逍遙散對四氯化碳誘導(dǎo)的急性肝損傷的保護作用及其機制

張文超，葛冰景，周 薏，闕任燁

(1. 上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海 201203；2. 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬上海市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，上海 200082)

肝臟是機體重要的合成代謝場所，在調(diào)節(jié)消化功能、物質(zhì)代謝、營養(yǎng)貯存、解毒造血等生理功能方面發(fā)揮著重要作用。病毒感染、飲酒過度、服藥不當(dāng)、誤食毒物等是臨床上常見的引起急性肝損傷的原因，近年來由于臨床新藥的品種逐漸增多，藥物性肝損傷的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年增高的趨勢。中醫(yī)藥是祖國醫(yī)學(xué)的瑰寶，目前已有越來越多的研究表明一些中藥復(fù)方或中藥提取物具有顯著的保肝作用。逍遙散出自《太平惠民和劑局方》，在臨床上主要運用于多種急慢性肝臟疾病如急慢性肝損傷、肝纖維化、早期肝硬化等的治療，其具有顯著的保肝作用[1-2]，但其作用機制目前仍未完全明確。本實驗利用四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷模型，觀察了逍遙散的保肝效應(yīng)及其作用機制，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 實驗材料與方法

1.1實驗動物 SPF級雄性ICR成年小鼠60只，體重18～22 g，購自上海市實驗動物中心，動物合格證號：SCXK(滬)2013-0016，飼養(yǎng)于上海市中醫(yī)醫(yī)院無特異病原體(SPF)級動物房，恒溫(25±2)℃、恒濕，人工光照12 h、黑暗12 h，自由進食飲水。本動物實驗規(guī)程遵循“實驗動物關(guān)愛和使用指南”。

1.2試劑 四氯化碳及橄欖油購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；雙環(huán)醇片購自北京協(xié)和藥廠，國藥準字H20051712；蘇木素-伊紅染色液(P031IH) 購于湖南艾佳生物科技股份有限公司；B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)、p-Bcl-2、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)抗體(Abcam公司)；辣根酶標(biāo)記山羊抗鼠、兔IgG(cell signaling technology公司)；Janus激酶2(JAK2)、p-JAK2、信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)、p-STAT3、β-actin抗體(cell signaling technology公司)；白細胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)ELISA試劑盒購自上海西唐生物科技有限公司；丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)比色法試劑盒購自南京建成生物科技有限公司。

1.3藥物配制 逍遙散組方：柴胡15 g、當(dāng)歸15 g、白芍15 g、白術(shù)15 g、茯苓15 g、甘草7.5 g，粉碎成粗粉，加水1 500 mL煮沸，保持沸騰20 min，加入5 g煨姜和5 g薄荷，再保持沸騰煎煮10 min，煎煮液過5層紗布，濾液濃縮至1 g/mL、2 g/mL、3 g/mL(按生藥量計)分別作為低、中、高劑量，經(jīng)冷凍干燥制成粉末，用前以蒸餾水配制成混懸液。雙環(huán)醇片制成粉末后用蒸餾水配制成濃度為110 mg/kg的混懸液。5%四氯化碳油劑按四氯化碳與橄欖油1∶20配制，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.4儀器 快速研磨儀JXFSTPRP-48(上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司)，多功能酶標(biāo)儀Varioscan Flash(上海百基生物科技有限公司)，RM2016切片機(萊卡公司)，生物組織攤烤片機YT-6C(亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司)，防脫載玻片P031IH(湖南艾佳生物科技股份有限公司)，鼓風(fēng)干燥箱DHC-9070A(天津津立儀器設(shè)備科技發(fā)展有限公司)，光學(xué)顯微鏡AE41(麥克奧迪實業(yè)集團有限公司)，AU400型全自動生化分析儀(日本奧林巴斯公司)，小型垂直電泳轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(美國Bio-rad公司)，ChemiDocTMXRS+凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-rad公司)，Neofuge 15R型臺式高速冷凍離心機(中國Heal force公司)。

