芒柄花素對(duì)免疫抑制小鼠小腸黏膜免疫功能的影響

毛甜甜 白 衡 賈 寧

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，蘭州 730070)

免疫抑制是指動(dòng)物機(jī)體免疫系統(tǒng)受到損傷而導(dǎo)致的暫時(shí)性或持久性的免疫機(jī)能障礙，使機(jī)體對(duì)各種病原易感性顯著增加的一種狀態(tài)。近年來，有關(guān)畜禽免疫抑制性疾病的報(bào)道不斷增多，其發(fā)病率與感染率也不斷增高和日趨嚴(yán)重，已成為制約我國畜牧業(yè)生產(chǎn)發(fā)展的重大問題。因此，隨著中醫(yī)藥免疫學(xué)的發(fā)展，利用中藥材來調(diào)節(jié)動(dòng)物機(jī)體免疫功能已成為研究的熱門話題。芒柄花素(formonetin, FMN)為異黃酮類化合物，又稱刺芒柄花素，廣泛存在于植物中。研究表明，F(xiàn)MN也是沙冬青種子中總黃酮的主要組成成分[1]，具有調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、抗腫瘤、抗炎、抗菌、抗氧化、降血脂等作用[2-3]。由于FMN具有較低的副作用和毒性[4]，因此近年來成為研究熱點(diǎn)，但主要研究方向還在于其抗腫瘤作用。Wu等[5]研究證明FMN通過調(diào)控miR-21和抑癌基因PTEN抑制人膀胱癌細(xì)胞的增殖和侵襲性。張彥平等[6]研究證明FMN對(duì)動(dòng)物機(jī)體免疫功能具有調(diào)節(jié)作用并對(duì)免疫器官及功能具有修復(fù)作用。但腸道黏膜免疫系統(tǒng)作為機(jī)體整個(gè)免疫網(wǎng)絡(luò)中的重要組成部分，有關(guān)FMN對(duì)其影響等報(bào)道鮮見。因此，本研究旨在深入探索FMN對(duì)小鼠小腸黏膜免疫功能的影響，為進(jìn)一步研發(fā)沙冬青種子總黃酮新型免疫增強(qiáng)劑奠定重要基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

FMN(上海某生化科技有限公司)；環(huán)磷酰胺(美國Sigam公司)；白細(xì)胞介素-2(IL-2)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)檢測試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)；分泌型免疫球蛋白A(sIgA)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物分組與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

50只清潔級(jí)昆明種小鼠，購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK(甘)2020—0002，20日齡、體重18～20 g，常規(guī)飼養(yǎng)管理，適應(yīng)1周后分組。隨機(jī)分為5組：空白對(duì)照組、免疫抑制模型組以及FMN低、中、高劑量組，每組10只(雌雄各占1/2)。

全部動(dòng)物試驗(yàn)共28 d。前7 d，空白對(duì)照組小鼠灌胃0.6 mL/d 生理鹽水，免疫抑制模型組與FMN低、中、高劑量組小鼠均灌胃40 mg/(kg·d)環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide, CTX)0.6 mL；后21 d，空白對(duì)照組與免疫抑制模型組小鼠每天灌胃0.6 mL生理鹽水，F(xiàn)MN低、中、高劑量組小鼠分別灌胃 50、150、250 mg/(kg·d)FMN 0.6 mL。常規(guī)飼養(yǎng)管理，每日稱取小鼠體重。末次給藥24 h后，脫臼處死，分別進(jìn)行臟器指數(shù)、腸黏膜細(xì)胞因子及sIgA含量測定。同時(shí)，采集小鼠各段腸道黏膜，分別進(jìn)行顯微與超微結(jié)構(gòu)觀察。

1.3 胸腺和脾臟指數(shù)測定

取小鼠胸腺和脾臟，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，用濾紙吸去多余水分稱重，并計(jì)算胸腺和脾臟指數(shù)。

小鼠胸腺(脾臟)指數(shù)=小鼠胸腺(脾臟)

質(zhì)量/小鼠空腹體質(zhì)量。

1.4 小腸黏膜IL-2、IL-6及sIgA含量測定

取靠近十二指腸段空腸約2 cm，PBS沖洗后刮取腸黏膜，稱重，加入9倍生理鹽水制成10%的組織勻漿，3 500 r/min離心10 min，取上清液，-20 ℃保存。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法檢測小腸黏膜IL-2、IL-6及sIgA含量。

