脂多糖刺激對斷奶仔豬空腸形態(tài)結構、炎癥反應和程序性壞死信號通路相關基因表達的影響

徐啟龍 汪 洋 李先根 肖 勘 肖世平 魏偉群 劉玉蘭*

(1.武漢輕工大學動物營養(yǎng)與飼料科學湖北省重點實驗室，武漢 430023；2.江西天佳生物工程股份有限公司，南昌 330200)

腸道不僅是消化和吸收營養(yǎng)物質的重要場所，也是機體重要的屏障器官，能夠抵御內源性和外源性有害物質進入機體內環(huán)境[1]。許多因素如應激、感染和炎癥等能導致腸黏膜損傷和功能障礙[2]，但是腸道損傷的機制尚未闡明。

腸道損傷與細胞死亡密切相關。目前公認的主要細胞死亡類型有3種，即壞死、凋亡和自噬。凋亡又稱“程序性死亡”，在生物體發(fā)育過程中普遍存在，是一種由基因控制的、主動的、有序性的細胞死亡方式。壞死則是由一種由物理、化學或生物等因素導致的細胞死亡方式，傳統(tǒng)上，壞死被認為是無序的、被動的、不可逆和不可調控的[2-3]。近年來，一種新鑒定的細胞死亡方式——程序性壞死，因有別于傳統(tǒng)的細胞死亡方式——壞死、凋亡及自噬，而成為生命醫(yī)學領域的研究熱點[3]。研究表明，程序性壞死是一種由基因決定的細胞主動有序的死亡方式，不依賴于半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)途徑，一般在凋亡被抑制的情況下發(fā)生，可最終引發(fā)鄰近細胞的免疫應答[4]；死亡細胞具有典型的壞死細胞的形態(tài)學特征，細胞和細胞器體積腫大，線粒體擴大崩解，溶酶體膜破壞，酶類釋放到周圍組織，核膜破裂，核溶解，碎核涌出細胞，會引起周圍組織的炎癥反應[5]。

程序性壞死信號通路的關鍵調控因子有受體相互作用蛋白激酶1(RIP1)、受體相互作用蛋白激酶3(RIP3)、混合系列蛋白激酶結構域樣蛋白(MLKL)[6]。研究表明，程序性壞死在缺血再灌注和炎癥反應等多種因素導致的組織損傷中發(fā)揮重要作用。抑制程序性壞死對這些因素誘導的組織損傷具有重要的預防和治療作用[7]。然而，程序性壞死在脂多糖(LPS)注射誘導的仔豬腸道損傷中的作用尚未被闡明。因此，本試驗采用腹膜注射LPS構建仔豬腸道損傷模型，來探究LPS刺激對斷奶仔豬腸道形態(tài)及程序性壞死信號通路的影響，為揭示程序性壞死在腸道損傷中的作用奠定初步基礎，最終為尋求緩解腸道損傷的措施提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

LPS：大腸桿菌血清型055∶B5，購于Sigma公司；RNA提取、反轉錄及實時定量PCR所用試劑盒信息參見黃菲菲等[8]。

1.2 試驗設計

選取12頭平均體重為(7.07±0.57)kg的28日齡杜×長×大三元斷奶仔豬，隨機分為2組，分別為對照組和LPS刺激組，每組6頭。所有仔豬自由飲水、采食，預飼9 d，仔豬狀態(tài)良好，體重達到(8.96±0.54)kg。LPS刺激組腹腔注射100 μg/kg BW的LPS，對照組注射等量的生理鹽水。注射LPS 4 h后將仔豬麻醉屠宰，取空腸中部置于冰上，用生理鹽水清洗后，剪取3 cm固定于4%多聚甲醛溶液中用于制作組織切片；另取相近腸段10 cm沿縱向剪開刮取腸黏膜后存放在液氮中，最后再轉移到-80 ℃超低溫冰箱保存待測。

