梁 嬋 陳代文 何 軍 鄭 萍 毛湘冰 虞 潔 羅玉衡 羅鈞秋 黃志清 閻 輝 余 冰
(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營養(yǎng)研究所,動(dòng)物抗病營養(yǎng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,成都 611130)
仔豬斷奶階段是機(jī)體免疫力增強(qiáng)和胃腸道發(fā)育完善的關(guān)鍵過渡期,此時(shí)極易遭受外界多種有害因素的干擾,從而引起仔豬腹瀉和生長性能下降。飼用抗生素是用于預(yù)防和治療斷奶仔豬腹瀉和促生長的重要手段之一,但目前我國正處于飼料禁抗的大背景下,因而,推動(dòng)開發(fā)安全、綠色和高效的抗生素替代品和替代方案具有重要意義。近年來,纖維和植物精油作為天然植物的組成部分,具有安全、環(huán)保且來源廣泛等優(yōu)點(diǎn),引起了眾多研究者的關(guān)注。研究表明,飼糧纖維能夠調(diào)節(jié)動(dòng)物腸道菌群結(jié)構(gòu),增加短鏈脂肪酸(如乙酸、丙酸和丁酸)的產(chǎn)生,對改善動(dòng)物腸道健康、增強(qiáng)機(jī)體免疫和提高生長性能具有重要意義[1-2]。植物精油具有抗菌、抗炎和抗氧化的功能,能夠提高動(dòng)物機(jī)體免疫和抗氧化作用,調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu),改善腸道健康,促進(jìn)動(dòng)物生長[3-4]。然而,在動(dòng)物生產(chǎn)中,單一添加飼糧纖維或植物精油作用有限,均難以達(dá)到完全替代抗生素的效果。有研究表明,將可溶和不溶性纖維復(fù)合添加、多種植物精油混合使用其效果均優(yōu)于單一添加[5-7]。Chen等[8]研究發(fā)現(xiàn),可溶和不可溶性纖維(0.5%菊粉+0.5%木質(zhì)纖維素)復(fù)合添加對仔豬促生長效果優(yōu)于單一纖維;賈淋雁[9]研究指出,仔豬飼糧中添加200 mg/kg復(fù)合植物精油能夠提高仔豬的免疫功能和抗氧化能力,并能緩解豬流行性腹瀉病毒攻毒誘導(dǎo)發(fā)生的腹瀉和生長性能的下降,且復(fù)合植物精油的添加效果優(yōu)于單一植物精油[10]。此外,蒲俊寧[10]研究表明,植物精油、益生菌和酸化劑(400 mg/kg牛至油+400 mg/kg凝結(jié)芽孢桿菌+3 000 mg/kg苯甲酸)組合添加能提高仔豬抗氧化能力,改善生長性能并降低仔豬腹瀉。類似的研究也發(fā)現(xiàn),植物精油與酸化劑、益生菌和酶制劑等聯(lián)合添加在斷奶仔豬生產(chǎn)上的應(yīng)用均表現(xiàn)出協(xié)同的效果[11-13]。不過,關(guān)于植物精油與纖維聯(lián)合使用的效果如何,目前相關(guān)研究缺乏,有待進(jìn)一步探索。因此,本研究推測復(fù)合纖維和植物精油聯(lián)合使用可能具有潛在的加性效應(yīng),并考察復(fù)合纖維和植物精油聯(lián)合添加在大腸桿菌攻毒條件下對斷奶仔豬生長性能、抗氧化能力和免疫功能的影響,旨在為仔豬無抗飼料的研發(fā)提供參考依據(jù)。
菊粉:主要成分為天然果聚糖,白色粉末狀,100%可溶,純度>90%,購自于陜西某公司;微晶纖維素:已純化并部分解聚的纖維素,白色粉末狀,100%不溶,純度≥99%,購自于山東某公司;植物精油:主要活性成分為多種天然植物精油,由3%尤加利精油、2%牛至精油、0.5%百里香精油、0.1%檸檬精油、0.1%大蒜精油和5%椰子油組成,半包被淺褐色粉末,具有中草藥氣味,由四川某公司惠贈;金霉素:有效含量15%,使用劑量25~75 g/t;維吉尼亞霉素:有效含量50%,使用劑量10~25 g/t;喹烯酮:有效含量98%,使用劑量50 g/t;產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(血清型O149:K91,K88ac)購買于中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心。