1.5 小腸黏膜顯微與超微結(jié)構(gòu)觀察

取十二指腸、空腸、回腸各3段(每段1.5 cm)，PBS沖洗后，4%多聚甲醛磷酸緩沖液固定。常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片(厚度4 μm)，每隔5張切片取1張，進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)染色和過碘酸雪夫(PAS)染色，鏡下觀察小腸黏膜結(jié)構(gòu)特點(diǎn)以及上皮細(xì)胞與杯狀細(xì)胞形態(tài)并拍照，Image-Pro Plus軟件測量腸絨毛高度和隱窩深度，計(jì)算絨腺比(絨腺比=絨毛高度/隱窩深度，V/C)，統(tǒng)計(jì)每100個(gè)上皮細(xì)胞間的上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞(IELs)和杯狀細(xì)胞數(shù)量。取1 mm3回腸2.5%戊二醛固定，樹脂包埋，超薄切片(70 nm)，雙重染色(醋酸鈾、硝酸鉛)，透射電子顯微鏡分析、拍照。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 FMN對(duì)免疫抑制小鼠胸腺和脾臟指數(shù)的影響

由表1可知，免疫抑制模型組小鼠胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)均低于空白對(duì)照組，尤其脾臟指數(shù)差異顯著(P<0.05)。證明CTX對(duì)小鼠胸腺和脾臟的發(fā)育產(chǎn)生了明顯抑制作用，表明小鼠免疫抑制模型復(fù)制成功。與免疫抑制模型組相比，F(xiàn)MN各劑量組小鼠胸腺和脾臟指數(shù)均有不同程度的升高，尤其FMN中劑量組小鼠胸腺和脾臟指數(shù)升高，其中胸腺指數(shù)差異顯著(P<0.05)，脾臟指數(shù)差異極顯著(P<0.01)。結(jié)果表明，F(xiàn)MN對(duì)免疫抑制小鼠胸腺、脾臟的生長發(fā)育具有顯著的促進(jìn)作用。

表1 FMN對(duì)免疫抑制小鼠胸腺、脾臟指數(shù)的影響

2.2 FMN對(duì)免疫抑制小鼠小腸黏膜IL-2、IL-6及sIgA含量的影響

由表2可知，免疫抑制模型組小鼠小腸黏膜IL-2和IL-6含量均顯著低于空白對(duì)照組(P<0.05)，sIgA含量極顯著低于空白對(duì)照組(P<0.01)，這也證明CTX對(duì)小鼠小腸黏膜免疫功能產(chǎn)生了明顯抑制，導(dǎo)致小腸黏膜IL-2、IL-6含量大大降低。與免疫抑制模型組相比，F(xiàn)MN各劑量組小鼠小腸黏膜IL-2、IL-6和sIgA含量均有不同程度的升高，其中FMN中劑量組IL-2含量與sIgA含量差異極顯著(P<0.01)，IL-6含量差異顯著(P<0.05)。結(jié)果表明FMN對(duì)免疫抑制小鼠小腸黏膜免疫功能具有明顯的促進(jìn)作用。

表2 FMN對(duì)免疫抑制小鼠小腸黏膜IL-2、IL-6及sIgA含量的影響

2.3 FMN對(duì)免疫抑制小鼠小腸組織結(jié)構(gòu)的影響

空白對(duì)照組小腸絨毛排列緊密、整齊，絨毛上皮細(xì)胞連續(xù)、完整(圖1-A)。免疫抑制模型組小鼠小腸絨毛排列明顯稀疏、雜亂，且黏膜上皮有明顯脫落(圖1-B)，表明CTX對(duì)小鼠小腸黏膜屏障產(chǎn)生了明顯的損傷。與免疫抑制模型組比較，F(xiàn)MN各劑量組小鼠小腸絨毛不同程度的增多，絨毛間隙逐漸變窄、整齊，上皮細(xì)胞連續(xù)性程度不等恢復(fù)。其中，以FMN中劑量組表現(xiàn)最明顯(圖1-C、圖1-D、圖1-E)。

