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    山藥品種蘇蕷8號(hào)抗炭疽病基因的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序與表達(dá)分析

    2022-05-12 10:58:26韓曉勇殷劍美張培通
    華北農(nóng)學(xué)報(bào) 2022年2期
    關(guān)鍵詞:炭疽病侵染山藥

    韓曉勇,蔣 璐,殷劍美,金 林,張培通

    (江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 經(jīng)濟(jì)作物研究所,江蘇 南京 210014)

    炭疽病是為害山藥最為嚴(yán)重的病害之一,如果未及時(shí)有效控制,其損失可達(dá)80%以上,甚至絕收,嚴(yán)重制約著山藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展。山藥炭疽病主要為害山藥葉片,也可為害莖蔓,其病癥狀復(fù)雜,一般先從植株下部開始發(fā)病?;瘜W(xué)藥劑是防治山藥炭疽病的主要手段,但易帶來(lái)環(huán)境污染、生態(tài)失衡及食品安全等問(wèn)題,而且頻繁使用農(nóng)藥可能會(huì)導(dǎo)致致病菌株變異,出現(xiàn)致病性更強(qiáng)的毒株[1]。培育抗炭疽病的山藥品種是控制田間山藥病害最有效和理想的方法,但山藥以營(yíng)養(yǎng)繁殖為主,存在生理限制。盡管通過(guò)常規(guī)育種在培育抗炭疽病雜交種方面取得了一些進(jìn)展[2],但進(jìn)展仍然緩慢。傳統(tǒng)技術(shù)和分子技術(shù)的結(jié)合將是開發(fā)具有穩(wěn)定抗性山藥品種的更好方法,以保護(hù)山藥免受廣譜真菌病原體的侵害,從而改善山藥品質(zhì)。近年來(lái),基因組學(xué)輔助育種(GAB,Genome-assisted breeding)已成為一種強(qiáng)有力的植物育種策略,它將基因組學(xué)與高通量表型分析相結(jié)合,以改良作物[3]。

    炭疽病抗性基因的挖掘及分子標(biāo)記輔助選擇,是培育山藥廣譜、高效和穩(wěn)定的抗病品種的重要途徑。通過(guò)對(duì)易感基因型(TDa95/0310)和2種炭疽病抗性山藥基因型(TDa87/01091和TDa95/0328)的比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析,TDa95/0328和TDa87/01091分別有115,180個(gè)高表達(dá)的EST,它們與碳水化合物代謝、細(xì)胞壁生物合成、脂質(zhì)和氨基酸代謝、次生和激素代謝、轉(zhuǎn)錄因子、蛋白質(zhì)合成以及多種病程相關(guān)信號(hào)蛋白和宿主防御相關(guān)基因有關(guān)[4-5]。Upadhyaya等[6]利用14 739個(gè)SNP標(biāo)記定位到了8個(gè)與高粱抗炭疽病有關(guān)的位點(diǎn)。Yang等[7]通過(guò)圖位克隆的方法從苜蓿中克隆獲得RCT1基因,該基因?qū)儆赥IR-NBS-LRR類基因,將RCT1轉(zhuǎn)化到對(duì)炭疽病敏感的苜蓿植株中后,轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出對(duì)炭疽病的廣譜抗性。采用同源克隆和RT-PCR方法,從草莓久香克隆到FaNBS20全長(zhǎng)cDNA序列,草莓抗炭疽病品種甜查理接種草莓炭疽病菌后,F(xiàn)aNBS20的表達(dá)水平顯著提高,而在感病品種久香FaNBS20的表達(dá)則一直處于較低水平,表明該基因可能與炭疽病的抗性相關(guān)[8]。編碼ABA-響應(yīng)蛋白、亮氨酸富集蛋白、黃酮-3-羥化酶及谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶的基因在抗炭疽病高粱植株內(nèi)被明顯誘導(dǎo)表達(dá)但在易感植株內(nèi)幾乎檢測(cè)不到,表明這些基因在植株抗炭疽病方面可能發(fā)揮著非常重要的作用[9]。目前,利用RNA-seq技術(shù)挖掘山藥炭疽病抗性基因尚未見報(bào)道。