試驗(yàn)采用單因素設(shè)計(jì),選取28頭(28±1)日齡的健康“杜×長×大”斷奶仔豬,根據(jù)體重[(7.93±0.44)kg]相近原則,隨機(jī)分為4個(gè)組,分別為對照組(飼喂基礎(chǔ)飼糧)、攻毒對照組(飼喂基礎(chǔ)飼糧)、抗生素組(飼喂基礎(chǔ)飼糧+75 mg/kg金霉素+25 mg/kg維吉尼亞霉素+50 mg/kg喹烯酮)和復(fù)合纖維+植物精油組(飼喂基礎(chǔ)飼糧+0.5%菊粉+0.5%微晶纖維素+200 mg/kg植物精油),每組7個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)1頭仔豬,單籠飼養(yǎng)。試驗(yàn)期25 d。于試驗(yàn)第22天上午,對仔豬進(jìn)行空腹稱重后,各試驗(yàn)組試豬一次性灌服10 mL/kg BW大腸桿菌(6×109CFU/mL)懸浮液,而對照組采用相同方式灌服生理鹽水。
基礎(chǔ)飼糧為玉米-豆粕-乳清粉-魚粉型,參考NRC(2012)營養(yǎng)需求配制而成,各試驗(yàn)組飼糧均由相應(yīng)產(chǎn)品等量替代基礎(chǔ)飼糧中的玉米構(gòu)成,所有飼糧均為粉料?;A(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。
表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))
試驗(yàn)在四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營養(yǎng)研究所試驗(yàn)基地仔豬試驗(yàn)舍進(jìn)行,所有仔豬按常規(guī)飼養(yǎng)管理方式進(jìn)行。試驗(yàn)期間,每日飼喂3次(08:00、14:00和20:00),每次以試豬采食結(jié)束后料槽略有余料為度,自由飲水。圈舍室溫保持在26~28 ℃,相對濕度為45%~75%。對照組和大腸桿菌攻毒組(試驗(yàn)組)試豬分舍飼養(yǎng),以防止交叉感染。
試驗(yàn)第26天,對所有仔豬空腹稱重后,前腔靜脈采血15 mL,置于普通真空采血管,室溫靜置30 min后低溫離心(3 500 r/min,10 min),分離出血清,-20 ℃保存,待測血清生化指標(biāo)。采血完成后,按照試豬體重以0.1 mL/kg肌肉注射術(shù)眠靈注射液(主要成分為賽拉嗪、咪達(dá)唑侖)進(jìn)行麻醉,隨后頸動(dòng)脈放血屠宰,打開腹腔,快速結(jié)扎空腸。于空腸1/2處剪取20 cm腸段,縱向剖開,用生理鹽水沖凈腸道內(nèi)容物并用濾紙吸干水分,使用玻璃片刮取空腸黏膜置于2 mL凍存管中,將樣品放入液氮速凍后轉(zhuǎn)入-80 ℃保存待測。
1.6.1 生長性能
于試驗(yàn)第1天和第26天上午,對空腹過夜的仔豬進(jìn)行稱重,并每日記錄每頭豬只的采食量,計(jì)算第1~25天的平均日采食量(ADFI)、平均日增重(ADG)和料重比(F/G)。
1.6.2 血清和腸道抗氧化指標(biāo)
10%空腸黏膜勻漿樣品制備:稱取1 g左右空腸黏膜樣,準(zhǔn)確記錄重量,按重量∶體積=1∶9的比例加入4 ℃預(yù)冷的生理鹽水,于超聲破碎儀勻漿,勻漿液于4 ℃離心機(jī)3 000 r/min離心15 min,吸取上清,分裝后于-80 ℃保存待測。
血清和空腸黏膜中總抗氧化能力(T-AOC)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性、丙二醛(MDA)含量以及空腸黏膜中總蛋白(TP)含量均采用相應(yīng)試劑盒(南京建成生物工程研究所)進(jìn)行測定,具體操作均嚴(yán)格按照說明書執(zhí)行。
1.6.3 血清和腸道免疫指標(biāo)
血清中免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素-4(IL-4)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)和白細(xì)胞介素-10(IL-10)采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司)進(jìn)行測定,具體操作均嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。