A：空白對(duì)照組；B：免疫抑制模型組；C：FMN低劑量組；D：FMN中劑量組；E：FMN高劑量組。圖3同。

由表3可知，空白對(duì)照組十二指腸、空腸及回腸絨毛高度均高于免疫抑制模型組，其中十二指腸和空腸絨毛高度與免疫抑制模型組比較，差異極顯著(P<0.01)，這也進(jìn)一步表明，免疫抑制模型組小鼠小腸黏膜結(jié)構(gòu)受損。與免疫抑制模型組相比，F(xiàn)MN各劑量組小鼠小腸絨毛高度均不同程度的增高，尤其FMN中劑量組最突出，其中十二指腸和空腸絨毛高度極顯著增加(P<0.01)。而各組腸道隱窩深度雖有一定變化，但不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此外，與免疫抑制模型組比較，F(xiàn)MN各劑量組小鼠小腸各段V/C也均不同程度的增高，其中，F(xiàn)MN中劑量組小腸各段V/C增高最明顯，尤其十二指腸V/C顯著增高(P<0.05)。這一結(jié)果表明，F(xiàn)MN對(duì)免疫抑制小鼠小腸黏膜屏障和結(jié)構(gòu)的損傷有明顯的修復(fù)作用。

表3 FMN對(duì)免疫抑制小鼠小腸絨毛高度、隱窩深度及絨腺比的影響

2.4 FMN對(duì)免疫抑制小鼠小腸黏膜上皮IELs和杯狀細(xì)胞的影響

小鼠小腸IELs彌散分布于腸黏膜上皮細(xì)胞之間，以小淋巴細(xì)胞為主，胞核大而圓、染色深，胞漿少(圖2-A、圖2-B)。小鼠小腸杯狀細(xì)胞主要分布于腸黏膜上皮細(xì)胞和腸腺細(xì)胞之間，呈高腳杯狀，PAS染色呈陽性反應(yīng)，胞核呈藍(lán)紫色，糖原及其他PAS反應(yīng)陽性物質(zhì)呈紅色(圖2-C、圖2-D)。

上面2個(gè)圖為十二指腸IELs，A：免疫抑制模型組，B：FMN中劑量組(HE，400×)；下面2個(gè)圖為十二指腸杯狀細(xì)胞，C：免疫抑制模型組；D：FMN中劑量組(HE，200×)。

由表4可知，免疫抑制模型組小鼠小腸黏膜IELs和杯狀細(xì)胞的數(shù)量均低于空白對(duì)照組，IELs數(shù)量在回腸差異顯著(P<0.05)，在其他腸段差異極顯著(P<0.01)；杯狀細(xì)胞數(shù)量在十二指腸差異顯著(P<0.05)，在回腸差異極顯著(P<0.01)，這也進(jìn)一步證明CTX對(duì)小鼠小腸黏膜免疫活性細(xì)胞的分化與成熟產(chǎn)生明顯的抑制作用。FMN各劑量組與免疫抑制模型組比較，小腸黏膜IELs和杯狀細(xì)胞的數(shù)量均有不同程度的增多，尤其FMN中劑量組小鼠小腸黏膜IELs和杯狀細(xì)胞的數(shù)量增多最突出，其中十二指腸、空腸和回腸IELs的數(shù)量差異顯著或極顯著(P<0.05或P<0.01)；杯狀細(xì)胞數(shù)量差異極顯著(P<0.01)。這表明FMN對(duì)免疫抑制小鼠小腸黏膜免疫活性細(xì)胞的分化和成熟也具有明顯的促進(jìn)作用。