    本試驗(yàn)利用RNA-seq技術(shù)分析不同時(shí)期高抗和高感品種的山藥葉片受炭疽菌侵染后的基因表達(dá)變化,挖掘山藥參與炭疽病抗性相關(guān)基因,對(duì)關(guān)鍵抗性基因進(jìn)行表達(dá)分析,構(gòu)建山藥響應(yīng)炭疽病侵染的分子途徑,旨在為揭示山藥抗炭疽病的分子機(jī)制,培育山藥廣譜、高效和穩(wěn)定的抗病品種奠定基礎(chǔ)。

    1 材料和方法

    試驗(yàn)于2019—2021年在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所實(shí)驗(yàn)室完成。

    1.1 試驗(yàn)材料及處理

    1.1.1 試驗(yàn)材料 膠孢炭疽菌菌株4-2由筆者保存于本實(shí)驗(yàn)室。山藥品種蘇蕷8號(hào),是江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院利用浙江省臺(tái)州市地方紫山藥品種臺(tái)州紫山藥經(jīng)系統(tǒng)選育的高感炭疽病品系024,組培誘變所形成的品種,其薯形好,產(chǎn)量高,高抗炭疽病。用于差異基因表達(dá)分析的高感品系024和江西短紫山藥、高抗品種蘇蕷8號(hào)和蘇蕷6號(hào)、中抗品種紅河山藥均種植于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院南京市六合試驗(yàn)基地。當(dāng)年繁殖的蘇蕷8號(hào)和品系024的種薯,次年用作接種材料。

    1.1.2 試驗(yàn)處理 選取蘇蕷8號(hào)和品系024的健康、無(wú)病、大小一致的種薯,播種于鋪滿基質(zhì)的花盆中,置于恒溫恒濕的培養(yǎng)環(huán)境中培養(yǎng)。待植株長(zhǎng)至5~6葉期,用2 mm左右接種針針刺展開葉葉片,將PDA平板培養(yǎng)7 d后的菌株用無(wú)菌水配制成濃度為1×106個(gè)/mL的孢子懸浮液,均勻噴霧于植株葉片并遮防護(hù)罩保濕,24 h后摘罩。為防止誤差,每片葉針刺2孔,葉片正面和背面分別噴霧2次孢子懸浮液。收集蘇蕷8號(hào)接種0,24,48,72,96 h(R0h、R24h、R48h、R72h、R96h),品系024接種24,48,72,96 h(S24h、S48h、S72h、S96h)的葉片,液氮速凍后置于-80 ℃冰箱中保存。每個(gè)樣品為3~5片葉的混合樣,每個(gè)處理3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

    1.2 RNA-seq測(cè)序及原始數(shù)據(jù)處理、分析

    基于Illumina HiSeq 2500測(cè)序平臺(tái)對(duì)構(gòu)建好的cDNA文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序,測(cè)序工作由南京集思慧遠(yuǎn)生物科技有限公司完成。測(cè)序得到的原始圖像數(shù)據(jù)文件,經(jīng)堿基識(shí)別(Base Calling)分析轉(zhuǎn)化為原始測(cè)序序列(Raw Data或Raw Reads),用Sanger質(zhì)量值Q來(lái)評(píng)估原始數(shù)據(jù)的測(cè)序質(zhì)量,獲得Clean data。經(jīng)De novo組裝后,獲得山藥的Unigene庫(kù)。

    1.3 差異基因的篩選和功能注釋

    采用Bowtie 2將測(cè)序得到的Reads與Unigene庫(kù)進(jìn)行比對(duì),根據(jù)比對(duì)結(jié)果,結(jié)合RSEM進(jìn)行表達(dá)量水平估計(jì)。利用FPKM值計(jì)算各樣品中每個(gè)基因的表達(dá)量。采用DESeq 2軟件進(jìn)行2組樣品間的差異表達(dá)分析,將|Fold Change|≥4且 FDR<0.05作為篩選標(biāo)準(zhǔn)。篩選獲得的差異基因進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG Pathway富集分析,以P<0.05為閾值。

    1.4 Q-PCR驗(yàn)證

    選取3個(gè)差異表達(dá)基因,利用Oligo 6軟件設(shè)計(jì)引物,以Actin基因?yàn)閮?nèi)參(表1),用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序同批次采集樣品的cDNA為模板進(jìn)行Q-PCR,驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)的可靠性。設(shè)3次生物學(xué)重復(fù),按照2-ΔΔCt算法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

