1株柔嫩艾美耳球蟲ITS-1部分序列測定與分析

魏冬霞，袁 橙，劉劍華，薛詠佩

（江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院 動物醫(yī)學(xué)院，泰州 225300）

雞球蟲病是由原生動物門（Protozoa）復(fù)頂亞門（Apicocomplexa）孢子蟲綱（Sporozoasida）真球蟲目（Eucoccidiorida）艾美耳亞目（Eimeriorina）艾美耳科（Eimeriidae）艾美耳屬（Eimeria）的多種球蟲寄生于雞腸道上皮細(xì)胞引起的一種對養(yǎng)雞業(yè)危害十分嚴(yán)重的原蟲病[1]。該病呈世界性分布，以雛雞多發(fā)、出血性腸炎和雛雞高死亡率為主要特征，病愈的雛雞生長發(fā)育受阻，長期不能康復(fù)，成年雞多為帶蟲者，但增重和產(chǎn)蛋都受到影響[2-3]。目前公認(rèn)的感染雞的艾美耳球蟲有7個(gè)種，分別是柔嫩（E. tenella）、毒害（E. necatrix）、布氏（E. brunetti）、巨型（E. maxima）、堆型（E.acervulina）、和緩（E. mitis）和早熟（E. praecox）艾美耳球蟲[4]。傳統(tǒng)方法是依據(jù)球蟲卵囊的特征、寄生部位、病變特征、潛隱期等進(jìn)行種類鑒定[5]，但許多蟲種在卵囊的形態(tài)、寄生部位、致病性、潛隱期等方面有許多相似之處，在混合感染的狀態(tài)下，單憑肉眼難以鑒別。核糖體第一內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（first internal transcribed spacers, ITS-1）序列存在于高度重復(fù)的核糖體中，它的進(jìn)化速度快且序列較短，適用于種間的遺傳關(guān)系分析、蟲種的鑒定及分類[6-18]。本研究根據(jù)已發(fā)表的柔嫩、堆型、布氏、巨型、和緩、毒害、早熟艾美耳球蟲的ITS-1序列引物[13-16]，對江蘇泰州地區(qū)某草雞養(yǎng)殖場發(fā)病雞糞便中分離的球蟲卵囊進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示柔嫩艾美耳球蟲的引物擴(kuò)增出陽性條帶，對陽性產(chǎn)物測序后進(jìn)行了序列的同源性分析和系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系分析，發(fā)現(xiàn)本研究中的分離株為柔嫩艾美耳球蟲。

1 材料與方法

1.1 蟲株來源 雞球蟲卵囊來自泰州姜堰某草雞養(yǎng)殖場發(fā)病雞的新鮮糞便，發(fā)病雞只情況：20日齡，有零星血便，盲腸腫大，有出血點(diǎn)和出血斑，其他腸管正常。

1.2 主要試劑 Stool DNA Kit為Omega BIO-TEK公司產(chǎn)品；2× Phanta Turbo Master Mix DNA聚合酶、核酸染料GelRed、DL2000 Plus DNA marker等購自南京諾唯贊生物科技有限公司；氯化鈉、蔗糖等試劑購自生工生物工程（上海）股份有限公司產(chǎn)品。

1.3 球蟲卵囊分離 將新鮮的雞糞便置于燒杯中，加入20倍糞便重量的飽和糖鹽水，攪拌后用60目的金屬篩過濾，濾液收集于離心管后3000 ×g離心10 min；隨后將離心管置于試管架上，用直徑是1 cm的金屬圈蘸取液面后，抖落于裝有蒸餾水的燒杯中，反復(fù)蘸取多次，直到隨機(jī)蘸取液面檢測，僅檢測到少量的卵囊為止。將含有卵囊的蒸餾水3000 ×g離心10 min，棄去上清液，再在沉淀物中加入蒸餾水混勻后，離心并棄去上清液，反復(fù)洗滌3次，最后取沉淀物收集于2.5%重鉻酸鉀溶液中備用。

1.4 球蟲卵囊的孢子化 將保存于2.5%重鉻酸鉀溶液中的卵囊放入培養(yǎng)皿，攪拌后置于26℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中每天需攪動培養(yǎng)液數(shù)次，使球蟲卵囊在孢子化過程中有足夠的氧氣，同時(shí)，每天對卵囊的孢子化程度進(jìn)行觀察，并隨機(jī)取50個(gè)卵囊測量大小。

1.5 卵囊DNA的提取 按照Omega Stool DNA Kit說明書的操作步驟提取純化后球蟲卵囊的DNA，抽提的DNA保存于-35℃?zhèn)溆谩?/p>

