液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)用于皂角的有機(jī)分析

何 蕾, 高元吉, 趙麗娟*, 余永良

(1. 四川師范大學(xué) 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院, 四川 成都 610066； 2. 成都天河農(nóng)業(yè)旅游發(fā)展有限公司, 四川 成都 611938)

皂角又稱皂莢,是豆科蘇木亞科多年生木本植物,在我國(guó)分布廣泛,具有較高的生態(tài)、經(jīng)濟(jì)價(jià)值[1],其相關(guān)產(chǎn)品在食品、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥及化工方面有較好應(yīng)用.《本草綱目》等古代醫(yī)書中均有皂角藥用價(jià)值的記載,隨著科研工作者對(duì)皂角的深入研究,其在臨床和生產(chǎn)生活中具有更廣的應(yīng)用范圍.皂莢的干燥荊棘即皂角刺,2015版《中華人民共和國(guó)藥典》記載皂角刺具有消腫托毒、排膿、殺蟲(chóng)等功效,有黃酮、多酚、三萜皂苷、甾醇、內(nèi)酯、三萜等成分,其中的黃酮類化合物,是一種天然抗氧化劑,常被用做抗癌藥物[2]；皂角米含有豐富的氨基酸、礦物質(zhì)元素、多糖類物質(zhì)等,在營(yíng)養(yǎng)保健產(chǎn)品、保鮮膜、藥物開(kāi)發(fā)等方面均具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值[3].另外,皂莢外殼及皂角胚中的氨基酸、皂苷等成分,可用于生產(chǎn)洗發(fā)液、洗衣粉、洗手液等洗漱產(chǎn)品.基于上述皂角不同部位的潛在應(yīng)用價(jià)值,其不同部位的活性成分值得深入研究,為其綜合利用開(kāi)發(fā)提供理論基礎(chǔ).

超高效液相色譜(UPLC)具有高靈敏度、高速、高效、應(yīng)用范圍廣等特點(diǎn),可以用來(lái)實(shí)現(xiàn)有機(jī)化合物的分離.質(zhì)譜(MS)具備高選擇性和準(zhǔn)確性,可實(shí)現(xiàn)化合物的定量.將液相色譜與質(zhì)譜結(jié)合的液質(zhì)聯(lián)用(LC-MS)技術(shù)可作為常規(guī)的實(shí)現(xiàn)化合物分離和定性的方法,能夠連續(xù)測(cè)得樣品中的多種組分,用于有機(jī)成分的高效分析[4-5].皂角資源豐富,而目前對(duì)其在實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用研究還較少,本研究建立液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)用于皂角4種物質(zhì)化學(xué)成分分離與鑒定的方法,以期為皂角資源的利用與開(kāi)發(fā)提供參考依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器胰酶(Promega)、乙腈(Fisher Chemical)、三氟乙酸(Sigma Aldrich)、甲酸(Fluka)、甲醇(Thermo)、乙酸銨(Thermo)、碘代乙酰胺(Sigma)、硫酸(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)、葡萄糖(Dr.Ehrenstorfer)、無(wú)水乙醇(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)、苯酚(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)、二硫蘇糖醇(Sigma)、尿素(Sigma)、丙酮(Sigma)、BCA試劑盒(碧云天)及娃哈哈純凈水(天津娃哈哈食品有限公司).

8453可見(jiàn)光光度計(jì)(Agilent)、FA1004B分析天平(上海越平科學(xué)儀器有限公司)、KQ-800DE數(shù)控超聲波清洗儀器(昆山市超聲儀器有限公司)、BR4I離心機(jī)(Thermo)、QE系列質(zhì)譜儀(Thermo)、Q ExactiveTMHF色譜儀(Thermo)、Hypesil色譜柱(Thermo)及ST12R低溫離心機(jī)(Thermo).

1.2 實(shí)驗(yàn)方法各步驟實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)化流程圖見(jiàn)圖1.