    1.5 差異基因表達(dá)分析

    在炭疽病發(fā)病盛期,分別取品系024、江西短紫山藥、蘇蕷8號(hào)、蘇蕷6號(hào)和紅河山藥的3~5片展開葉,液氮速凍后置于-80 ℃冰箱中保存。每個(gè)品種3個(gè)生物學(xué)重復(fù),其中,品系024和江西短紫山藥的感病葉和健康葉分別進(jìn)行取樣保存。

    表1 Q-PCR基因及引物Tab.1 The genes and primers used for Q-PCR

    2 結(jié)果與分析

    2.1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果質(zhì)量評(píng)估

    去除含有接頭的、重復(fù)的、質(zhì)量低的片段,9個(gè)樣品獲得Clean reads 在18 538 496~20 504 603條(表2)。各樣品Clean data均達(dá)到5 561 548 900 bp及以上,GC含量均高于44%,N堿基含量均為0,Q30堿基百分比均在90%以上,表明各樣品測(cè)序所得Clean data的堿基組成基本平衡且大部分reads的堿基質(zhì)量值大于30,符合質(zhì)量錯(cuò)誤率低于1%的要求。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序質(zhì)量較好,數(shù)據(jù)可靠。

    表2 測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果Tab.2 The statistics of transcriptome sequencing data

    2.2 差異表達(dá)基因分析

    建立抗病品種接種不同時(shí)間差異基因集,同時(shí)建立接種相同時(shí)間的抗感病品種差異基因集,選擇共同差異表達(dá)的基因,結(jié)果表明(圖1):抗感品種間與抗病品種內(nèi)接種72,96 h差異表達(dá)的基因數(shù)最多,分別為3 814,1 630個(gè)。差異表達(dá)基因韋恩圖結(jié)果表明(圖2),接種24,48,72,96 h差異表達(dá)的基因個(gè)數(shù)分別為197,132,187,313個(gè),去除各接種時(shí)間點(diǎn)共同差異表達(dá)的基因數(shù),共獲得711個(gè)差異表達(dá)的基因。

    圖1 各樣本間差異表達(dá)基因數(shù)Fig.1 The statistics of differentially expressed genes between samples

    A—D.分別為接種24,48,72,96 h差異表達(dá)基因韋恩圖;E.接種24,48,72,96 h共同差異表達(dá)基因韋恩圖。A—D.Venn map of differentially expressed genes after inoculation 24,48,72,96 h,respectively;E.Venn map of common differentially expressed genes after inoculation 24,48,72,96 h.

    2.3 差異表達(dá)基因的GO功能富集分析

    差異表達(dá)的基因GO功能分類結(jié)果表明:有666個(gè)基因被注釋,分為生物過(guò)程、細(xì)胞組分和分子功能三大類和50個(gè)亞類(圖3),其中生物過(guò)程包含20個(gè)亞類,基因數(shù)最多的5個(gè)亞類依次是細(xì)胞過(guò)程、代謝過(guò)程、單組織過(guò)程、刺激響應(yīng)和生物調(diào)節(jié);細(xì)胞組分包含15個(gè)亞類,基因數(shù)最多的2個(gè)亞類是細(xì)胞和細(xì)胞部分;分子功能包含15個(gè)亞類,基因數(shù)最多的2個(gè)亞類是結(jié)合和催化活性。差異表達(dá)基因GO功能分類基因數(shù)占比與背景基因GO功能分類基因數(shù)占比趨勢(shì)基本一致。

