生物反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)禽偏肺病毒制備弱毒疫苗工藝的優(yōu)化

蔣天華，周慶豐，嚴專強，周展

1.浙江大學(xué)藥學(xué)院，浙江 杭州 310058；2.溫氏食品集團股份有限公司，廣東 云浮 527439

aMPV可在多種原代和傳代細胞內(nèi)增殖，PATNAYAK等［14］比較了aMPV疫苗毒株在BHK-21、Vero、BGM-70、MA-104、McCoy、DF-1、QT-35和 火 雞 原 代CEF中的增殖情況，發(fā)現(xiàn)這8種細胞均能很好地適應(yīng)aMPV的培養(yǎng)。本研究采用分批培養(yǎng)的方法探討懸浮BHK-21細胞在生物反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)及aMPV增殖的工藝，優(yōu)化生物反應(yīng)器內(nèi)BHK-21細胞培養(yǎng)及aMPV增殖的工藝參數(shù)，并對制備的疫苗進行動物安全性和攻毒保護試驗，以期為aMPV減毒活疫苗的研發(fā)及生產(chǎn)奠定試驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1細胞及病毒 BHK-21懸浮細胞由上海倍諳基生物科技有限公司提供；aMPV S-01（傳代致弱毒株）和BL強毒株由溫氏食品集團股份有限公司保存。

1.2實驗動物3日齡雛番鴨購自廣東省開平市某公司，檢測無APV母源抗體；40周齡產(chǎn)蛋番鴨購自溫氏集團股份有限公司種鴨場，產(chǎn)蛋正常，無異常癥狀。

1.3主要試劑及儀器 BHK細胞無血清培養(yǎng)基Tac-S101S購自上海倍諳基生物科技有限公司，使用超純水配制成細胞培養(yǎng)液，經(jīng)無菌0.22μm濾膜過濾除菌，置4℃?zhèn)溆?；BC-7L、BC-20L和BC-200L生物反應(yīng)器購自廣州齊志生物工程設(shè)備有限公司；全自動細胞計數(shù)儀JSY-SC-031購自深圳博大博聚科技有限公司。

1.4生物反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)BH K-21細胞及aM PV工藝的優(yōu)化

1.4.1初始細胞接種密度的優(yōu)化 常規(guī)復(fù)蘇BHK-21懸浮細胞，接種搖瓶內(nèi)，置振蕩培養(yǎng)箱培養(yǎng)，細胞密度達5.0×106cells/mL時，按不同初始細胞密度5.0×105、8.0×105和1.0×106cells/mL接種BC-7L生物反應(yīng)器，培養(yǎng)條件均為轉(zhuǎn)速60 r/min，溶氧飽和度50%，溫度37℃，pH 7.1。培養(yǎng)3 d，期間每12 h取樣，觀察不同初始細胞接種量下細胞的生長情況。

1.4.2病毒接種劑量的優(yōu)化 BC-7L生物反應(yīng)器內(nèi)細胞生長密度達3.0×106cells/mL后，向生物反應(yīng)器內(nèi)添加培養(yǎng)液，調(diào)整細胞密度為1.0×106cells/mL，分別按MOI=0.01、0.05和0.10接種aMPV S-01弱毒株，培養(yǎng)條件均為轉(zhuǎn)速60 r/min，溶氧飽和度50%，溫度37℃，pH 7.1。培養(yǎng)4 d，期間每12 h取樣，觀察不同病毒接種劑量下細胞的生長情況。

1.4.3病毒接種條件的優(yōu)化 通過L9（33）正交試驗確定S-01弱毒株最適接種條件，試驗因素水平見表1。BC-7L生物反應(yīng)器內(nèi)細胞生長密度達3.0×106cells/mL后，向生物反應(yīng)器內(nèi)添加培養(yǎng)液，調(diào)整細胞密度為對應(yīng)的密度條件，使用二氧化碳和碳酸氫鈉溶液調(diào)節(jié)pH為對應(yīng)條件，按表1中不同MOI接種病毒。1 h后培養(yǎng)條件設(shè)為轉(zhuǎn)速60 r/min，溶氧飽和度50%，溫度37℃，pH 7.1。培養(yǎng)4 d，期間每12 h取樣，觀察細胞狀態(tài)，并留樣檢測病毒效價。以病毒最高效價為指標，效價越高，表示病毒接種條件越優(yōu)。

