丹酚酸A抑制血小板及中性粒細(xì)胞活化作用

楊文杰，王洪穎，馬璐璐，方樂玉，李春曉，張璐莎，張麗媛，王倩怡，孫 偉，冷雨澤，薛岳進(jìn)，李夢(mèng)瑤，陳 璐，王 虹

(1. 天津中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院, 天津 301617；2. 中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)天津康復(fù)療養(yǎng)中心, 天津 300141；3.天津中醫(yī)藥大學(xué)組分中藥國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 天津 301617)

心血管疾病是由高脂血癥、動(dòng)脈粥樣硬化等所導(dǎo)致，涉及心臟、動(dòng)脈、毛細(xì)血管和靜脈的血液循環(huán)系統(tǒng)疾病，根據(jù)中國(guó)心血管危險(xiǎn)因素研究顯示[1]，我國(guó)心血管疾病患病率和死亡率仍處于快速增長(zhǎng)階段，心血管病死亡率在居民死亡構(gòu)成中居首位。心肌損傷后，血小板功能改變，中性粒細(xì)胞活化，內(nèi)皮黏附分子上調(diào)，活化的血小板和中性粒細(xì)胞黏附到內(nèi)皮表面，在梗死區(qū)形成中性粒細(xì)胞-血小板聚集體[2]，使梗死面積進(jìn)一步擴(kuò)大，因此，抑制血小板和中性粒細(xì)胞活化是預(yù)防和治療心血管疾病的重要環(huán)節(jié)。目前臨床上常用的治療藥物作用靶點(diǎn)單一，選擇性低，在發(fā)揮抗血小板或抗炎作用的同時(shí)常伴有嚴(yán)重出血、胃腸道潰瘍等風(fēng)險(xiǎn)，發(fā)現(xiàn)并深入研究安全有效的抗血小板和抗炎藥物尤為重要，同時(shí)尋求新的靶點(diǎn)成為關(guān)注方向。

丹參為活血化瘀藥，廣泛應(yīng)用于缺血性心血管疾病的治療，丹酚酸A(salvianolic acid A，SAA)是丹參水溶性成分中含量豐富的物質(zhì)之一，也是最強(qiáng)的抗氧化酚酸之一[3]，對(duì)血栓、炎癥、癌癥等有治療作用[4]。但是SAA是否通過影響血小板及中性粒細(xì)胞活化來(lái)抑制心肌缺血疾病還有待進(jìn)一步研究。本研究通過測(cè)定SAA對(duì)體內(nèi)外血小板和中性粒的活化來(lái)探討SAA治療心血管疾病的作用及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物SPF 級(jí)健康 C57BL/6 45小鼠，♀♂各半，6～8周齡，體質(zhì)量 (20±2) g，均購(gòu)自北京斯貝福生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0003，飼養(yǎng)與SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。所有實(shí)驗(yàn)均經(jīng)天津中醫(yī)藥大學(xué)臨床藥理研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)中涉及的方法均根據(jù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)相關(guān)指南和法規(guī)進(jìn)行。

1.2 藥品與試劑替羅非班(tirfiban，批號(hào)WKQ-17915)購(gòu)自四川省維克奇生物科技有限公司；丹酚酸A(salvianolic acid A， SAA，批號(hào)DST180201-008)購(gòu)自成都德思特生物技術(shù)有限公司；二磷酸腺苷二鈉鹽(adenosine-5′-diphosphate disodium salt， ADP，批號(hào)SLBN0134V)購(gòu)自Sigma公司；CD45 antibody(貨號(hào)：Ab10558)購(gòu)自abcam公司；CD42c antibody(貨號(hào)：YT6028)購(gòu)自Immunoway公司；APC anti-mouse/rat CD62p antibody(貨號(hào)：148303)購(gòu)自Biolegend公司；PVDF膜(貨號(hào)：HVHP01300)購(gòu)自密理博有限公司；BCA 試劑盒(貨號(hào)：PC0020)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 儀器小動(dòng)物呼吸機(jī)(Harvard Inspira公司，美國(guó))，體視顯微鏡(Leica公司，德國(guó))，高分辨率超聲儀(Visual Sonics公司，加拿大)，流式細(xì)胞儀(BD 公司，美國(guó))，F(xiàn)lex Station 3酶標(biāo)儀(Molecular Device 公司，美國(guó))，倒置熒光顯微鏡(Nikon公司，日本)