    BP.生物過(guò)程:BP1.細(xì)胞過(guò)程;BP2.代謝過(guò)程;BP3.單組織過(guò)程;BP4.刺激響應(yīng);BP5.生物調(diào)節(jié);BP6.定位;BP7.細(xì)胞組分組織或生物發(fā)生;BP8.發(fā)展過(guò)程;BP9.信號(hào);BP10.多細(xì)胞生物過(guò)程;BP11.生殖;BP12.生殖過(guò)程;BP13.多組織過(guò)程;BP14.免疫系統(tǒng)過(guò)程;BP15.生長(zhǎng);BP16.脫毒;BP17.節(jié)律過(guò)程;BP18.運(yùn)動(dòng);BP19.細(xì)胞殺傷;BP20.生物附著。CC.細(xì)胞組分:CC1.細(xì)胞;CC2.細(xì)胞部分;CC3.細(xì)胞器;CC4.膜;CC5.細(xì)胞器部分;CC6.膜部分;CC7.大分子復(fù)合物;CC8.胞外區(qū);CC9.膜包圍腔;CC10.細(xì)胞連接;CC11.超分子復(fù)合物;CC12.胞外區(qū)部分;CC13.擬核;CC14.其他生物體;CC15.其他生物體部分。MF.分子功能:MF1.結(jié)合;MF2.催化活性;MF3.轉(zhuǎn)運(yùn)活性;MF4.結(jié)構(gòu)分子活性;MF5.信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活性;MF6.核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性;MF7.分子轉(zhuǎn)導(dǎo)活性;MF8.分子功能調(diào)節(jié)器;MF9.電子載體活性;MF10.抗氧化活性;MF11.營(yíng)養(yǎng)庫(kù)活性;MF12.轉(zhuǎn)錄因子活性、蛋白質(zhì)結(jié)合;MF13.金屬伴侶蛋白活性;MF14.翻譯調(diào)節(jié)活;MF15.蛋白標(biāo)簽。

    GO功能顯著性富集分析表明(圖4),富集于生物過(guò)程途徑的基因數(shù)最多,為116個(gè),其中顯著富集于響應(yīng)生物刺激(GO:0050896)和應(yīng)激反應(yīng)(GO:00006950)terms的基因數(shù)分別為63,44個(gè);其次是富集于分子功能途徑的基因,為79個(gè);富集于細(xì)胞組分的基因數(shù)最少,為31個(gè)。前20條顯著富集的terms中(圖5),4個(gè)差異基因富集于生物刺激響應(yīng)term,且富集程度最高;防衛(wèi)反應(yīng)term富集基因數(shù)最多,為13個(gè);此外,有些基因富集于細(xì)胞壁修飾、氧化還原過(guò)程和催化酶活性,這些基因可能均與植物抗病有關(guān)。

    2.4 差異表達(dá)基因的KEGG富集分析

    利用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)篩選出的差異基因進(jìn)行了功能富集分類和Pathway注釋(圖6):有40個(gè)基因富集于31條信號(hào)通路,其中23條參與代謝途徑,3條參與遺傳信息處理,分別有2條參與環(huán)境信息處理和細(xì)胞進(jìn)程,1條參與有機(jī)體系統(tǒng)。糖酵解/糖異生代謝途徑富集的基因數(shù)最多,為6個(gè),其次是植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、戊糖和葡萄糖醛酸相互轉(zhuǎn)化途徑,均為5個(gè)。

    圖6 差異表達(dá)基因KEGG富集分類Fig.6 KEGG enrichment classification of the differentially expressed genes

    對(duì)所有富集的KEGG Pathway進(jìn)行篩選,共獲得10條顯著富集的 Pathway(表3)。其中5條涉及糖代謝途徑,分別是戊糖和葡萄糖醛酸相互轉(zhuǎn)化、糖酵解/糖異生、半乳糖代謝、淀粉與蔗糖代謝和磷酸戊糖途徑;2條涉及次生代謝產(chǎn)物途徑,分別是類固醇生物合成途徑和托烷、哌啶、吡啶生物堿合成途徑;分別有1條涉及植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、甘油酯代謝和生物素代謝途徑。

    2.5 山藥響應(yīng)炭疽菌侵染差異表達(dá)基因分類

    結(jié)合KEGG富集分析對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)一步按功能進(jìn)行分類,主要集中在糖代謝、植物與病原互作、激素代謝、次生代謝等途徑。

    2.5.1 淀粉和蔗糖代謝相關(guān)基因表達(dá)分析 在炭疽菌侵染24 h,與蔗糖分解有關(guān)的β-呋喃果糖苷酶(INV)和α-磷酸海藻糖合酶(TPS)、與淀粉合成有關(guān)的果糖1,6-二磷酸醛縮酶(FBA-Ⅱ)和磷酸葡糖變位酶(PGM)均上調(diào)表達(dá);與淀粉分解有關(guān)的α-淀粉酶(Ams)下調(diào)表達(dá)(圖7-A)。