圖1 實(shí)驗(yàn)流程圖

1.2.1蛋白質(zhì)分析 從-80 ℃的冷庫(kù)中取出一定量的樣品,加入液氮研磨,再加入等體積Tris緩沖液,離心10 min,取上清液,加入5倍體積0.1 mol/L乙酸銨/甲醇沉淀,過(guò)夜,蛋白質(zhì)沉淀分別用甲醇和丙酮洗滌3次并沉淀.蛋白溶液中加二硫蘇糖醇至濃度為5 mmol/L,56 ℃還原30 min后加碘代乙酰胺至濃度為11 mmol/L,室溫避光孵育15 min.

胰酶酶解：稀釋樣品的尿素濃度至2 mol/L,以w(胰酶)∶w(蛋白)=1∶50加入胰酶和蛋白,37 ℃酶解過(guò)夜.再以w(胰酶)∶w(蛋白)=1∶100加入胰酶和蛋白,繼續(xù)酶解4 h,利用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定.脫鹽：使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.5%的三氟乙酸(TFA)將冷凍干燥樣品調(diào)節(jié)至TFA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%,離心1 min；吸20 μL樣品,離心,分別用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%TFA、體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸和體積分?jǐn)?shù)80%的乙腈溶液清洗離心,冷凍干燥30 min,用20 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%TFA、質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%乙腈溶液溶解,待檢測(cè).

儀器為Q ExactiveTMHF色譜儀(Thermo),色譜柱為Agilent 300Extend C18(5 μm,4.6 mm×250 mm).流動(dòng)相A為含體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸和體積分?jǐn)?shù)2%乙腈的水溶液,流動(dòng)相B為含體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸的乙腈.色譜條件：60 min內(nèi)流動(dòng)相B由質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%逐漸切換為35%,流速為0.3 μL/min.肽段經(jīng)由超高效液相系統(tǒng)分離后注入電噴霧離子源(ESI)中進(jìn)行電離分析.最后,將下機(jī)后的raw文件直接導(dǎo)入Proteome Discoverer 2.2軟件中進(jìn)行UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)檢索.

1.2.2有機(jī)小分子分析 取一定量經(jīng)液氮研磨的組織樣品,置于EP管中,加入500 μL含質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%甲酸和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80%的甲醇溶液,渦旋振蕩,水浴靜置5 min,離心10 min,取一定量上清液,稀釋至其甲醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為53%,離心,取上清液,待檢測(cè).

Q ExactiveTMHF色譜儀(Thermo)串聯(lián)QE系列質(zhì)譜儀(Thermo),使用Hyperil Gold Column C18色譜柱.質(zhì)譜正離子模式下流動(dòng)相A為質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%甲酸水溶液,B為甲醇溶液；質(zhì)譜負(fù)離子模式下流動(dòng)相A為5 mmol/L醋酸銨溶液,B為甲醇溶液.色譜條件采用梯度洗脫：1.5 min內(nèi)保持質(zhì)量分?jǐn)?shù)98% A,12 min內(nèi)A相質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐漸降為0%,并維持2 min,0.1 min內(nèi)切換回初始條件(質(zhì)量分?jǐn)?shù)98% A),平衡2.9 min.流速為0.2 mL/min,柱溫為40 ℃.檢測(cè)實(shí)驗(yàn)樣品,將下機(jī)數(shù)據(jù)(.raw)導(dǎo)入CD搜庫(kù)軟件,進(jìn)行保留時(shí)間、質(zhì)荷比(m/z)等參數(shù)設(shè)置.根據(jù)設(shè)置的參數(shù)進(jìn)行峰提取、峰面積定量等.通過(guò)m/z和碎片離子預(yù)測(cè)分子式并與數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì),用空白樣本去除干擾離子,并對(duì)定量結(jié)果進(jìn)行歸一化處理.