1.4 小鼠MI模型的建立建立小鼠MI模型，小鼠麻醉、固定、氣管插管呼吸機(jī)正壓通氣，潮氣量為1 mL，將呼吸頻率調(diào)至100次·min-1，呼吸比2∶1。開胸暴露心臟，以眼科縫線沿左心耳下緣2 mm穿過冠狀動(dòng)脈左前降支(left anterior descending coronary artery，LAD)，結(jié)扎引起LAD閉塞，Sham組僅穿縫線但不結(jié)扎。建模成功后，逐層縫合胸腔并排出胸腔內(nèi)氣體。小鼠清醒后隨后常規(guī)飼養(yǎng)。

1.5 分組及給藥隨機(jī)將C57BL/6小鼠分為如下組(每組9只)：正常對(duì)照組(生理鹽水)、MI模型組、SAA低劑量組(5 mg·kg-1)、SAA高劑量組(10 mg·kg-1)、Tirofiban組(0.87 mg·kg-1)。適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后進(jìn)行MI模型的建立及術(shù)后尾靜脈注射給藥，MI+SAA 組給予SAA尾靜脈注射(5 mg·kg-1或10 mg·kg-1，每天1次)，MI+Tirofiban組給予Tirofiban尾靜脈注射(0.87 mg·kg-1)，連續(xù)3 d；MI組以同等量的溶媒(生理鹽水)注射。正常對(duì)照(sham)組尾靜脈灌注等量溶媒(生理鹽水)，連續(xù)3 d。

1.6 心功能評(píng)價(jià)持續(xù)吸入異氟烷麻醉小鼠，仰臥固定至37 ℃恒溫板。小鼠四肢與電極相連監(jiān)測(cè)心率。胸部脫毛并涂抹超聲波耦合劑，分別在短軸和在四腔面檢測(cè)小鼠心臟的舒縮和血流變化。選取連續(xù)5個(gè)心動(dòng)周期測(cè)量計(jì)算左室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction，LVEF)、左室短軸縮短率(fractional shortening，F(xiàn)S)、收縮末期左室前壁厚度(systolic left ventricular anterior wall，LVAWs)、舒張期左室前壁厚度(diastolic left ventricular anterior wall，LVAWd) 、收縮末期左室后壁厚度(systolic left ventricular posterior wall，LVPWs) 、舒張期左室后壁厚度(diastolic left ventricular posterior wall，LVP-Wd)、左室舒張?jiān)缙谧畲笱?二尖瓣心房收縮期最大血流(ratio of E /A)，數(shù)據(jù)取平均值。

1.7 心肌組織HE染色將處死后小鼠的心臟剪取左心室，含室間隔部分，用10%的甲醛浸泡固定，沿左室長(zhǎng)軸的中點(diǎn)行組織切片，其厚度保持在4 μm左右。用去離子水清洗切片組織后，蘇木精染色3～5 min，再次用去離子水清洗后，置入含1% HCl的無(wú)水乙醇中固定，之后再用伊紅染色1～4 min，去離子水清洗干凈，無(wú)水乙醇固定后石蠟包埋，置入普通顯微鏡的40×物鏡鏡頭下觀察。