    2.5.2 植物與病原互作途徑相關(guān)基因表達(dá)分析 在炭疽菌侵染24 h,多個(gè)病程相關(guān)蛋白下調(diào)表達(dá)(圖7-B),包括PR1(AOPR1、ACPR1)、PR2(β-1-3-葡聚糖酶,ACPR2、MCPR2、SIPR2)、PR4(幾丁質(zhì)酶,DBPR4)、PR6(蛋白酶抑制劑,PARR-6、CCPR-6)和PDPR10(海棗核糖核酸酶),而PR5(甜味蛋白)和ACPR-10(菠蘿核糖核酸酶)上調(diào)表達(dá);NB-ARC類抗病基因(At1g61310)和NBS-LRR類抗病基因(At4g27220、TW65_03605、TW65_04322、BRADI_1g47610v3、At4g36180、FLS2、EIX2)在炭疽菌侵染24 h均上調(diào)表達(dá),其中EIX2在炭疽菌侵染96 h時(shí),表達(dá)量最高。參與植物防衛(wèi)反應(yīng)的4個(gè)熱擊蛋白(HSP12、HSP88、HSP90、HSP70)在炭疽菌侵染24 h均上調(diào)表達(dá),其中HSP12和HSP88在炭疽菌侵染24 h表達(dá)量最高,而HSP90和HSP70在炭疽菌侵染48 h表達(dá)量最高;過(guò)氧化氫酶(CAT2)和線粒體超氧物歧化酶(MSD1)在炭疽菌侵染24 h上調(diào)表達(dá)且表達(dá)量最高;谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(AOGST)在炭疽菌侵染24 h下調(diào)表達(dá)。

    表3 差異表達(dá)基因顯著富集的KEGG通路Tab.3 KEGG pathways significantly enriched of differentially expressed genes

    A.植物與病原互作;B.淀粉和蔗糖代謝;C.激素類;D.轉(zhuǎn)錄因子;E.次生代謝。A.Plant-phytopathogen interaction;B.Starch and sucrose metabolism;C.Hormones;D.Transcription factors;E.Secondary metabolism.

    富含脯氨酸的伸展素類受體蛋白激酶(AtPERK2、SIPERK2、PERK8、PERK14),LRR類受體蛋白激酶(At1g53430、LRK10),凝集素受體激酶(HSL1)在炭疽菌侵染24 h上調(diào)表達(dá)且表達(dá)量最高,受體相互作用蛋白激酶(RIPK),溶解素基序型激酶(LYK5),凝集素受體激酶(B120)在炭疽菌侵染24 h下調(diào)表達(dá);細(xì)胞壁蛋白阿拉伯半乳聚糖蛋白(AGP19)和鈣調(diào)素結(jié)合蛋白(SHA1)在炭疽菌侵染24 h上調(diào)表達(dá),細(xì)胞壁修飾的擴(kuò)展蛋白(EXLB1)、細(xì)胞壁降解相關(guān)木葡聚糖內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶(XTH22),超敏相關(guān)蛋白(HSR4)和植物Remorin蛋白(REM)在炭疽菌侵染24 h下調(diào)表達(dá)。

    2.5.3 激素相關(guān)基因的表達(dá)分析 在炭疽菌侵染過(guò)程中,多個(gè)與防御相關(guān)的植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中基因表現(xiàn)出差異,其中生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)起主導(dǎo)作用。1個(gè)生長(zhǎng)素極性運(yùn)輸載體(LAX4)、4個(gè)生長(zhǎng)素早期響應(yīng)蛋白(IAA4、IAA21、SAUR36、SAUR71)在炭疽菌侵染24 h均上調(diào)表達(dá)且表達(dá)量最高;赤霉素調(diào)節(jié)蛋白(GAGA14、GASA2)在炭疽菌侵染24 h分別上調(diào)或下調(diào)表達(dá);茉莉酸合成關(guān)鍵酶基因12-氧代植二烯酸還原酶(OPR1)和脫落酸合成關(guān)鍵酶基因9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶(NCED)在炭疽菌侵染24 h均上調(diào)表達(dá),乙烯響應(yīng)因子(ERF036)在炭疽菌侵染24 h下調(diào)表達(dá)(圖7-C)。