1.5實驗方法 取48只ICR小鼠，隨機分為正常組、模型組、逍遙散低劑量組、逍遙散中劑量組、逍遙散高劑量組、雙環(huán)醇組，每組8只。逍遙散低、中、高劑量組分別給予1 g/mL、2 g/mL、3 g/mL濃度逍遙散10 mL/(kg·d)灌胃，雙環(huán)醇組給予110 mg/kg濃度的雙環(huán)醇懸液灌胃，正常組及模型組灌胃等量生理鹽水。灌胃1周后，除正常組外，其余組小鼠參照文獻[3-4]方法進行四氯化碳誘導(dǎo)的急性肝損傷模型制作，即橄欖油稀釋成的5%四氯化碳溶液10 mL/kg腹腔注射，正常組予腹腔注射同等劑量的橄欖油。所有小鼠在造模24 h后處死，取血清、肝組織標(biāo)本。血清標(biāo)本用蛋白酶抑制劑處理，-20 ℃中保存?zhèn)溆?；肝組織標(biāo)本用含0.01% DEPC的生理鹽水清洗后保存于-80 ℃中，部分標(biāo)本用中性福爾馬林固定12 h后經(jīng)石蠟包埋，3～5 μm厚連續(xù)切片備檢。

1.6檢測指標(biāo)及方法

1.6.1血清肝功能指標(biāo)測定 使用全自動生化分析儀檢測各組小鼠血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、乳酸脫氫酶(LDH)水平。

1.6.2肝臟病理組織HE染色觀察 取備檢石蠟切片，經(jīng)脫蠟、水化、染色、分化、透明、封片、鏡檢，分別觀察各組切片肝臟病變嚴重程度，使用ImagePro Plus軟件對壞死區(qū)域進行半定量分析。

1.6.3肝臟組織中氧化應(yīng)激及炎性因子指標(biāo)檢測取各組小鼠部分肝組織，采用比色法檢測MDA、SOD含量，采用ELISA法檢測IL-6、TNF-α含量，均按照試劑盒說明書操作測定。

1.6.4肝組織中JAK2-STAT3信號通路及凋亡相關(guān)蛋白表達檢測 采用Western blot法檢測：取各組小鼠部分肝臟組織，裂解后提取蛋白，使用BCA蛋白試劑盒檢測蛋白含量。以SDS-PAGE凝膠(5%濃縮膠，12%分離膠)進行電泳，分離蛋白，通過半干轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至PVDF膜，PVDF膜經(jīng)5%的脫脂奶粉搖床上慢搖2 h封閉，分別與JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、p-Bcl-2、Bcl-2、Caspase-3、β-actin抗體4 ℃過夜，室溫孵育二抗2 h，ECL光化學(xué)顯色。最后應(yīng)用Image J分析軟件對掃描條帶進行定量分析，計算各蛋白相對表達量。

2 結(jié) 果

2.1各組小鼠血清肝功能指標(biāo)水平 模型組小鼠血清ALT、AST、LDH水平均顯著高于正常組(P均<0.05)；逍遙散各劑量組和雙環(huán)醇組血清ALT、AST、LDH水平均顯著低于模型組(P均<0.05)，且逍遙散各劑量組血清ALT、AST、LDH水平均呈劑量依賴性降低，兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。見表1。

表1 正常組和急性肝損傷各組小鼠血清肝功能指標(biāo)比較

2.2各組小鼠肝臟病理組織學(xué)HE染色情況 正常組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)正常，肝細胞排列整齊；模型組小鼠肝細胞結(jié)構(gòu)紊亂，胞漿疏松，小葉內(nèi)見多個壞死灶，壞死灶內(nèi)見大量中性粒細胞浸潤，肝細胞受損面積為(42.3±6.4)%；逍遙散低、中、高劑量組和雙環(huán)醇組病灶炎癥程度明顯輕于模型組，肝細胞受損面積分別為(33.9±6.0)%、(23.8±4.0)%、(18.3±3.9)%、(18.9±4.2)%，均顯著低于模型組(P均<0.05)，且逍遙散各劑量組呈劑量依賴性降低，兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。各組病理表現(xiàn)見圖1。

2.3各組小鼠肝組織中氧化應(yīng)激指標(biāo)含量比較與正常組比較，模型組小鼠肝臟組織中MDA含量顯著升高(P<0.05)，SOD含量顯著下降(P<0.05)。逍遙散各劑量組和雙環(huán)醇組小鼠肝組織中MDA含量均顯著低于模型組(P均<0.05)，SOD含量均顯著高于模型組(P均<0.05)，且逍遙散各劑量組MDA、SOD含量均呈劑量依賴性降低或升高，兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。見表2。

表2 正常組和急性肝損傷各組小鼠肝組織中氧化應(yīng)激指標(biāo)含量比較

2.4各組小鼠肝組織中炎癥因子含量比較 模型組小鼠肝組織中IL-6、TNF-α含量均顯著高于正常組(P均<0.05)；逍遙散各劑量組和雙環(huán)醇組小鼠肝組織中IL-6、TNF-α含量均顯著低于模型組(P均<0.05)，且逍遙散各劑量組IL-6、TNF-α含量均呈劑量依賴性降低，兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。見表3。