1.8 免疫組化檢測(cè)小鼠心臟中CD42c、CD45、Ly6G以及C3aR的表達(dá)小鼠心臟組織石蠟切片，脫蠟水化，封閉，加抗原修復(fù)液進(jìn)行冷修復(fù)，一抗，即CD42c、CD45、Ly6G、C3aR(1 ∶100)抗體，4 ℃孵育過夜，次日室溫放置30 min后，先滴加反應(yīng)增強(qiáng)液室溫反應(yīng)10 min，后滴加二抗，室溫反應(yīng)20 min，DAB顯色5～8 min，蘇木精復(fù)染20 s，脫水，封片顯微鏡觀察CD42c、CD45、Ly6G、C3aR的表達(dá)情況。

1.9 ELISA檢測(cè)血小板中中性粒細(xì)胞NE、MPO、MMP9、LF的釋放根據(jù)ELISA 說(shuō)明書進(jìn)行，在NE、MPO、MMP9、LF 細(xì)胞因子檢測(cè)板中加入樣本或?qū)?yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書操作，加檢測(cè)抗體孵育，洗板，加酶孵育，洗板，加入顯色劑顯色反應(yīng)15 min后，加終止液使反應(yīng)終止，立即在酶標(biāo)儀設(shè)置參考波長(zhǎng)610～630 nm，檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm測(cè)出各孔吸光度值，用ELISACALC軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算出中性粒細(xì)胞NE、MPO、MMP9、LF 細(xì)胞因子的水平。

1.10 Western blot法檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)取分離后的血小板懸液，分別加入生理鹽水、Tirofiban以及不同濃度的SAA于37 ℃，孵育20 min，將空白對(duì)照組，Tirofiban、SAA組分別加入20 μmol·L-1ADP于37 ℃，孵育10 min，3 000 r·min-1離心10 min，去除上清，沉淀按照組織裂解液 ∶PMSF ∶磷酸酶抑制=100 ∶1 ∶1比例加入配置好的裂解液，冰上裂解 1 h。4 ℃，15 000 r·min-1離心 20 min，收集上清，BCA 蛋白定量。電泳，用PVDF膜進(jìn)行轉(zhuǎn)膜；TPBS配置脫脂牛奶(5%)在37 ℃溫箱中孵育2 h；洗膜，孵育一抗，即兔抗PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、VSAP、p-VASP(1 ∶1 000)抗體，4 ℃結(jié)合12 h以上；洗膜；37 ℃孵育二抗2 h；洗膜顯影。

1.11 免疫熒光法檢測(cè)炎性趨化因子CXCL1、CXCL2的釋放將處死后小鼠的心臟剪取左心室，含室間隔部分，切片脫蠟后微波處理15 min，PBS沖洗3次×3 min后兔血清封閉切片，加入一抗CXCL1(1 ∶50)或CXCL2(1 ∶50)抗體，4 ℃ 孵育過夜。次日取出，PBST沖洗3次×3 min，和Cy3標(biāo)記的熒光二抗共孵育1 h，滴加 DAPI 復(fù)染，封片。Nikon倒置熒光顯微鏡的40×物鏡鏡頭下觀察，PS軟件分析計(jì)算紅綠藍(lán)熒光比值。

1.12 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)血小板CD62p的熒光強(qiáng)度分別于小鼠MI術(shù)前、術(shù)后3 d，采集經(jīng)肝素鈉抗凝的外周血，提取分離血小板，各組分別加入生理鹽水、Tirofiban、SAA不同濃度于37 ℃，孵育20 min，將空白對(duì)照組加生理鹽水，將陽(yáng)性藥和丹酚酸A組加入20 μmol·L-1ADP于37 ℃，孵育10 min，每管加入CD62p-APC 各1 μL，再加入10 μL處理過的血小板懸液及89 μL臺(tái)式緩沖液，4 ℃避光孵育30 min，加入500 μL 1% 多聚甲醛，充分混勻，于1 h內(nèi)上機(jī)檢測(cè)，用FACS流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD62p表達(dá)的細(xì)胞數(shù)，每份標(biāo)本檢測(cè)10萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，以表達(dá)CD62p細(xì)胞占總細(xì)胞的比例表示外周血中血小板活化的數(shù)量，用 Cell Quest 軟件分析并記錄外周血中血小板活化的比例。