    2.5.4 轉(zhuǎn)錄因子 轉(zhuǎn)錄因子在抗病信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中起重要調(diào)控作用。在炭疽菌侵染24 h,WRKY類轉(zhuǎn)錄因子(WRKY48)、GATA類轉(zhuǎn)錄因子(GATA12)、HD-ZIP類轉(zhuǎn)錄因子(HOX11)、bHLH-MYC(RSS3)和鋅指蛋白基因(ZFP7)均上調(diào)表達(dá),DREB類轉(zhuǎn)錄因子(DREB1C)在炭疽菌侵染48 h上調(diào)表達(dá)。DREB類轉(zhuǎn)錄因子(DREB1G)、WRKY類轉(zhuǎn)錄因子(WRKY75)、MYB類轉(zhuǎn)錄因子(MYB108)和TIFY類轉(zhuǎn)錄因子(TIFY10C)在炭疽菌侵染24 h下調(diào)表達(dá)(圖7-D)。

    2.5.5 次生代謝產(chǎn)物相關(guān)基因的表達(dá)分析 次生代謝產(chǎn)物作為生活壁壘可以直接參與植物的防御反應(yīng),也可以作為信號(hào)物質(zhì)參與植物抗病反應(yīng)。細(xì)胞色素P450基因(CYP94A1-like、CYP78A3、CYP51)、泛素化連接酶(UBE2、UBE3)、防御素(SD2)、幾丁質(zhì)結(jié)合凝集素(CBL1)、木菠蘿凝集素(JRL5)、甾醇C-24甲基轉(zhuǎn)移酶(BRADI_1g76020v3)在炭疽菌侵染24 h上調(diào)表達(dá),其中,CYP94A1-like、CYP78A3分別在炭疽菌侵染72,96 h表達(dá)量最高,細(xì)胞色素P450基因(CYP78A5-like)在炭疽菌侵染72 h上調(diào)表達(dá);參與木質(zhì)素合成的導(dǎo)體蛋白(DIR4)和咖啡酸3-O-甲基轉(zhuǎn)移酶(COMT)受炭疽菌侵染后下調(diào)表達(dá)(圖7-E)。

    2.6 差異表達(dá)基因的Q-PCR驗(yàn)證

    根據(jù)差異基因富集情況,選擇了植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中與生長(zhǎng)素信號(hào)相關(guān)的基因,通過(guò)Q-PCR檢測(cè)其表達(dá)水平。結(jié)果表明(圖8):LAX4、IAA4、IAA21在接種24 h上調(diào)表達(dá),與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序基因表達(dá)變化趨勢(shì)一致,表明轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果是可靠的。

    圖8 差異表達(dá)基因Q-PCR驗(yàn)證Fig.8 Q-PCR verification of differentially expressed genes

    2.7 差異表達(dá)基因的Q-PCR表達(dá)分析

    為進(jìn)一步驗(yàn)證差異基因炭疽病抗性,選擇炭疽病高感品系024和江西短紫山藥、高抗品種蘇蕷8號(hào)和蘇蕷6號(hào)、中抗品種紅河山藥,進(jìn)行Q-PCR分析,其中品系024和江西短紫山藥分別對(duì)感病葉和健康葉進(jìn)行表達(dá)分析。結(jié)果表明(圖9):IAA4、LAX4和IAA21抗病品種表達(dá)量顯著高于感病品種,其中,LAX4和IAA21在蘇蕷8號(hào)的表達(dá)量顯著高于蘇蕷6號(hào)和紅河山藥;IAA4在蘇蕷6號(hào)的表達(dá)量顯著高于其他品種,在蘇蕷8號(hào)和紅河山藥表達(dá)量無(wú)顯著差異。除IAA21江西短紫山藥健康葉表達(dá)量顯著高于感病葉外,IAA4和LAX4在感病葉和健康葉表達(dá)量無(wú)顯著差異,即健康葉不一定健康。

    024-S、 024-R、 JXD-S、JXD-R、Su8-R、Su6-R、HH-R分別表示品系024感病葉、健康葉,江西短紫山藥感病葉、健康葉,蘇蕷8號(hào)、蘇蕷6號(hào)和紅河山藥。024-S, 024-R, JXD-S, JXD-R, Su8-R, Su6-R, HH-R show strain 024 susceptible leaf and healthy leaf,Jiangxi yam susceptible leaf and healthy leaf, Suyu 8, Suyu 6 and Honghe yam.