白鷲習(xí)慣了天空，在這種戰(zhàn)斗下，它們是處于劣勢的。但它們?nèi)匀徊豢想x去，只護在女子的上空，不時俯沖下來，與周圍的土狼死拼。

表1 病毒接種條件的正交試驗設(shè)計Tab.1 Orthogonal test design of condition for virus inoculation

1.4.4最佳病毒接種條件的驗證及最佳收毒時間的優(yōu)化 在BC-7L生物反應(yīng)器內(nèi)采用1.4.3項得出的最佳病毒接種條件進行病毒接種驗證試驗，病毒接種后培養(yǎng)4 d，期間每12 h取樣，觀察細胞狀態(tài)，并留樣檢測病毒效價。

1.5200 L生物反應(yīng)器放大培養(yǎng) BHK-21細胞經(jīng)搖瓶和BC-7L生物反應(yīng)器放大后，按最佳初始細胞接種密度逐級導(dǎo)入BC-20L和BC-200L生物反應(yīng)器繼續(xù)放大培養(yǎng)，按1.4.4項經(jīng)BC-7L生物反應(yīng)器驗證過的最佳病毒接種條件進行200 L生物反應(yīng)器規(guī)模驗證，接種病毒后培養(yǎng)4 d，期間每12 h取樣，觀察細胞狀態(tài)，并留樣檢測病毒效價。

1.6aM PV S-01株弱毒疫苗的制備 將病毒培養(yǎng)液離心，收取上清即為弱毒疫苗，根據(jù)免疫劑量用生理鹽水稀釋備用。

1.7aM PV致弱株毒力返強試驗 將10只體型相近、性別相同的3日齡雛番鴨通過點眼滴鼻接種S-01株弱毒疫苗，105.5TCID50/羽份。接種96 h后隨機撲殺5只，觀察病理變化，留存氣管和肺臟等組織樣本供下一次傳代使用，撲殺后留存5只，繼續(xù)隔離飼養(yǎng)觀察。使用上一代組織病料研磨液再通過點眼滴鼻接種10只3日齡雛番鴨，0.2 mL/羽份，如此共進行5次回歸傳代。取第1和第5代試驗鴨氣管和肺臟組織進行病理組織學(xué)檢查，同時對組織樣品進行病毒再分離，分離的病毒樣品送華大基因測序公司測序，序列使用DNASTAR和MEGA 7.0軟件進行對比和分析［15］。

1.8動物安全性試驗 將20只體型相近的40周齡產(chǎn)蛋番鴨隨機分成2組，10只/組，A組通過點眼滴鼻、肌注和泄殖腔導(dǎo)入同時接種aMPV S-01株弱毒疫苗，105.5TCID50/羽份；B組為空白對照組。接種后3周內(nèi)每天觀察臨床癥狀，并記錄產(chǎn)蛋情況，評價疫苗的安全性。

1.9動物攻毒保護試驗 將30只體型相近、性別相同的1日齡雛番鴨隨機分為3組，10只/組，A組于1和15 d點眼滴鼻接種aMPV S-01株弱毒疫苗，105.5TCID50/羽份；B組同時點眼滴鼻接種相同劑量的細胞培養(yǎng)基溶液；C組為空白對照組。接種后28 d各組分別經(jīng)肌肉注射aMPV BL強毒株，觀察21 d，記錄疫苗保護情況。

1.10細胞計數(shù)和病毒效價測定 采用JSY-SC-031全自動細胞計數(shù)儀測定細胞密度；測定按照《中華人民共和國獸藥典》三部（2015版）附錄27方法檢測接毒后樣品效價（TCID50）。

2 結(jié)果

2.1生物反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)BH K-21細胞及aM PV工藝的優(yōu)化