采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR測定空腸黏膜免疫相關(guān)基因IL-6、IL-1β、TNF-α以及Toll樣受體4(TLR4)/髓樣分化因子88(MyD88)信號通路相關(guān)基因TLR4、CD14、MyD88、白細(xì)胞介素-1受體相關(guān)激酶1(IRAK1)、腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(TRAF6)和核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)p65 mRNA相對表達(dá)量(詳細(xì)引物序列見表2),具體操作方法參考Fu等[14]。所有目的基因mRNA相對表達(dá)量均以β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)為內(nèi)參基因,相對熒光定量采用2-ΔΔCt法計(jì)算[15]。
表2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列
試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SAS 9.4統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行分析。其中,對照組和攻毒對照組之間的差異采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行對比分析;而試驗(yàn)組所有指標(biāo)均采用Mixed模型進(jìn)行單因素方差分析,并結(jié)合Duncan氏法進(jìn)行多重比較。結(jié)果以平均值(mean)表示,數(shù)據(jù)的變異性以均值標(biāo)準(zhǔn)誤(SEM)表示,以P<0.05視為差異顯著,0.05≤P<0.10視為有差異顯著趨勢。
由表3可知,各組仔豬生長性能無顯著差異(P>0.05)。但與對照組相比,攻毒對照組組仔豬ADG降低了7.19%(P>0.05),F(xiàn)/G提高了5.59%(P>0.05);與攻毒對照組相比,復(fù)合纖維+植物精油組仔豬ADFI和ADG分別提高了26.06%和31.73%(P>0.05);與抗生素組相比,復(fù)合纖維+植物精油組仔豬ADFI和ADG分別提高了10.82%和10.97%(P>0.05)。
表3 復(fù)合纖維和植物精油聯(lián)合添加對大腸桿菌攻毒仔豬生長性能的影響
由表4可知,與對照組相比,攻毒對照組仔豬血清和空腸黏膜MDA含量顯著提高(P<0.05),血清GSH-Px活性顯著提高(P<0.05),血清T-AOC有降低的趨勢(P=0.064)。與攻毒對照組相比,抗生素組和復(fù)合纖維+植物精油組仔豬血清T-AOC顯著提高(P<0.05),空腸黏膜MDA含量顯著降低(P<0.05),且復(fù)合纖維+植物精油組血清MDA含量也顯著降低(P<0.05)。與抗生素組相比,復(fù)合纖維+植物精油組仔豬血清和空腸黏膜抗氧化指標(biāo)均無顯著差異(P>0.05),但血清MDA含量有降低趨勢(P=0.059),空腸黏膜T-AOC有提高趨勢(P=0.075)。
表4 復(fù)合纖維和植物精油聯(lián)合添加對大腸桿菌攻毒仔豬血清和空腸黏膜抗氧化指標(biāo)的影響
由表5可知,與對照組相比,攻毒對照組仔豬血清IgA和IL-4含量顯著降低(P<0.05),血清IL-1β和TNF-α含量顯著提高(P<0.05),血清IL-6含量有提高的趨勢(P=0.051)。與攻毒對照組相比,復(fù)合纖維+植物精油組仔豬血清IgA和IL-4含量顯著提高(P<0.05)。與抗生素組相比,復(fù)合纖維+植物精油組仔豬血清IgA含量顯著提高(P<0.05)。
表5 復(fù)合纖維和植物精油聯(lián)合添加對大腸桿菌攻毒仔豬血清免疫指標(biāo)的影響
由圖1可知,與對照組相比,攻毒對照組仔豬空腸黏膜IL-6 mRNA相對表達(dá)量顯著提高(P<0.05)。與攻毒對照組相比,復(fù)合纖維+植物精油組仔豬空腸黏膜IL-6 mRNA相對表達(dá)量顯著降低(P<0.05),抗生素組空腸黏膜IL-1βmRNA相對表達(dá)量顯著提高(P<0.05)。與抗生素組相比,復(fù)合纖維+植物精油組仔豬空腸黏膜IL-1β和TNF-αmRNA相對表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。
#表示對照組與攻毒對照組之間差異顯著(P<0.05)。試驗(yàn)組數(shù)據(jù)柱標(biāo)記不同字母表示差異顯著(P<0.05)。圖2同。