    3 結(jié)論與討論

    3.1 淀粉代謝參與山藥炭疽病抗性

    淀粉代謝異常是植物染病后的主要生理變化之一,通常與淀粉合成有關(guān)的酶基因上調(diào)表達(dá),地上部出現(xiàn)淀粉積累,地下部發(fā)生淀粉欠缺問(wèn)題[10-11]。蔗糖合酶催化蔗糖降解,是蔗糖向淀粉轉(zhuǎn)化的第一步[12]。炭疽菌侵染24 h,蘇蕷8號(hào)葉片與蔗糖分解有關(guān)的β-呋喃果糖苷酶(INV)和α-磷酸海藻糖合酶(TPS)、與淀粉合成有關(guān)的果糖1,6-二磷酸醛縮酶(FBA-Ⅱ)和磷酸葡糖變位酶(PGM)均上調(diào)表達(dá),而與淀粉分解有關(guān)的α-淀粉酶下調(diào)表達(dá)(Ams),即山藥受炭疽菌侵染后,蘇蕷8號(hào)葉片較品系024出現(xiàn)更多的淀粉積累可能。

    3.2 防衛(wèi)基因介導(dǎo)山藥炭疽病抗性

    植物在受到病原物侵染時(shí)通過(guò)誘導(dǎo)產(chǎn)生的防衛(wèi)基因表達(dá)來(lái)拮抗,防衛(wèi)基因按功能劃分,主要分為4類[13]:①病程相關(guān)蛋白基因,編碼PR蛋白;②細(xì)胞壁修飾有關(guān)基因,編碼細(xì)胞壁中富含羥脯氨酸的糖蛋白,過(guò)氧化物酶及硫堇等;③清除活性氧(ROS)的防衛(wèi)酶基因,包括超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化物酶(POD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)等;④次生物質(zhì)合成基因,編碼植保素及木質(zhì)素等生物合成所需的酶。不同類別的病程相關(guān)蛋白在炭疽病侵染后表達(dá)情況不同。NB-ARC類抗病基因、NBS-LRR類抗病基因和熱擊蛋白在炭疽菌侵染24 h全部上調(diào)表達(dá),而在11個(gè)病程蛋白中,只有PR5和ACPR10上調(diào)表達(dá)、9個(gè)受體蛋白激酶中,6個(gè)上調(diào)表達(dá),3個(gè)下調(diào)表達(dá)、1個(gè)谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶基因下調(diào)表達(dá),這些結(jié)果表明,病程相關(guān)蛋白僅是山藥抵抗炭疽菌侵染的部分因子,它們與其他諸多因子共同起作用,且在不同程度或種類的抗病品種(系)中他們的生物學(xué)功能也有差異[14]。同樣,6個(gè)細(xì)胞壁修飾蛋白中,阿拉伯半乳聚糖蛋白(AGP19)和鈣調(diào)素結(jié)合蛋白(SHA1)在炭疽菌侵染24 h上調(diào)表達(dá),而導(dǎo)致細(xì)胞壁松弛的擴(kuò)展蛋白(EXLB1)和細(xì)胞壁降解相關(guān)木葡聚糖內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶(XTH22)下調(diào)表達(dá),可阻止細(xì)胞壁的松弛,增強(qiáng)蘇蕷8號(hào)對(duì)炭疽菌的免疫功能。