2.1.1初始細胞接種密度的優(yōu)化 3種不同初始細胞密度接種BC-7L生物反應(yīng)器，初始接種密度為5.0×105cells/mL時，細胞延滯期較長，48 h后開始進入指數(shù)生長期；初始接種密度為8.0×105cells/mL時，細胞延滯期較短，12 h后開始進入指數(shù)生長期；初始接種密度為1.0×106cells/mL時，細胞快速進入指數(shù)生長期，72 h后密度可達1.6×107cells/mL。見圖1。細胞在生物反應(yīng)器內(nèi)接種或傳代時，保持密度高于1.0×106cells/mL有利于細胞快速增殖。

圖1 不同初始接種密度BHK-21細胞生長曲線的比較Fig.1 Growth curves of BHK-21 cells at different initial densities

2.1.2病毒接種劑量的優(yōu)化 3種劑量接種病毒后，細胞均能繼續(xù)生長，MOI=0.01時，細胞于接種病毒后60 h開始停止生長，密度達最高，為8.2×106cells/mL；MOI=0.05時，細胞于接種病毒后48 h開始生長減緩，其后細胞量小幅增長，84 h密度達最高，為6.1×106cells/mL；MOI=0.10時，細胞于接種病毒后48 h開始停止生長，最高密度為5.6×106cells/mL。見圖2。細胞接種病毒后24 h內(nèi)正常生長，24 h后細胞生長受到不同程度的抑制，接種病毒劑量越大，對細胞生長抑制越明顯。

圖2 接種不同劑量病毒后BHK-21細胞生長曲線的比較Fig.2 Growth curves of BHK-21 cells inoculated with aMPV at different MOIs

2.1.3病毒接種條件的優(yōu)化 L9（33）正交試驗結(jié)果見表2。極差分析表明，影響因素大小依次為病毒接種劑量＞病毒接種pH＞細胞密度，最佳病毒接種條件組合為：細胞密度3.0×106cells/mL，病毒接種劑量MOI=0.10，病毒接種pH 6.8。

表2 病毒接種條件正交試驗結(jié)果Tab.2 Orthogonal test results of condition for virus inoculation

2.1.4最佳病毒接種條件的驗證及最佳收毒時間的優(yōu)化 BC-7L生物反應(yīng)器規(guī)模最佳病毒接種條件驗證結(jié)果見圖3，72 h病毒效價最高，峰值為108.67TCID50/mL，符合預(yù)期。

圖3 7 L和200 L生物反應(yīng)器接種病毒后病毒滴度比較Fig.3 Titers of viruses cultured in 7 L and 200 L bioreactors

2.2200 L生物反應(yīng)器培養(yǎng)規(guī)模驗證 BC-200L生物反應(yīng)器規(guī)模驗證結(jié)果見圖3，84 h病毒效價最高，峰值為108.50TCID50/mL，與BC-7L生物反應(yīng)器規(guī)模結(jié)果基本一致，符合預(yù)期。2.3aM PV致弱株毒力的穩(wěn)定性 5代毒力返強試驗結(jié)果顯示，各代次病毒攻毒后，鴨只均未出現(xiàn)咳嗽、氣管啰音等臨床癥狀，剖檢發(fā)現(xiàn)雛鴨鼻腔清亮無黏液，內(nèi)臟器官正常，氣管和肺臟切片未見明顯病理變化，見圖4。序列同源性比對發(fā)現(xiàn)，第1代與第5代毒株核苷酸序列同源性為99.9%以上。核苷酸序列僅發(fā)生了11個突變，其中主要抗原基因F發(fā)生2個突變，抗原基因G發(fā)生1個突變，均為無義突變。見圖5。

圖4 顯微鏡觀察雛鴨攻毒后肺臟（A）及氣管（B）的病理變化Fig.4 Pathological change of lung（A）and trachea（B）of ducklings after virus challenge

圖5 F基因核苷酸序列推導(dǎo)的氨基酸序列比對情況Fig.5 Comparison of amino acid sequences deduced from nucleotide sequence of F gene