2 結(jié)果

2.1 SAA對(duì)MI小鼠心功能的影響如Tab 1超聲結(jié)果所示，與Sham相比，MI模型組(Saline)LVEF、LVFS明顯降低(P<0.05)，表明心肌梗死模型造模成功。與MI模型組(Saline)比，Tirofiban組和SAA高劑量組能夠提高左心室的舒張收縮功能，射血分?jǐn)?shù)、短軸縮短率均明顯高于模型組(P<0.05)，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明SAA能夠改善MI小鼠的心功能。

2.2 SAA對(duì)MI小鼠心臟組織形態(tài)變化的影響Fig 1的HE染色中Sham組小鼠的心肌組織和細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整清晰；Saline組小鼠心肌組織以肉芽和瘢痕組織為主，心肌組織染色較淺，呈疏松化。和Saline組相比，SAA組心肌組織和細(xì)胞結(jié)構(gòu)較為完整，形態(tài)學(xué)清晰；Tirfiban組小鼠心肌組織形態(tài)和Sham組相似。表明SAA能夠明顯減輕MI誘導(dǎo)的小鼠心肌損傷。

2.3 SAA對(duì)MI小鼠血小板募集及血小板活化的影響Fig 2A-B用IHC染色檢測(cè)心肌組織中CD42c的表達(dá)，應(yīng)用FCM檢測(cè)小鼠血液中CD62p的表達(dá)；IHC 染色陽(yáng)性表達(dá)的蛋白呈棕黃色，結(jié)果表明Sham 組小鼠心肌組織中CD42c以及小鼠血液中CD62p均有一定量的表達(dá)；Saline組小鼠心肌組織中CD42c以及小鼠血液中CD62p表達(dá)較Sham組明顯增加(P<0. 01)；SAA組及Tirfiban組小鼠心肌組織中CD42c以及小鼠血液中CD62p表達(dá)均較Saline組明顯降低(P<0.05,P<0.01)；提示SAA可以減少M(fèi)I小鼠心臟組織中血小板的募集，抑制MI小鼠的血小板活化。通過Fig 2C結(jié)果可知，SAA對(duì)小鼠尾出血時(shí)間沒有明顯的影響。以上結(jié)果提示，SAA能夠抑制MI誘導(dǎo)的血小板募集及血小板活化，同時(shí)不影響小鼠的出血時(shí)間。

Fig 1 Effects of SAA on histomorphology of mice with myocardial infarction

Fig 2 Effects of Salvianolic acid A on platelet recruitment, activation and tail bleeding time in infarcted area of mice with myocardial infarction

2.4 SAA對(duì)ADP誘導(dǎo)血小板PI3K、Akt、VASP表達(dá)的影響Fig 3采用Western blot染色檢測(cè)小鼠血液中p-VASP/VASP、p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT蛋白的表達(dá)變化，Sham組小鼠血液中p-VASP/VASP、p-PI3K/PI3K 和p-AKT/AKT均有一定量的表達(dá)；ADP組小鼠血液中p-PI3K/PI3K較Sham組明顯升高(P<0.01)，p-AKT/AKT較Sham組明顯升高(P<0.05)，p-VASP/VASP較Sham組明顯降低(P<0.05) ; SAA 組小鼠血液中p-PI3K較ADP組明顯降低(P<0.05,P<0.01)，p-AKT表達(dá)較ADP組明顯降低(P<0.05，P<0.01)，p-VASP/VASP較ADP 組明顯升高(P<0.01)。結(jié)果顯示，SAA可以上調(diào)ADP誘導(dǎo)的血小板中p-VASP的表達(dá)，下調(diào)p-PI3K和p-Akt的表達(dá)，表明SAA可通過調(diào)節(jié)PI3K、AKT、VSAP蛋白磷酸化發(fā)揮抗血小板作用。