表3 正常組和急性肝損傷各組小鼠肝組織中炎癥因子含量比較

2.5各組小鼠肝組織中JAK2/STAT3信號通路及凋亡相關(guān)蛋白表達情況比較 與正常組比較，模型組小鼠肝組織中p-JAK2、p-STAT3、Cleaved-Caspase-3蛋白相對表達量均顯著升高(P均<0.05)，p-Bcl-2蛋白相對表達量顯著下降(P<0.05)。逍遙散各劑量組和雙環(huán)醇組小鼠肝組織中p-JAK2、p-STAT3、Cleaved-Caspase-3蛋白相對表達量均顯著低于模型組(P均<0.05)，p-Bcl-2蛋白相對表達量均顯著高于模型組(P均<0.05)，且逍遙散各劑量組各指標(biāo)均呈劑量依賴性降低或升高，兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。見圖2及表4。

3 討 論

表4 正常組和急性肝損傷各組小鼠肝組織中JAK2/STAT3信號通路及凋亡相關(guān)蛋白相對表達量比較

急性肝損傷可由多種理化及生物因素所導(dǎo)致，根據(jù)致病因素的差異，一般可分為病毒性肝損傷、化學(xué)性肝損傷、藥物性肝損傷、酒精性肝損傷、免疫性肝損傷、缺血再灌注肝損傷等[5]。急性肝損傷的本質(zhì)是肝細胞受到外界刺激后引起的大量變性壞死，病情嚴重者可誘發(fā)休克、膿毒癥、肝性腦病、凝血障礙，甚至有引起多臟器功能衰竭并最終導(dǎo)致患者死亡的風(fēng)險。因此，積極探索合理有效的途徑以減輕或逆轉(zhuǎn)急性肝損傷具有十分重要的臨床意義。

逍遙散是臨床上廣泛應(yīng)用于急慢性肝炎、肝硬化、膽石癥、胃及十二指腸潰瘍、慢性胃炎等的中藥方劑，課題組前期研究發(fā)現(xiàn)逍遙散可顯著改善肝郁脾虛型乙肝后肝硬化代償期患者肝功能[6]。在前期研究基礎(chǔ)上，本實驗探討了其保肝作用的分子機制。

四氯化碳作為一種化工原料，因其具有無色、易揮發(fā)、不易燃、嗜肝性等特點，是用于建立急性肝損傷動物模型最經(jīng)典的化學(xué)毒物。一般采用四氯化碳制作小鼠急性肝損傷模型可通過經(jīng)皮下或腹腔注射的途徑，其造模穩(wěn)定性及成功率較高。四氯化碳誘導(dǎo)的急性肝損傷，其實質(zhì)是肝細胞的氧化應(yīng)激損傷。四氯化碳因其具有脂溶性，在正常情況下易透過肝細胞膜，在細胞色素酶P450的催化下進一步轉(zhuǎn)化為自由基CCl3·和Cl·，CCl3·又可與O2結(jié)合為CCl3O2·，上述自由基可攻擊肝細胞膜中的不飽和脂質(zhì)，引起肝細胞脂質(zhì)過氧化損傷[7]。MDA是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的最終產(chǎn)物，肝組織中MDA含量可反映氧化應(yīng)激損傷程度。SOD是體內(nèi)抗氧化體系中最重要的一種酶，其活性的強弱可反映機體的抗氧化能力。本研究中，模型組小鼠血清ALT、AST、LDH水平及肝組織中MDA含量顯著升高，肝臟組中SOD含量顯著降低，提示四氯化碳引起了肝臟氧化應(yīng)激損傷，肝細胞損傷后細胞內(nèi)ALT、AST、LDH等酶類即釋放入血，血清中這些指標(biāo)增高說明肝細胞受損。