由圖2可知,與對照組相比,攻毒對照組仔豬空腸黏膜NF-κBp65和IRAK1 mRNA相對表達(dá)量顯著提高(P<0.05),空腸黏膜TLR4 mRNA相對表達(dá)量有提高的趨勢(P=0.083)。與攻毒對照組相比,復(fù)合纖維+植物精油組仔豬空腸黏膜TLR4和NF-κBp65 mRNA相對表達(dá)量顯著降低(P<0.05),而抗生素組空腸黏膜CD14和MyD88 mRNA相對表達(dá)量則顯著提高(P<0.05)。與抗生素組相比,復(fù)合纖維+植物精油組仔豬空腸黏膜CD14、MyD88、NF-κBp65和TRAF6 mRNA相對表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。
圖2 復(fù)合纖維和植物精油聯(lián)合添加對大腸桿菌攻毒仔豬空腸黏膜TLR4、CD14及其下游信號通路相關(guān)基因表達(dá)量的影響
纖維和植物精油被認(rèn)為是潛在的抗生素替代品,在改善動(dòng)物生長性能和預(yù)防腹瀉方面具有一定的積極作用[16-17]。Chen等[8]研究發(fā)現(xiàn),1%復(fù)合纖維能夠提高仔豬ADG,降低F/G。Alali等[18]在肉雞飲水中添加復(fù)合精油可顯著提高肉雞平均體重,降低F/G,且0.05%復(fù)合精油能顯著減少肉雞飼糧中海德爾堡沙門氏菌(SalmonellaHeidelberg)的污染。本研究發(fā)現(xiàn),與攻毒對照組相比,復(fù)合纖維+植物精油組仔豬ADFI和ADG分別提高了26.06%和31.73%,且其應(yīng)用效果優(yōu)于抗生素。這說明,在大腸桿菌感染的條件下,復(fù)合纖維和植物精油聯(lián)合添加能有效緩解仔豬生長性能下降,這與前人研究結(jié)果一致。盡管纖維和植物精油聯(lián)合添加具有一定的促生長作用,但其作用機(jī)制還不明確。而最近的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn),在蛋雞飼糧中添加復(fù)合植物提取物(主要成分是大蒜素和菊粉),即纖維和植物精油聯(lián)合添加能夠增強(qiáng)蛋雞機(jī)體的免疫功能及抗氧化能力,并提高產(chǎn)蛋率,改善蛋品質(zhì)[19]。因此,我們推測本研究中聯(lián)合添加復(fù)合纖維和植物精油發(fā)揮促生長作用可能與其對機(jī)體免疫和抗氧化能力的增強(qiáng)作用有關(guān)。
正常情況下,機(jī)體在氧化代謝過程中產(chǎn)生的自由基能被抗氧化系統(tǒng)及時(shí)清除,維持體內(nèi)氧化與抗氧化的平衡。當(dāng)動(dòng)物機(jī)體遭受應(yīng)激(如仔豬斷奶、細(xì)菌或病毒感染)時(shí),體內(nèi)產(chǎn)生大量自由基,導(dǎo)致氧化還原狀態(tài)失衡,造成機(jī)體氧化損傷[20]。MDA是脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物,可反映機(jī)體脂質(zhì)過氧化的程度,間接反映細(xì)胞的損傷程度。在本研究中,與對照組相比,攻毒對照組仔豬血清和空腸黏膜MDA含量顯著提高,血清T-AOC有降低的趨勢,說明大腸桿菌感染導(dǎo)致仔豬發(fā)生氧化應(yīng)激,降低了機(jī)體抗氧化能力。然而,大腸桿菌攻毒后仔豬血清GSH-Px活性顯著提高,這可能是由于在輕度和中度氧化應(yīng)激狀態(tài)下,機(jī)體出于自身保護(hù),體內(nèi)的自由基會誘導(dǎo)激活抗氧化酶基因的編碼啟動(dòng),從而增強(qiáng)宿主抗氧化系統(tǒng)的能力,但這并不足以保護(hù)機(jī)體免受損傷[21-22]。研究發(fā)現(xiàn),菊粉能顯著提高肉仔雞血清T-SOD和GSH-Px活性,并降低血清MDA含量[23]。Wu等[24]研究表明,菊粉能夠緩解大鼠因攝食高脂無纖維飼糧導(dǎo)致的氧化應(yīng)激。大量研究發(fā)現(xiàn),多種植物精油(如牛至精油、百里香精油和丁香精油等)都具有較強(qiáng)的抗氧化活性[25-28]。Wei等[29]研究發(fā)現(xiàn),飼糧添加牛至精油能夠顯著提高大鼠空腸黏膜超氧化物歧化酶和GSH-Px活性,顯著降低空腸黏膜活性氧(ROS)和MDA含量,有效緩解敵草快(diquat)引起的大鼠腸道氧化損傷。本研究中,復(fù)合纖維和植物精油聯(lián)合添加顯著緩解大腸桿菌攻毒仔豬血清和空腸黏膜MDA含量的升高,并顯著提高血清T-AOC,這反映了復(fù)合纖維和植物精油聯(lián)合添加能夠改善仔豬抗氧化能力,具有增強(qiáng)清除多余自由基的潛能。