Fig 3 Effect of Salvianolic acid A on platelet activation induced by ADP

2.5 SAA對(duì)MI小鼠梗死區(qū)白細(xì)胞及中性粒細(xì)胞的影響Fig 4A-B用IHC染色檢測(cè)心肌組織中CD45以及Ly6G的表達(dá)，F(xiàn)ig 4C用IF染色檢測(cè)心肌組織中CXCL1、CXCL2的表達(dá)，IHC染色陽(yáng)性表達(dá)的蛋白呈棕黃色，IF染色陽(yáng)性表達(dá)的蛋白分別呈紅色和綠色熒光，結(jié)果表明Sham組小鼠心肌組織中CD45、Ly6G、CXCL1及CXCL2均有一定量的表達(dá)；Saline組小鼠心肌組織中CD45、Ly6G、CXCL1及CXCL2表達(dá)較Sham組明顯增加(P<0.01)；SAA組及Tirfiban組小鼠心肌組織中CD45、Ly6G、CXCL1及CXCL2表達(dá)均較Saline組明顯降低(P<0.05,P<0.01)；提示SAA可以使MI小鼠梗死區(qū)的白細(xì)胞以及中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)降低，降低炎性趨化因子的表達(dá)。表明SAA能夠明顯抑制MI誘導(dǎo)的白細(xì)胞及中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)。

Fig 4 Effect of Salvianolic acid A on leukocyte and neutrophil infiltration in mice with myocardial infarction

2.6 SAA對(duì)C3aR的表達(dá)及C3a誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞活化的影響有研究表明，在心梗患者和實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?，心肌組織和外周血中補(bǔ)體的激活與心梗嚴(yán)重程度密切相關(guān)[5]，其中補(bǔ)體成分過敏毒素C3a及其受體C3aR已經(jīng)成為心肌缺血后炎癥損傷的重要介質(zhì)[6]。補(bǔ)體成分C3是補(bǔ)體級(jí)聯(lián)的中心成分，其活化產(chǎn)物C3a可以通過與中性粒細(xì)胞表面的C3a受體(complement C3a receptor，C3aR)結(jié)合，導(dǎo)致中性粒細(xì)胞活化進(jìn)而促進(jìn)局部炎癥，加重心肌損傷[7]。心肌梗死病理狀態(tài)下，C3a/C3aR途徑易激活中性粒細(xì)胞，使其活化。Fig 5A用IHC染色檢測(cè)心肌組織中C3aR的表達(dá)，IHC染色陽(yáng)性表達(dá)的蛋白呈棕黃色，結(jié)果表明Saline組小鼠心肌組織中C3aR表達(dá)較 Sham組明顯增加(P<0.01)；SAA組及Tirfiban組小鼠心肌組織中C3aR表達(dá)均較Saline組明顯降低(P<0.05)，結(jié)果提示SAA可以抑制MI小鼠心肌組織中C3aR的表達(dá)，從而降低中性粒細(xì)胞的活化。Fig 5B-E用ELISA檢測(cè)小鼠血液中中性粒細(xì)胞活化標(biāo)志物NE、MPO、MMP9、LF 的釋放，C3a模型組與對(duì)照組相比NE、MPO、MMP9、LF蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05,P<0.01)，SAA組與C3a模型組相比，NE、MPO、MMP9、LF表達(dá)明顯降低(P<0.05,P<0.01)，結(jié)果提示SAA可以抑制C3a及C3a誘導(dǎo)的小鼠血液中中性粒細(xì)胞活化。表明SAA可能是通過抑制C3aR及C3a的表達(dá)發(fā)揮抗中性粒細(xì)胞活化作用。