1.3 測定指標與方法

1.3.1 空腸組織形態(tài)學分析

首先將空腸組織樣品進行包埋，制成5 μm的切片，然后進行蘇木素-伊紅(HE)染色、樹脂膠封片等處理，之后在Olympus光學顯微鏡下觀察空腸組織形態(tài)，測量絨毛高度、隱窩深度，并計算兩者比值。具體方法參照陳逢[9]。

1.3.2 空腸黏膜DNA、RNA、蛋白質含量測定

取空腸黏膜制備成勻漿液，然后稀釋為1%勻漿液后測定DNA、RNA、蛋白質含量。蛋白質含量采用南京建成生物工程研究所生產的考馬斯亮藍試劑盒測定，DNA和RNA含量采用參照Johnson等[10]使用分光光度計法測定。根據(jù)蛋白質、DNA和RNA含量計算RNA/DNA、蛋白質/DNA值。

1.3.3 空腸炎性細胞因子和程序性壞死信號通路相關基因mRNA相對表達量測定

提取空腸黏膜總RNA，然后按照Prime Script RT Reagent Kit試劑盒步驟將RNA逆轉錄成cDNA，熒光定量聚合酶鏈式反應采用SYBR?Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)real-time PCR試劑盒。以3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)作為參比基因，采用Livak等[11]的2-ΔΔCt法計算目的基因——炎性細胞因子[環(huán)氧合酶2(COX2)、熱休克蛋白70(HSP70)、白細胞介素-6(IL-6)]和程序性壞死信號通路相關基因[RIP1、自殺相關因子死亡結構域(FADD)、Caspase8、RIP3、MLKL、磷酸甘油酸變位酶5(PAGM5)、動力相關蛋白1(Drp1)、高遷移率族蛋白1(HMGB1)]的mRNA相對表達量。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.4 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件進行獨立樣本t檢驗，結果以平均值±標準誤來表示。以P≤0.01為差異極顯著，P≤0.05為差異顯著，0.05

2 結 果

2.1 LPS刺激對斷奶仔豬空腸形態(tài)結構的影響

由圖1可知，對照組空腸絨毛形態(tài)結構完整，絨毛較長；LPS刺激后空腸絨毛嚴重萎縮，并大量脫落。由表2可知，與對照組相比，LPS刺激導致空腸絨毛高度和隱窩深度顯著降低(P<0.05)。

表2 LPS刺激對斷奶仔豬空腸形態(tài)結構的影響

圖1 空腸組織切片

2.2 LPS刺激對斷奶仔豬空腸黏膜蛋白質含量以及RNA/DNA和蛋白質/DNA的影響

由表3可知，與對照組相比，LPS刺激顯著降低了空腸黏膜RNA/DNA(P<0.05)，同時蛋白質含量和蛋白質/DNA有顯著下降趨勢(P=0.054、P=0.095)。

表3 LPS刺激對斷奶仔豬空腸黏膜蛋白質含量以及RNA/DNA和蛋白質/DNA的影響

2.3 LPS刺激對斷奶仔豬空腸炎性細胞因子mRNA相對表達量的影響

由表4可知，與對照組相比，LPS刺激后導致空腸HSP70和IL-6的mRNA相對表達量顯著升高(P<0.05)，COX2的mRNA相對表達量極顯著升高(P<0.01)。

表4 LPS刺激對斷奶仔豬空腸炎性細胞因子mRNA相對表達量的影響

2.4 LPS刺激對斷奶仔豬空腸程序性壞死信號通路相關基因mRNA相對表達量的影響

由表5可知，與對照組相比，LPS刺激后導致空腸程序性壞死信號通路相關基因RIP1的mRNA相對表達量顯著升高(P<0.05)，RIP3的mRNA相對表達量極顯著升高(P<0.01)。

表5 LPS刺激對斷奶仔豬空腸程序性壞死信號通路相關基因mRNA相對表達量的影響

3 討 論

LPS存在于所有革蘭氏陰性細菌的細胞膜中，對宿主有毒性。LPS能誘導腸道形態(tài)學損傷，如黏膜下水腫、出血、黏膜壞死，并導致黏膜通透性增加和細菌移位[12]。因此，通過在豬腹膜或靜脈注射一定劑量的LPS是構建仔豬腸道損傷模型的經(jīng)典方式[13]。本試驗采用LPS刺激仔豬，探究其對仔豬空腸形態(tài)結構、炎癥反應和程序性壞死信號通路的影響。