表4 FMN對(duì)免疫抑制小鼠小腸黏膜IELs和杯狀細(xì)胞數(shù)量的影響

2.5 FMN對(duì)免疫抑制小鼠小腸黏膜超微結(jié)構(gòu)的影響

電鏡觀察表明，空白對(duì)照組小鼠小腸黏膜上皮細(xì)胞呈柱狀，上皮柱狀細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞間連接緊密，細(xì)胞界限清晰，細(xì)胞游離面有許多微絨毛排列整齊的伸向腸腔(圖3-A)；同時(shí)，上皮柱狀細(xì)胞內(nèi)線粒體等細(xì)胞器結(jié)構(gòu)完整，胞核完整核膜清晰(圖3-A)。免疫抑制模型組與空白對(duì)照組相比較，上皮柱狀細(xì)胞微絨毛明顯縮短，甚至斷裂，排列雜亂、稀疏，有的上皮柱狀細(xì)胞壞死崩解，細(xì)胞器程度不等擴(kuò)張呈空泡狀，線粒體腫脹、嵴斷裂崩解，有的細(xì)胞核溶解，細(xì)胞間連接疏散(圖3-B)。與免疫抑制模型組相比，F(xiàn)MN各劑量組小腸黏膜上皮柱狀細(xì)胞微絨毛明顯增長，且逐漸排列緊密整齊，同時(shí)，變性上皮柱狀細(xì)胞明顯減少，上皮柱狀細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器空泡化也明顯減少，細(xì)胞間連接明顯清晰，尤其中劑量組表現(xiàn)明顯(圖3-D)。

圖3 FMN對(duì)免疫抑制小鼠小腸黏膜超微結(jié)構(gòu)的影響

3 討 論

大量研究證明，CTX不僅可以造成動(dòng)物機(jī)體外周淋巴細(xì)胞數(shù)量迅速下降，引發(fā)機(jī)體免疫抑制，同時(shí)也可以導(dǎo)致機(jī)體腸道黏膜屏障損傷，從而導(dǎo)致腸道黏膜免疫抑制[7-9]。本試驗(yàn)研究也證明，CTX不僅引起小鼠免疫抑制，胸腺、脾臟顯著萎縮，而且對(duì)腸道黏膜免疫屏障也造成明顯損傷和抑制；當(dāng)CTX灌胃后，小鼠胸腺指數(shù)與脾臟指數(shù)均顯著低于空白對(duì)照組，小腸絨毛高度顯著下降，微絨毛斷裂，柱狀上皮細(xì)胞變性壞死，腸黏膜IL-2、IL-6和sIgA含量以及IELs和杯狀細(xì)胞數(shù)量也顯著低于空白對(duì)照組，再次證明CTX不僅對(duì)機(jī)體產(chǎn)生免疫抑制，而且對(duì)腸道黏膜免疫系統(tǒng)也產(chǎn)生抑制。上述結(jié)果也表明，本試驗(yàn)CTX誘導(dǎo)的小鼠黏膜免疫抑制模型復(fù)制成功。

IL-2和IL-6屬于血細(xì)胞生成素(Ⅰ類)家族的細(xì)胞因子，IL-2可促進(jìn)活化T細(xì)胞和B細(xì)胞生長、增殖和分化，是調(diào)控免疫應(yīng)答的重要因子[10]。IL-6是促使B細(xì)胞分化成漿細(xì)胞并分泌抗體的重要啟動(dòng)信號(hào)[11-12]。因此，黏膜組織中IL-2和IL-6的含量可以反映其中T細(xì)胞和B細(xì)胞的表達(dá)水平。sIgA為機(jī)體黏膜免疫的主要效應(yīng)分子，具有抵抗病原入侵等多種功能[13]。崔藝燕等[14]研究表明，柑橘黃酮可以有效提高斷奶仔豬空腸黏膜IL-2、IL-6和sIgA含量；黃其春等[15]也發(fā)現(xiàn)銀杏葉總黃酮可以顯著提高仔豬腸黏膜IL-2和sIgA含量。本試驗(yàn)也表明，免疫抑制小鼠在灌胃FMN后，小腸黏膜IL-2、IL-6和sIgA含量不同程度的升高，其中FMN中劑量組升高最明顯，首次證明FMN可促進(jìn)小腸黏膜T、B淋巴細(xì)胞的分化與成熟，促使小腸黏膜IL-2、IL-6和sIgA的分泌，顯著增強(qiáng)和改善免疫抑制機(jī)體小腸黏膜免疫功能。

腸絨毛高度、隱窩深度和V/C等是衡量小腸消化、吸收功能強(qiáng)弱的重要指標(biāo)。大量研究指出，動(dòng)物機(jī)體小腸絨毛高度反映出小腸黏膜與接觸營養(yǎng)物質(zhì)的面積大小；隱窩深度反映了細(xì)胞的生成率和分泌功能；而V/C則反映小腸功能的狀態(tài)[16-17]。同時(shí)，小腸黏膜的完整性、連續(xù)性以及各種免疫活性細(xì)胞的數(shù)量、分布等還反映出其黏膜屏障的功能和特性。王瑩等[18]研究證明，葡萄原花青素可改善營養(yǎng)性肥胖大鼠回腸絨毛高度、隱窩深度和V/C，從而加強(qiáng)小腸消化吸收功能。本研究也證明，CTX誘導(dǎo)的免疫抑制小鼠小腸黏膜結(jié)構(gòu)受損，V/C顯著降低，上皮柱狀細(xì)胞及微絨毛也嚴(yán)重?fù)p傷。而FMN具有明顯促進(jìn)免疫抑制小鼠小腸黏膜屏障和結(jié)構(gòu)的修復(fù)作用。