2.4動物安全性 2組動物觀察期內(nèi)食欲和精神狀況良好，產(chǎn)蛋正常，未表現(xiàn)出任何臨床癥狀，表明S-01株弱毒疫苗具有良好的安全性。

2.5動物攻毒保護效果 攻毒后7 d，B和C組動物出現(xiàn)典型的aMPV感染癥狀，保護率為0%；A組在整個試驗周期內(nèi)均未出現(xiàn)明顯的臨床癥狀，保護率為100%。

3 討論

aMPV自20世紀70年代末在南非被發(fā)現(xiàn)以來，已在世界大部分地區(qū)被發(fā)現(xiàn)，對家禽業(yè)造成重大經(jīng)濟損失［16-17］。疫苗接種是預(yù)防aMPV感染的有效方法，國外已有aMPV滅活疫苗和減毒活疫苗上市，但我國至今仍無上市疫苗。

機械攪拌式生物反應(yīng)器已應(yīng)用于生物制品生產(chǎn)，本實驗在7 L機械攪拌式生物反應(yīng)器中對aMPV懸浮培養(yǎng)工藝條件進行了優(yōu)化，結(jié)果表明，細胞接種密度對細胞生長影響較大，初始接種密度低于1.0×106cells/mL時，細胞會經(jīng)歷一段較長的延滯期；初始接種密度為1.0×106cells/mL時，延滯期不明顯，細胞快速進入指數(shù)期生長，72 h后密度可達1.6×107cells/mL。細胞在生物反應(yīng)器內(nèi)接種或傳代時，保持密度高于1.0×106cells/mL對于維持細胞活性狀態(tài)，提高生產(chǎn)效率具有重要意義。細胞被病毒感染后，由于病毒在細胞內(nèi)復(fù)制，細胞正常分裂生長會受到抑制并逐漸死亡。aMPV按不同劑量感染BHK-21細胞后，細胞仍能維持一段時間的對數(shù)期生長，24 h后細胞生長逐漸受到抑制，接種病毒劑量越大，對細胞生長的抑制作用越明顯。比較各組最高細胞密度，為保證細胞活性和營養(yǎng)供給，接種病毒時細胞密度不宜超過3.0×106cells/mL。贠炳嶺［18］比較了低pH對不同亞型aMPV中F蛋白融合活性的影響，發(fā)現(xiàn)低pH環(huán)境能促進aMPV/CF蛋白活性，細胞數(shù)量和病毒接種劑量是影響病毒增殖后效價的重要因素。本研究通過L9（33）正交試驗篩選出最佳病毒接種條件組合為：細胞密度3.0×106cells/mL，病毒接種劑量MOI=0.10、病毒接種pH 6.8，經(jīng)驗證，在該條件下，病毒效價最高可達108.67TCID50/mL。反應(yīng)器規(guī)模放大后，攪拌帶來的剪切力會相應(yīng)提高，隨著體積增加，均一性變差，部分區(qū)域參數(shù)超出控制范圍，經(jīng)常會出現(xiàn)細胞生長變緩、活率降低和生產(chǎn)效率下降等問題，嚴重者甚至?xí)构に嚪糯笫。?9］。本研究將7 L生物反應(yīng)器上的運行和操作參數(shù)逐級復(fù)制放大至新反應(yīng)器系統(tǒng)上，以病毒效價為指標，考察在200 L生物反應(yīng)器上運行情況，病毒效價最高可達108.50TCID50/mL，與7 L生物反應(yīng)器上結(jié)果基本一致。毒力返強試驗結(jié)果表明，S-01株弱毒疫苗對敏感雛番鴨無致病性，毒力遺傳性穩(wěn)定。動物安全性試驗結(jié)果表明，疫苗安全性良好，不會引起產(chǎn)蛋番鴨染病和嚴重不良反應(yīng)。動物攻毒保護試驗結(jié)果表明，疫苗可有效免疫雛番鴨。

綜上所述，本研究對生物反應(yīng)器內(nèi)aMPV增殖和放大工藝進行了優(yōu)化，為aMPV減毒活疫苗的研制及進一步工業(yè)化生產(chǎn)提供了參考。