1.2.3總糖測(cè)定 規(guī)范配置質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為80%和5%的苯酚溶液、100 mg/L標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液.取適量樣品于50 mL具塞離心管,5 mL水浸潤(rùn),加20 mL無(wú)水乙醇,混合均勻,超聲提取30 min.提取結(jié)束后離心棄上清液,不溶物用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80%的無(wú)水乙醇洗滌、離心,將不溶物轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶,加入50 mL水超聲提取30 min,重復(fù)2次,冷卻至室溫,轉(zhuǎn)移至200 mL容量瓶,定容.

分別吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mL的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖工作液于具塞試管,用蒸餾水補(bǔ)至1.0 mL,加入1.0 mL苯酚溶液、5 mL硫酸,使用漩渦振蕩器混合均勻,30 ℃水浴中反應(yīng)20 min,490 nm條件下測(cè)吸光度,制定標(biāo)準(zhǔn)曲線.吸取1.0 mL樣品測(cè)定液于20 mL具塞試管中,按上述步驟操作,測(cè)定吸光度.樣品中多糖含量以質(zhì)量分?jǐn)?shù)w計(jì),單位以“g/100 g”表示,按下式計(jì)算：

其中,m1為標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得樣品測(cè)定液中含糖量(μg),V1為樣品定容體積(mL),V2為比色測(cè)定時(shí)所移樣品測(cè)定液的體積(mL),m2為樣品質(zhì)量(g),0.9為校正系數(shù).

2 結(jié)果與討論

采用Q ExactiveTMHF色譜儀(Thermo)實(shí)現(xiàn)了皂角提取物中多種蛋白質(zhì)和有機(jī)活性物質(zhì)分析,并對(duì)其中含有的總糖含量采用硫酸苯酚法做了定量分析,總離子流圖如圖2所示.

圖2 皂角提取物的液質(zhì)聯(lián)用總離子流圖

皂角米共鑒定得到包含Hypothetical chloroplast RF21、RNA聚合酶亞單元、成熟酶K、蛋白質(zhì)TIC 214、蛋白質(zhì)RceA、光敏色素A、光敏色素B等在內(nèi)的17個(gè)蛋白質(zhì),其中光敏色素A是植物中唯一能感受并響應(yīng)遠(yuǎn)紅光的光受體[6].皂角胚共鑒定得到26個(gè)蛋白質(zhì),如ATP合酶亞基8、DNA誘導(dǎo)RNA聚合酶亞基、成熟酶K、蛋白質(zhì)Ycf2等.UPLC-MS結(jié)合高分辨質(zhì)譜及數(shù)據(jù)庫(kù),實(shí)現(xiàn)了皂角米、皂角胚、皂莢外殼和皂角刺的活性成分的定性定量分析.結(jié)果表明,UPLC對(duì)不同化合物實(shí)現(xiàn)了較好的分離效果,通過(guò)對(duì)每個(gè)化合物峰面積進(jìn)行定量、整合目標(biāo)離子,結(jié)合母離子和碎片離子歸納分子式,結(jié)合mzCloud、mzVaulth和MassList等數(shù)據(jù)庫(kù),實(shí)現(xiàn)各化合物的定性分析,并對(duì)其進(jìn)行歸一化的定量分析.綜上,共鑒定出數(shù)百個(gè)有機(jī)小分子化合物,其中皂角米256個(gè)、皂角胚440個(gè)、皂莢外殼909個(gè)、皂角刺613個(gè).另外,對(duì)皂角米、皂角刺、皂莢外殼以及皂角胚的4類主要的活性成分含量進(jìn)行了對(duì)比(表1).