腸道絨毛高度、隱窩深度、絨毛高度/隱窩深度常被用來評估腸道形態(tài)和結構的完整性[14]。蛋白質、RNA和DNA含量是反映腸道生長發(fā)育及損傷修復的指標，蛋白質/DNA、RNA/DNA可表明蛋白質合成能力[15]。本試驗中，LPS刺激導致斷奶仔豬腸道絨毛形態(tài)結構發(fā)生了顯著變化，表現(xiàn)為絨毛萎縮、脫落；同時，LPS刺激導致空腸絨毛高度和隱窩深度顯著降低，并顯著降低了空腸黏膜RNA/DNA，同時蛋白質含量、蛋白質/DNA有顯著下降趨勢，表明LPS刺激導致斷奶仔豬空腸結構和功能受損。Liu等[16]的研究結果也表明LPS刺激會導致斷奶仔豬空腸和回腸黏膜結構損傷，與本研究結果一致。

研究表明，炎性細胞因子COX2、HSP70和IL-6等在炎癥性腸病中起著重要作用[17]。COX2在炎癥的發(fā)生和消退過程中都起到了重要作用：在炎癥發(fā)生期通過合成前列腺素E2(PGE2)誘導炎癥細胞釋放趨化因子發(fā)揮促炎作用，在炎癥消退期以合成前列腺素D2(PGD2)、15-脫氧前列腺素J2(15ΔPGJ2)發(fā)揮拮抗炎癥和抑制氧化應激的作用[18]。HSP70在機體抵御各種有害刺激中發(fā)揮重要作用，可抗細胞凋亡、抗氧化，參與機體的先天免疫反應和細胞免疫[19]。IL-6則能通過加強炎性細胞因子的級聯(lián)反應，促使炎性細胞因子大量產生，最終引起局部炎癥反應[20]。Lang等[21]的研究結果表明，在大鼠腸道中LPS刺激會提高炎性細胞因子COX2和HSP70的mRNA相對表達量，并促使其在短時間內(1～2 h)達到峰值。本試驗中，LPS刺激導致斷奶仔豬空腸COX2、HSP70和IL-6的mRNA相對表達量顯著提高，表明LPS刺激導致空腸炎癥反應激活并使空腸受損加重。

在病理條件下，細胞程序性壞死和炎癥互相影響[22]。目前，研究較為廣泛的是腫瘤壞死因子(TNF)與死亡受體腫瘤壞死因子受體1(TNFR1)結合所介導的程序性壞死信號通路。TNF與TNFR1結合可引起后者構象變化，隨后募集胞內的TNF受體相關信號分子腫瘤壞死因子受體相關死亡域蛋白(TRADD)、RIP1等形成復合體Ⅰ。隨后，復合體Ⅰ上的TRADD和RIP1會解離并發(fā)生磷酸化且提供新的結合位點，這些結合位點又會募集FADD、Caspase8、RIP1形成新的復合體Ⅱ[23-25]。當Caspase8活性被抑制時，復合體Ⅱ上的RIP1、RIP3、MLKL發(fā)生磷酸化，執(zhí)行程序性壞死功能。本試驗檢測了程序性壞死信號通路相關基因的mRNA相對表達量變化，結果表明，LPS刺激顯著提高了斷奶仔豬空腸程序性壞死信號通路相關基因RIP1、RIP3的mRNA相對表達量，說明LPS刺激導致程序性壞死信號通路激活。因此，我們推測，仔豬空腸的損傷和炎癥反應與程序性壞死信號通路激活密切相關。

4 結 論

LPS刺激損傷了斷奶仔豬的空腸形態(tài)結構，激活了炎癥反應和程序性壞死信號通路。