1.6 PCR的擴(kuò)增和測序 根據(jù)Jenkin等[13]發(fā)表的柔嫩（E. tenella）、毒害（E. necatrix）、布氏（E.brunetti）、巨型（E. maxima）、堆型（E. acervulina）、和緩（E. mitis）和早熟（E. praecox）艾美耳球蟲ITS-1的引物序列[13-16]，由生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行引物合成（表1）。用合成的引物對提取的DNA模板進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為：2× Phanta Turbo Master Mix 10 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL，DNA模板（50～100 ng/μL）2 μL，補(bǔ)加7 μL ddH2O，總體積為20 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3 min；94℃變性45 s，各引物退火溫度見表1，退火30 s，72℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)后；72℃延伸10 min。然后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物并記錄結(jié)果。并將鑒定為陽性的PCR產(chǎn)物送測序公司測序。

表1 雞艾美耳球蟲的ITS-1特異性引物的DNA序列、退火溫度和擴(kuò)增產(chǎn)物的預(yù)測大小Table 1 DNA sequence, annealing temperatures of ITS-1 primers and predicted size of amplification products derived from ITS-1 PCR amplification of Eimeria spp. DNA

1.7 ITS-1序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建 PCR產(chǎn)物測序結(jié)果在GenBank上進(jìn)行BLAST搜索，下載同源性較高的球蟲的相關(guān)序列（表2），并用DNAStar軟件進(jìn)行同源性分析，同時(shí)用MEGA5.05軟件進(jìn)行進(jìn)化分析。應(yīng)用MEGA5.05（分子進(jìn)化遺傳分析）中的Kimura雙參數(shù)模型計(jì)算不同雞球蟲蟲種間的遺傳距離，再應(yīng)用MEGA5.05中的鄰接法（neighbor-joining method），即NJ法構(gòu)建不同蟲種間ITS-1序列的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，同時(shí)通過自舉分析（bootstrap）作置信度檢測，bootstrap為1000次，大于50%以上認(rèn)為支持。

表2 用于比對的艾美耳球蟲ITS-1基因序列信息（下載于GenBank）Table 2 Sequence information of the ITS-1 gene of Eimeria spp. in this study (downloaded from GenBank)

2 結(jié)果與討論

2.1 卵囊的形態(tài)構(gòu)造 分離到的球蟲卵囊多為寬卵圓形，少數(shù)為橢圓形；卵囊壁為淡綠黃色，原生質(zhì)呈淡褐色；大小為20.5～26 μm×16.5～22.5 μm。經(jīng)28 h孢子化后，卵囊內(nèi)有富有折光性的極粒、一個(gè)顆粒狀團(tuán)塊的卵囊殘?bào)w和4個(gè)孢子囊。每個(gè)孢子囊內(nèi)含有2個(gè)呈香蕉樣子孢子（圖1）。一般認(rèn)為有7種球蟲可以感染雞，從形態(tài)、結(jié)構(gòu)和孢子化時(shí)間來看，本次分離的球蟲卵囊和柔嫩艾美耳球蟲特征相符，但由于幾種雞球蟲在形態(tài)結(jié)構(gòu)上存在較大的相似性，很難通過卵囊特征來鑒定蟲種，因此，不能排除是其他球蟲卵囊的可能性，而且，在雞場中幾種球蟲混合感染的現(xiàn)象在生產(chǎn)中較為常見，因此需要對此次分離的球蟲卵囊開展進(jìn)一步的鑒定。如果能快速鑒定，可以幫助獸醫(yī)或者養(yǎng)殖戶擬定球蟲病防治方案，選擇合適的抗球蟲藥物和疫苗防治該病。

圖1 孢子化球蟲卵囊（1000×）Fig.1 Sporozoited oocysts of Eimeria spp. (1000×)

2.2 PCR擴(kuò)增結(jié)果 將獲得的DNA模板分別用合成的7種球蟲的ITS-1引物擴(kuò)增，結(jié)果用柔嫩艾美耳球蟲ITS-1引物成功擴(kuò)增出約270 bp的條帶，其他6種球蟲的引物未擴(kuò)增出條帶。經(jīng)測序證實(shí)該陽性條帶大小為279 bp，與Schnitzler等[14]預(yù)期的長度278 bp基本一致（預(yù)計(jì)大?。?，見圖2。將獲得的序列輸入GenBank上進(jìn)行Blastn，發(fā)現(xiàn)本次擴(kuò)增出的序列與夏延富等[6]上傳的柔嫩艾美耳球蟲（上海株）的ITS-1序列（GenBank登錄號：GQ153633）其中一段的一致性達(dá)100%（279/279）。

