǎo)致測(cè)試溶液的濃度偏低。而 ZnSO4的質(zhì)量隨時(shí)間幾乎沒(méi)有變化，因此 ZnSO4比 ZnCl2存放穩(wěn)定性好。

圖2 Zn(II)的存放穩(wěn)定性Fig.2 Storage stability of zinc salts

2.3 硫酸鋅和氯化鋅的毒性

選用 HgCl2作為參比物質(zhì)，測(cè)定了系列梯度濃度 ZnSO4比 ZnCl2的相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度。結(jié)果如圖 3 所示，隨著 ZnSO4比 ZnCl2濃度的增加，相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度降低，對(duì)明亮發(fā)光桿菌的毒性增加。根據(jù) Origin8.0 中 Dose-Resp 模型擬合，圖 3(a)的擬合方程為相關(guān)系數(shù)R2=0.9949。根據(jù)擬合曲線，計(jì)算得出 ZnSO4的 EC50=1.23 mg/L，標(biāo)準(zhǔn)偏差為 0.02 mg/L，95%置信區(qū)間為1.17～1.29 mg/L。圖 3(b)用 Logistic 模型進(jìn)行擬合，方程為根據(jù)擬合曲線和SPSS 軟件，可計(jì)算出 ZnCl2的 EC50= （0.97±0.02）mg/L，95%置信區(qū)間為 0.92～1.03 mg/L，相關(guān)系數(shù)為0.9982。因此，對(duì)發(fā)光細(xì)菌的毒性大小為：ZnCl2的毒性＞ZnSO4的毒性。通過(guò)毒性測(cè)試結(jié)果可以看出，ZnSO4的毒性小于 ZnCl2的毒性。結(jié)合形態(tài)分布和存放穩(wěn)定性結(jié)果，選用 ZnSO4作為參比物質(zhì)。

圖3 ZnSO4 比 ZnCl2 的劑量效應(yīng)曲線Fig.3 The dose-response curves of zinc sulfate and zinc chloride

2.4 參比物質(zhì)調(diào)控菌密度的有效性

菌密度會(huì)影響毒性測(cè)試的相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度，從而影響測(cè)試的靈敏度及準(zhǔn)確性[10]。因此，選取毒性參比物是很有必要的。參比物質(zhì) 1.23 mg/L ZnSO4和 0.1 mg/L 的 HgCl2與菌密度的關(guān)系如圖 4 可以看出，過(guò)高或過(guò)低的菌密度都不利于毒性測(cè)試。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)，EC50值濃度的參比物質(zhì)相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度在 40%～60%時(shí)，測(cè)試結(jié)果有效。0.1 mg/L 的氯化汞的有效性在菌密度 0.73～0.98 范圍內(nèi)，而 1.23 mg/L ZnSO4的有效性為菌密度 0.86～1.04。

圖4 參比物質(zhì)與菌密度的關(guān)系Fig.4 Relationship between reference substance and bacterial density

2.5 鞣制皮坯的生態(tài)安全性測(cè)試

選取鉻鞣革、甲醛鞣革、兩性鞣劑 T 鞣革和有機(jī)膦鞣革，采用 1.23 mg/L ZnSO4作為參比物質(zhì)確定測(cè)試菌密度，按照 1.2.5 方法，用發(fā)光細(xì)菌評(píng)價(jià)這 4種鞣制坯革浸出液的生態(tài)毒性，結(jié)果見(jiàn)圖 5。由圖 5可知，隨著鞣制坯革浸出液濃度的增加，明亮發(fā)光桿菌的相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度減少，其毒性增強(qiáng)。采用 Logistic 函數(shù)對(duì)鉻鞣浸出液和甲醛鞣革浸出液測(cè)試數(shù)據(jù) 進(jìn) 行 擬 合 ， 擬 合 方 程 為 ：y =-25.82+，相關(guān)系數(shù)為 0.9948，計(jì)算得出鉻鞣浸出液的 EC50體積分?jǐn)?shù)為 42.61%，即 21 305 mg/L。對(duì)甲醛鞣革浸出液的數(shù)據(jù)擬 合 方 程 為 ：y =7.17+甲醛鞣革浸出液的 EC50體積分?jǐn)?shù)為 50.57%，即 25，相關(guān)系數(shù)為 0.9912。而有機(jī)膦鞣革浸出液的毒性較低，浸出液的體積分?jǐn)?shù)為 100%時(shí)，對(duì)發(fā)光細(xì)菌的相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度仍然有 60%，因此無(wú)法計(jì)算出其 EC50值。所以鞣制皮坯浸出液對(duì)發(fā)光細(xì)菌的 毒 性 大 小 為 ： 鉻 鞣 ＞ 甲 醛 鞣 ＞ 兩 性 鞣 劑 T 鞣革＞＞有機(jī)膦鞣革。西班牙 833/1988 號(hào)法令以明亮發(fā)光桿菌為受試生物，當(dāng)固廢浸出液 EC50低于 3000 mg/L，即判定為危險(xiǎn)廢棄物[21]，而本文所測(cè)定的 EC50值均遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其閾值，表明現(xiàn)有常用鞣劑鞣制皮坯的廢棄物不能視為危廢，具有基本的生態(tài)安全性。825 mg/L。兩性鞣劑 T 鞣革浸出液采用 Dose-Resp 擬合計(jì)算得出 EC50體積分?jǐn)?shù)為 67.4%，即 33 700 mg/L，擬 合 方 程 為 y = 0.39 +

圖5 鞣制皮坯對(duì)發(fā)光細(xì)菌的劑量效應(yīng)曲線Fig.5 Concentration-response curve of crust leathers

3 結(jié)論

本文比較了 ZnSO4比 ZnCl2的形態(tài)分布、存放穩(wěn)定性以及毒性，結(jié)果表明硫酸鋅在 pH1～8 范圍內(nèi)形態(tài)成分單一、組成恒定，存放穩(wěn)定性好，并且毒性較小，可以作為參比物質(zhì)。采用其為參比物質(zhì)，對(duì)常用的鞣制坯革浸出液進(jìn)行了生態(tài)性評(píng)價(jià)，其毒性大小為：鉻鞣革＞甲醛鞣革＞兩性鞣劑 T 鞣革＞＞有機(jī)膦鞣革，鉻鞣劑較其他有機(jī)鞣劑更影響皮坯的生態(tài)安全性。