Fig 5 Effects of Salvianolic acid A on neutral particle activation

3 討論

MI等缺血性疾病嚴(yán)重威脅人類健康，近年來(lái)發(fā)病趨勢(shì)呈直線上升，是當(dāng)今全球最主要的死亡原因之一[8]。在缺血性心血管疾病中，血液呈高凝狀態(tài)，并伴隨動(dòng)脈及微動(dòng)脈血栓，激活的炎癥性因子促進(jìn)內(nèi)皮通透性，介導(dǎo)血小板活化，同時(shí)引起免疫系統(tǒng)發(fā)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)，形成并擴(kuò)展動(dòng)脈粥樣硬化斑塊，加速動(dòng)脈血栓形成[9]。中醫(yī)學(xué)理論將缺血性心血管疾病歸因于氣滯血瘀所致氣血流通受阻。傳統(tǒng)活血化瘀藥有疏通氣血，促進(jìn)缺血組織修復(fù)的作用，廣泛應(yīng)用于血瘀證的治療。丹參具有活血化瘀、除煩益氣之功。SAA是丹參重要的水溶性酚酸類化合物，研究表明其具有抗血栓[10]、抗炎[11]等作用，但其作用機(jī)制尚未清晰闡明。所以，我們探討SAA是否通過影響血小板及中性粒細(xì)胞活化來(lái)改善心肌缺血疾病。

MI導(dǎo)致最初的病變區(qū)，其特征是局部產(chǎn)生細(xì)胞因子介導(dǎo)的強(qiáng)烈炎癥反應(yīng)。急性MI時(shí)，適度的炎癥反應(yīng)是心肌愈合和修復(fù)過程中必不可少的，但過度的炎癥反應(yīng)會(huì)加重心肌損傷，導(dǎo)致MI[12]。中性粒細(xì)胞為MI早期主要的炎性細(xì)胞，主要來(lái)源于骨髓中的造血干細(xì)胞，可刺激趨化因子和炎性介質(zhì)的釋放，促進(jìn)巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞向缺血區(qū)募集。替羅非班在研究和應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)具有抑制血小板活化和炎癥反應(yīng)的雙重作用。SAA能夠改善MI小鼠心臟的心功能及心臟組織形態(tài)。同時(shí)SAA可以抑制缺血組織中血小板的募集、抑制外周血中血小板的活化，炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)以及炎性趨化因子CXCL1、CXCL2的釋放，從而使缺血后血栓炎癥明顯減輕，促進(jìn)缺血區(qū)的組織恢復(fù)，改善心功能。

血小板是血栓形成的主要介質(zhì)，對(duì)于組織損傷修復(fù)至關(guān)重要，并且在血管炎癥條件下發(fā)揮作用。止血失衡會(huì)導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成，導(dǎo)致血栓和局部組織缺血。在正常的機(jī)體中，血小板活化處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，在心肌缺血情況下，激活的血小板可以調(diào)節(jié)不同的細(xì)胞因子和趨化因子的釋放，促進(jìn)組織損傷修復(fù)[13]。CD62p從可溶性α致密顆粒中釋放，暴露血小板表面，通過白細(xì)胞分泌的P選擇素糖蛋白配體-1(P selectin glycoprotein ligand 1，PSGL1)與中性粒細(xì)胞結(jié)合[14]啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)，介導(dǎo)整合素活化，加劇細(xì)胞間的黏連，進(jìn)而形成血栓。此外，活化的血小板還可以釋放血栓素A2(thromboxane A2，TXA2)及5-羥色胺等細(xì)胞因子，可以通過刺激血管使其收縮并加重血管痙攣，進(jìn)而誘發(fā)血栓形成，流式結(jié)果顯示，SAA下調(diào)CD62p表達(dá)量；提示SAA抑制血小板的活化。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，體內(nèi)的信號(hào)通路如PI3K/Akt、VASP與血小板活化相關(guān)，從血小板活化信號(hào)通路中研究藥物抗血小板作用成為研究重點(diǎn)。已有研究表明，SAA通過PI3K/Akt通路抑制血小板活化[15]，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)此進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果顯示SAA通過PI3K/Akt通路發(fā)揮抗血小板作用。VASP為血管擴(kuò)張刺激磷酸蛋白，位于血小板細(xì)胞內(nèi)，通過ADP受體P2Y12信號(hào)通路使其磷酸化，受環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，AMP)途徑調(diào)控，VASP磷酸化水平與血小板活化呈負(fù)相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明丹酚酸A可以上調(diào)VASP磷酸化，提示SAA可以通過促進(jìn)VASP的磷酸化抑制血小板的激活。