當(dāng)仔豬遭受外源致病菌侵襲后,機(jī)體免疫系統(tǒng)被激活,釋放大量炎癥細(xì)胞因子(如IL-6、IL-1β和TNF-α)[30],引起機(jī)體發(fā)生嚴(yán)重的炎癥發(fā)應(yīng)[31-33]。本研究發(fā)現(xiàn),與對照組相比,攻毒對照組仔豬血清IL-6、IL-1β和TNF-α等促炎細(xì)胞因子含量有升高趨勢或顯著升高,血清IgA和IL-4含量顯著降低,說明大腸桿菌感染引起了仔豬機(jī)體發(fā)生強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)。前人研究表明,纖維能夠降低人體血液中IL-1β基因的表達(dá)量,從而緩解脂多糖(LPS)誘發(fā)的炎癥反應(yīng)[34]。Ocaa-Fuentes等[35]發(fā)現(xiàn),牛至油可顯著降低應(yīng)激狀態(tài)下人單核巨噬細(xì)胞THP-1合成TNF-α、IL-1β和IL-6,緩解動(dòng)脈粥樣硬化誘發(fā)的炎癥反應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn),與攻毒對照組相比,復(fù)合纖維和植物精油聯(lián)合添加能顯著緩解大腸桿菌攻毒仔豬血清IgA和IL-4含量的降低,說明復(fù)合纖維和植物精油聯(lián)合添加在大腸桿菌攻毒條件下能增強(qiáng)仔豬機(jī)體的免疫功能,降低攻毒引起的炎癥反應(yīng),這可能也是本試驗(yàn)中復(fù)合纖維和植物精油聯(lián)合添加緩解大腸桿菌攻毒仔豬生長性能降低的原因之一。
腸道是機(jī)體與外界飲食抗原和各種微生物持續(xù)接觸最廣泛的部位,是機(jī)體防御的最前線、最大的免疫器官。當(dāng)仔豬遭受大腸桿菌侵襲后,腸道黏膜中分泌型免疫球蛋白A(sIgA)和IL-10含量顯著降低,黏膜中IL-6、IL-1β和TNF-α含量顯著提高,導(dǎo)致腸道屏障發(fā)生炎癥損傷[13,36-37]。本研究發(fā)現(xiàn),與對照組相比,攻毒對照組仔豬空腸黏膜中IL-6 mRNA相對表達(dá)量顯著提高,而飼糧聯(lián)合添加復(fù)合纖維和植物精油能顯著緩解空腸黏膜中IL-6 mRNA相對表達(dá)量的升高,但抗生素組空腸黏膜中IL-1βmRNA相對表達(dá)量則顯著提高??梢姡?lián)合添加復(fù)合纖維和植物精油能夠改善大腸桿菌攻毒導(dǎo)致的仔豬腸道炎癥損傷,而抗生素則會加劇這種炎癥損傷。
Toll樣受體(Toll-like receptor,TLR)是機(jī)體內(nèi)一類重要的模式識別受體,在腸道免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用。當(dāng)大腸桿菌入侵后,TLR與病原相關(guān)分子模式(如LPS)相結(jié)合,激活下游信號通路,誘導(dǎo)促炎因子合成和釋放,引發(fā)炎癥反應(yīng)[38]。本研究發(fā)現(xiàn),與對照組相比,攻毒對照組仔豬空腸黏膜NF-κBp65和IRAK1 mRNA相對表達(dá)量顯著提高,且空腸黏膜TLR4 mRNA相對表達(dá)量有提高的趨勢,這與Pu等[13]的結(jié)果基本一致。而與攻毒對照組相比,復(fù)合纖維和植物精油聯(lián)合添加能夠顯著緩解仔豬空腸黏膜TLR4和NF-κBp65 mRNA相對表達(dá)量的提高,而抗生素則顯著提高CD14和MyD88 mRNA相對表達(dá)量,該結(jié)果與上述炎癥因子的釋放相一致??梢?,大腸桿菌攻毒后,復(fù)合纖維和植物精油聯(lián)合添加可通過抑制TLR4/核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)信號通路激活來降低炎癥因子IL-6的釋放,從而緩解仔豬腸道的炎癥損傷;而抗生素則會激活該通路,使得炎癥因子IL-1β釋放增加,加劇腸道炎癥損傷。
飼糧聯(lián)合添加復(fù)合纖維和植物精油可顯著抑制大腸桿菌誘導(dǎo)的仔豬氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng),改善仔豬生長性能,且作用效果優(yōu)于抗生素。其中,復(fù)合纖維和植物精油聯(lián)合添加緩解大腸桿菌引起的仔豬腸道炎癥損傷的機(jī)制,與其抑制TLR4/NF-κB信號通路降低炎癥因子的釋放有關(guān)。