小腸黏膜的相關(guān)免疫活性細(xì)胞是其黏膜免疫活性的重要組成，特別是IELs和杯狀細(xì)胞等[19]。IELs是機(jī)體消化道黏膜免疫系統(tǒng)中與外來抗原及微生物最先發(fā)生接觸并發(fā)生免疫反應(yīng)的細(xì)胞。已有研究表明，IELs可以對(duì)小腸道黏膜屏障損傷或感染做出快速反應(yīng)，誘導(dǎo)黏膜免疫應(yīng)答，保護(hù)小腸黏膜上皮，維持其腸道穩(wěn)態(tài)。杯狀細(xì)胞可分泌黏蛋白等形成腸道黏液屏障從而對(duì)腸黏膜形成保護(hù)和潤滑作用[20-21]。此外，有研究表明，杯狀細(xì)胞還具有分泌抗菌肽、趨化因子和細(xì)胞因子等免疫活性因子和抗原呈遞功能[22]。因此，小腸IELs和杯狀細(xì)胞的數(shù)量的變化可以反映出小腸膜免疫屏障的完整性以及免疫防御完善性。黃其春等[15]和李焰等[23]研究均證明銀杏葉總黃酮可以通過改善機(jī)體腸黏膜結(jié)構(gòu)，促進(jìn)機(jī)體腸黏膜IELs和杯狀細(xì)胞的增殖，從而保護(hù)腸道黏膜屏障的完整性。本試驗(yàn)研究也首次證明，F(xiàn)MN不僅能夠明顯改善和修復(fù)免疫抑制小鼠小腸黏膜結(jié)構(gòu)和損傷，而且明顯促進(jìn)小腸黏膜IELs和杯狀細(xì)胞增殖和分化，從而大大增強(qiáng)和改善機(jī)體小腸消化和黏膜免疫功能。

已有研究表明，異黃酮化合物可對(duì)動(dòng)物機(jī)體腸道黏膜免疫功能產(chǎn)生明顯影響。Wei等[24]的研究發(fā)現(xiàn)，膳食異黃酮能夠抑制小鼠黏膜免疫應(yīng)答，而染料木黃酮和橙皮苷則能通過促進(jìn)腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞的增殖來增強(qiáng)黏膜免疫[25]。胡勝蘭等[26]研究從細(xì)胞水平證明了低濃度大豆異黃酮對(duì)氧化應(yīng)激仔豬腸上皮細(xì)胞具有保護(hù)作用，但濃度過高時(shí)則對(duì)細(xì)胞呈抑制作用。楊金玉等[27]研究也證明，作為黃酮類化合物的葡萄原花青素在一定作用劑量下，可有效調(diào)節(jié)感染球蟲的肉仔雞腸道IELs數(shù)量和sIgA含量，然而隨著其劑量的增加，調(diào)節(jié)作用反而降低。這與本試驗(yàn)研究結(jié)果均一致，較低作用劑量的FMN可促進(jìn)小鼠小腸黏膜免疫功能的增強(qiáng)；相反，較高的作用劑量則使小鼠小腸黏膜免疫功能降低或抑制，但關(guān)于FMN適宜劑量范圍還需要進(jìn)一步研究證明。因此，本研究認(rèn)為黃酮類化合物可能對(duì)機(jī)體腸黏膜免疫功能具有雙向調(diào)節(jié)作用，但具體作用機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

綜上所述，一定劑量的FMN可顯著改善和促進(jìn)免疫抑制小鼠小腸黏膜免疫功能的恢復(fù)和增強(qiáng)；同時(shí)，還可減少小腸黏膜的損傷，恢復(fù)和促進(jìn)小腸黏膜結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定，尤其以FMN中劑量組(150 mg/kg)最為明顯。