中性粒細(xì)胞是由骨髓中的造血干細(xì)胞產(chǎn)生，干細(xì)胞增殖并分化為裝備有大量顆粒蛋白的成熟中性粒細(xì)胞。這些顆粒蛋白使中性粒細(xì)胞能夠?qū)ξ⑸锂a(chǎn)生致命的打擊，但也會(huì)造成巨大的組織損傷。中性粒細(xì)胞作為休眠細(xì)胞在血液中循環(huán)。在感染部位，內(nèi)皮細(xì)胞繞過中性粒細(xì)胞并引導(dǎo)它們通過內(nèi)皮細(xì)胞間隙，由此中性粒細(xì)胞被激活和調(diào)節(jié)，以便隨后與微生物相互作用。一旦進(jìn)入組織，中性粒細(xì)胞就會(huì)通過從顆粒中釋放出來(lái)的殺菌物質(zhì)或代謝活化產(chǎn)生的殺菌物質(zhì)來(lái)殺死微生物。最后，中性粒細(xì)胞可以排出附著有殺菌蛋白的DNA，作為微生物的細(xì)胞外陷阱[16]。

中性粒細(xì)胞損傷周圍組織的傾向與其激活狀態(tài)密切相關(guān)，中性粒細(xì)胞一旦被激活，就會(huì)釋放吞噬體或分泌抗菌和炎癥蛋白，這些蛋白位于細(xì)胞質(zhì)顆粒中，這一過程被稱為脫顆粒反應(yīng)。脫顆粒反應(yīng)增強(qiáng)和呼吸爆發(fā)是造成重大損害的先決條件。中性粒細(xì)胞有4種不同類型的細(xì)胞顆粒，儲(chǔ)存不同的蛋白分子。初級(jí)顆粒主要儲(chǔ)存NE、MPO等，次級(jí)顆粒主要包含LF和MMP9，三級(jí)顆粒富含明膠酶，囊泡主要存儲(chǔ)磷酸酶和血漿蛋白等[17]。缺氧顯著上調(diào)了中性粒細(xì)胞主要顆粒的釋放，在一定程度上促進(jìn)了內(nèi)皮細(xì)胞損傷。脫顆粒反應(yīng)衍生的蛋白質(zhì)是中性細(xì)胞抗微生物以及NET釋放過程所必須的。其中NE和MPO 是 NET 形成的必要條件[18]。因此，MPO或NE的水平?jīng)Q定了中性粒細(xì)胞激活的程度。中性粒細(xì)胞在刺激后更容易受到C3a/C3aR的激活，發(fā)生脫顆粒反應(yīng)。免疫組化結(jié)果顯示，SAA可以抑制心肌缺血組織中C3aR的表達(dá)，從而降低中性粒細(xì)胞的脫顆粒反應(yīng)。ELISA 結(jié)果顯示，與C3a模型組相比，SAA可以抑制C3a誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞脫顆粒，提示SAA通過調(diào)控C3a/C3aR 通路抑制中性粒細(xì)胞活化過程中的脫顆粒反應(yīng)。

綜上所述，本研究表明SAA能夠改善MI小鼠的心功能，顯著降低心肌梗死小鼠心臟梗死區(qū)的中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)活化和血小板在心臟梗死區(qū)的募集和活化，降低該區(qū)域炎癥反應(yīng)?？寡“遄饔檬峭ㄟ^調(diào)節(jié)血小板相關(guān)的通路PI3K/Akt、VASP發(fā)揮作用，降低中性粒細(xì)胞活化可能是通過抑制C3aR及C3a的表達(dá)發(fā)揮作用。