圖2 擴(kuò)增結(jié)果電泳圖Fig.2 Electrophoretogram of amplification results

2.3 艾美耳球蟲ITS-1基因的同源性分析結(jié)果 對本研究的分離株E. tenella isolate TZ測序后得到279 bp的ITS-1序列。用DNAStar軟件的CLUSTAL W功能，將該序列與GenBank上一致性較高的序列進(jìn)行同源性分析，分析結(jié)果見圖3。從圖中可知本研究所獲得的序列與已發(fā)表的其他地方柔嫩艾美耳球蟲的ITS-1序列一致性達(dá)99.6%～100%，其中與安徽株（JX477100）、上海株（GQ153633）的相似度達(dá)100%，具有較高的同源性。與其他柔嫩艾美耳球蟲的一致性均為99.6%。李巍等[8]基于ITS-1序列建立了雞艾美耳球蟲套式PCR鑒別檢測方法，測序結(jié)果和序列比對分析顯示不同柔嫩艾美耳球蟲蟲株的ITS-1序列一致性為98.5%。Li等[17]對來自中國湖北省8個(gè)地區(qū)的21株柔嫩艾美耳球蟲ITS-1序列進(jìn)行擴(kuò)增和分析，顯示其同源性為92.5%～100%。本序列與其他柔嫩艾美耳球蟲的序列一致性分析結(jié)果（99.6%～100%）略高于李巍等[8]研究結(jié)果（98.5%）和Li等[17]研究結(jié)果（92.5%～100%），這可能是由于本研究中所選取的比對序列為在GenBank上Blastn一致性較高的序列，而與他們所選擇的比對序列不同所致。

圖3 分離株TZ和柔嫩艾美耳球蟲相似度分析結(jié)果Fig.3 Similarity analysis results of isolates TZ and E. tenella

2.4 ITS-1序列系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建 應(yīng)用MEGA5.05（分子進(jìn)化遺傳分析）中的Kimura-雙參數(shù)模型計(jì)算球蟲間的遺傳距離，再應(yīng)用MEGA5.05中的NJ法構(gòu)建感染雞的7種常見球蟲蟲種間ITS-1序列的進(jìn)化關(guān)系，同時(shí)通過自舉分析（bootstrap）作置信度檢測，bootstrap為1000次，大于50%以上認(rèn)為支持，以雞蛔蟲為外源基因構(gòu)建進(jìn)化樹（見圖4）。本研究所分離的球蟲蟲株與幾株柔嫩艾美耳球蟲的ITS-1區(qū)的親緣關(guān)系較近，可信度為94%。除了巨型艾美耳球蟲外，其他6種球蟲位于一個(gè)大的分支上，柔嫩艾美耳球蟲和毒害艾美耳球蟲形成一個(gè)小分支，親緣關(guān)系較近。此分析結(jié)果與夏延富等構(gòu)建的6種雞艾美耳球蟲（不含布氏艾美耳球蟲）的ITS-1系統(tǒng)發(fā)育樹分析結(jié)果一致，即柔嫩艾美耳球蟲與毒害艾美耳球蟲位于同一個(gè)小分支，遺傳進(jìn)化關(guān)系較近[6]。在系統(tǒng)發(fā)育樹中和緩、堆型和早熟艾美耳球蟲形成另一個(gè)小分支。

圖4 基于ITS-1基因序列的NJ法所構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹（NJ法）Fig.4 Phylogenetic tree of Eimeria spp. isolate TZ based on partial sequences of ITS-1 gene by NJ method

本研究根據(jù)已報(bào)道的7種球蟲的ITS-1基因擴(kuò)增引物序列合成引物，并對反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，對分離的球蟲卵囊進(jìn)行了PCR鑒定，用一對擴(kuò)增柔嫩艾美耳球蟲序列的特異性引物擴(kuò)增獲得目的條帶。測序后，經(jīng)同源性分析和系統(tǒng)發(fā)育樹分析發(fā)現(xiàn)該蟲株與柔嫩艾美耳球蟲安徽株和上海株的親緣關(guān)系最近，結(jié)合雞只發(fā)病日齡（20日齡）、臨床表現(xiàn)（有血便）、病理變化（盲腸腫大、出血）、孢子化時(shí)間（28 h）以及卵囊的特征等分析該草雞養(yǎng)殖場雞只此次感染的主要致病球蟲蟲種為柔嫩艾美耳球蟲。