表 1 皂角中4類物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)比較

生物堿是廣泛存在于動(dòng)、植物體內(nèi)的一種天然活性成分,是含氮雜原子的弱堿性有機(jī)化合物,具有很好的鎮(zhèn)痛作用和抗病毒活性[7-8].皂角米中的生物堿類化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)5.814%(表1),含有較多的葫蘆巴堿(質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.817%),該2種化合物具有抗腫瘤、降血糖、降血脂[9-10]活性,具有很大的市場(chǎng)需求.此外,皂角米中含有長(zhǎng)春新堿、辣椒堿,有鎮(zhèn)痛、消炎的功效[11-12].皂角米中豐富的生物堿類化合物,擴(kuò)大了皂角米的實(shí)際應(yīng)用范圍,可用于開(kāi)發(fā)抗病毒、抗腫瘤及鎮(zhèn)痛藥物.皂角米糖類質(zhì)量分?jǐn)?shù)(5.382%)較低,是一種低糖、高蛋白、氨基酸齊全、礦質(zhì)元素豐富且符合高鉀低鈉特性的營(yíng)養(yǎng)食物[3],可制作成飲品或保健食物,適合各類人群食用.另外,皂角米中含有瓜爾豆膠,可作為持水劑和增稠劑用于飲品中,提升產(chǎn)品的穩(wěn)定性,而且瓜爾豆膠用于食品中具有一定的降低血糖、膽固醇的功效[13-14].皂角米還可用于保鮮薄膜材料、涂料、乳化劑[15-16]等領(lǐng)域.

與皂角米相比,皂角刺富含豐富的生物堿和黃酮化合物,具有天然抗氧化和清除自由基的能力[2];皂角刺的黃酮提取物既可作為食品添加劑來(lái)延緩食物的氧化質(zhì)變,也常作為抗癌藥物和抗腫瘤藥物[13];皂角刺含有的酚類、萜類、甾醇類化合物等,也具備藥理活性,如抗菌、抗炎、抗過(guò)敏、免疫調(diào)節(jié)等作用[17].作為一種傳統(tǒng)中藥,有價(jià)格低廉、來(lái)源廣、療效多樣化等優(yōu)點(diǎn),但目前針對(duì)皂角刺藥理研究較少[18],尚需進(jìn)一步研究皂角刺的化學(xué)成分及相應(yīng)的藥理作用,以擴(kuò)大皂角刺的應(yīng)用范圍.

氨基酸是由酸性羧基和堿性氨基組成的有機(jī)化合物,氨基酸衍生物則是氨基酸通過(guò)一系列反應(yīng)化合而成.氨基酸及其衍生物具有獨(dú)特的生理活性,可調(diào)節(jié)氮氧化物水平、刺激細(xì)胞開(kāi)放促使鉀外流,使毛發(fā)由休止期向生長(zhǎng)期轉(zhuǎn)化[19],促進(jìn)頭發(fā)生長(zhǎng)且對(duì)皮膚的刺激性較小.皂莢外殼和皂角胚中氨基酸及其衍生物含量較高,常按一定比例配入各種洗護(hù)產(chǎn)品中.近年來(lái),市面上也推出了很多含皂角的洗護(hù)產(chǎn)品,如皂角洗衣粉、洗衣液等.因此,可充分利用皂莢外殼中含有的有效成分,更有針對(duì)性地開(kāi)發(fā)生產(chǎn)洗發(fā)水、洗手液、潔面膏等一系列天然獨(dú)特的洗護(hù)產(chǎn)品.

3 結(jié)論

本研究采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù),分別對(duì)皂角樹(shù)的皂角米、皂角刺、皂莢外殼以及皂角胚的化學(xué)成分進(jìn)行了全面的定性定量分析,從皂角米和皂角胚中鑒定得到多種蛋白質(zhì)；檢測(cè)出數(shù)百種有機(jī)小分子化合物,并對(duì)各部位總糖含量進(jìn)行了定量分析.

綜上,皂角中富含多種可開(kāi)發(fā)利用的有效成分.在4種皂角物質(zhì)中,皂角米和皂角刺含有大量的生物堿類、黃酮類化合物,這類化合物的藥用價(jià)值很高,有很好的抗癌、抗腫瘤和消炎鎮(zhèn)痛等功效,可進(jìn)一步深究其具體藥理作用,增加其在臨床治療中的使用范圍.皂莢外殼和皂角胚含有豐富的氨基酸成分,可用于生產(chǎn)洗發(fā)水、洗衣液和潔面膏等系列洗護(hù)用品.