肝細胞損傷后亦可釋放多種細胞因子如TNF-α、IL-1β、IL-6等，這些物質(zhì)可進一步誘導(dǎo)肝臟中中性粒細胞及肝臟庫普弗細胞浸潤，并激活庫普弗細胞促使其分泌更多的TNF-α、IL-1β 、IL-6，形成正反饋途徑。另外，四氯化碳進入人體后可直接激活庫普弗細胞，加速炎癥反應(yīng)進程。因此，TNF-α、IL-1β 、IL-6等可作為反映急性肝損傷時肝臟炎癥程度的指標(biāo)。有多項研究表明，四氯化碳誘導(dǎo)的急性肝損傷小鼠血清及肝組織中TNF-α、IL-1β、IL-6水平均顯著升高[8-10]，本實驗也發(fā)現(xiàn)該模型小鼠肝組織中TNF-α、IL-6含量較正常小鼠明顯增高。這些細胞因子可激活細胞中多條信號通路，如MAPKs、JAK/STAT、TLR4/NF-κB等，進一步活化炎癥級聯(lián)反應(yīng)。JAK2 /STAT3 信號通路能介導(dǎo)多種炎癥及細胞因子的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，在這些因子的作用下，可使JAK2發(fā)生磷酸化激活，活化的JAK2可進一步激活STAT3，調(diào)節(jié)下游基因轉(zhuǎn)錄過程，發(fā)揮調(diào)節(jié)肝細胞增殖分化、肝細胞凋亡、肝臟物質(zhì)與能量代謝、炎癥級聯(lián)等過程的作用[3]。既往有實驗研究證實四氯化碳誘導(dǎo)的急性肝損傷小鼠肝組織中JAK2/STAT3磷酸化水平顯著升高[3，11]，而柴胡皂苷d、黃連素、過墻風(fēng)總黃酮可通過抑制JAK2/STAT3信號通路顯著減輕肝臟的急性損傷[3，12-13]。本實驗結(jié)果顯示，模型組小鼠肝組織中p-JAK2、p-STAT3蛋白表達量顯著升高，而逍遙散各劑量組肝組織中p-JAK2、p-STAT3蛋白表達量均顯著低于模型組，提示逍遙散可抑制JAK2/STAT3磷酸化，減輕肝損傷。

四氯化碳所引起的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)一方面可引起炎癥和氧化應(yīng)激，另一方面也可導(dǎo)致肝細胞膜通透性增加，胞漿內(nèi)Ca2+濃度上升，通過激活JAK2/STAT3信號通路使促凋亡基因表達升高，誘發(fā)肝細胞凋亡。細胞凋亡是細胞的一種主動的程序性死亡方式，而肝組織細胞的過度凋亡是肝損傷發(fā)生發(fā)展的一個重要因素[14]。Bcl-2基因在細胞凋亡發(fā)生的過程中具有重要作用，其主要位于線粒體外膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜及核膜上，有維持線粒體膜完整性的作用，可通過阻止線粒體向胞漿釋放細胞色素C而發(fā)揮抗凋亡效應(yīng)。因此，當(dāng)Bcl-2表達下降時，細胞色素C被釋放入胞漿，其可與凋亡相關(guān)因子-1結(jié)合成多聚體，隨后逐步剪切活化Caspase-3。Caspase-3是細胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中最關(guān)鍵的效應(yīng)分子，也是誘導(dǎo)細胞凋亡的最終執(zhí)行者。研究表明，在四氯化碳誘導(dǎo)的急性肝損傷模型中，肝組織中Bcl-2磷酸化水平降低，Cleaved-Caspase-3表達量增加，提示細胞凋亡被誘發(fā)[15]。許慶慶[16]研究報道，使用凋亡抑制劑可顯著減輕肝臟損傷程度。本實驗中發(fā)現(xiàn)，四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷肝組織中p-Bcl-2蛋白相對表達量顯著下降，Cleaved-Caspase-3蛋白相對表達量顯著升高，與文獻[15]報道相符；逍遙散各劑量組肝組織中p-Bcl-2蛋白相對表達量顯著高于模型組，Cleaved-Caspase-3蛋白相對表達量顯著低于模型組，提示逍遙散可抑制細胞凋亡。

綜上所述，四氯化碳誘導(dǎo)的急性肝損傷與氧化應(yīng)激、炎癥級聯(lián)反應(yīng)、信號通路激活、細胞凋亡等多種作用機制有關(guān)，且它們之間相互促進、相互影響，共同加重疾病的發(fā)生發(fā)展。因此，抗氧化、抗炎、抑制信號通路活化、抑制凋亡等途徑的藥物有可能成為具有保肝作用的潛在治療藥物。逍遙散具有顯著的保肝、抗炎、抗氧化作用，其作用機制可能與抑制JAK2/STAT3信號通路活化及細胞凋亡有關(guān)。本研究對中藥經(jīng)方逍遙散保肝作用機制作出了一定的探索，為其臨床應(yīng)用提供了實驗依據(jù)，也為中藥復(fù)方的現(xiàn)代化研究與應(yīng)用提供了一種探索模式。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。