    正常條件下活性氧(ROS)的產(chǎn)生與清除處于動(dòng)態(tài)平衡,當(dāng)植物在遭受逆境或脅迫時(shí),植物體內(nèi)ROS平衡會(huì)被打破,誘導(dǎo)體內(nèi)積累ROS使植物發(fā)生抗病反應(yīng),過(guò)多的ROS積累會(huì)使膜脂過(guò)氧化而使膜系統(tǒng)受損,對(duì)植物產(chǎn)生傷害[15]。為了維持平衡,一方面植物通過(guò)抗氧化酶系統(tǒng)(SOD、POD、CAT等)將活性氧分解;另一方面依靠抗氧化次生代謝產(chǎn)物,直接將ROS清除,例如抗壞血酸、類胡蘿卜素、谷胱甘肽、多酚和類黃酮等[16]。蘇蕷8號(hào)受炭疽菌侵染后,過(guò)氧化氫酶(CAT2)和線粒體超氧物歧化酶(MSD1)上調(diào)表達(dá),MSD1可以將O2-歧化為 H2O2,CAT2通過(guò)直接將H2O2分解生成無(wú)毒害H2O和O2[17]。

    CYP450s是一種廣譜性生物催化酶,參與多種代謝反應(yīng),如脂肪酸代謝、植物激素的生物合成與降解、次生代謝產(chǎn)物的合成[18]。CYP94A1-like參與葉片角質(zhì)的合成[19]、CYP51編碼甾醇14α-去甲基化酶[20],與甾醇C-24甲基轉(zhuǎn)移酶(BRADI_1g76020v3)共同參與生物甾醇的合成[21],葉片角質(zhì)和作為質(zhì)膜組分的生物甾醇合成相關(guān)基因在蘇蕷8號(hào)的上調(diào)表達(dá)能有效防止病原物侵染植物組織。CYP78A家族成員(CYP78A3、CYP78A5-like)可能成為一類應(yīng)用于作物改良的基因,參與種子和器官的發(fā)育[22],它們上調(diào)表達(dá)是否與抗病有關(guān),尚未見報(bào)道。防御素(SD2)、幾丁質(zhì)結(jié)合凝集素(CBL1)和木菠蘿凝集素(JRL5)基因在蘇蕷8號(hào)的上調(diào)表達(dá),可與真菌細(xì)胞表面的不同單糖,多糖支鏈或異源多糖結(jié)合,從而干擾真菌細(xì)胞壁的合成,抑制其生長(zhǎng)[23-24]。

    植物泛素化系統(tǒng)是在一系列酶的催化作用下,泛素共價(jià)結(jié)合靶標(biāo)蛋白對(duì)其進(jìn)行泛素化修飾,其泛素化靶標(biāo)蛋白可介導(dǎo)抗病信號(hào),甚至一些病原物效應(yīng)蛋白也在其宿主細(xì)胞中起泛素連接酶的作用,并以此來(lái)干擾植物抗病反應(yīng)[25]。在水稻中,E2受稻瘟病菌和植物激素誘導(dǎo)表達(dá),在激素信號(hào)傳導(dǎo)中發(fā)揮重要的作用[26]。同樣,受稻瘟菌侵染時(shí),編碼RING型的E3連接OsBBI1,過(guò)表達(dá)后植株的細(xì)胞壁明顯增厚,而且感染部位的H2O2和酚類化合物大量積累,即OsBBI1參與由細(xì)胞壁介導(dǎo)的水稻抗病機(jī)制[27]。蘇蕷8號(hào)受炭疽菌后,泛素化連接酶(UBE2、UBE3)上調(diào)表達(dá),可能有利于增強(qiáng)蘇蕷8號(hào)的抗性。

    3.3 轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控山藥炭疽病抗性

    轉(zhuǎn)錄因子可作為防御基因表達(dá)中的正或負(fù)調(diào)節(jié)因子,通過(guò)其保守結(jié)構(gòu)域與靶基因啟動(dòng)子上的特異結(jié)構(gòu)特異性結(jié)合,來(lái)實(shí)現(xiàn)抗逆調(diào)控功能[28]。WRKY48參與擬南芥丁香假單胞菌侵染后的防衛(wèi)反應(yīng),過(guò)表達(dá)WRKY48,丁香假單胞菌的生長(zhǎng)的敏感性增強(qiáng)與防御相關(guān)PR基因表達(dá)減少有關(guān),WRKY48負(fù)調(diào)節(jié)PR基因的表達(dá)[29]。棉花GhWRKY48基因?qū)γ藁菸?、黃萎病、水楊酸、茉莉酸均有一定的響應(yīng),GhWRKY48基因正向調(diào)節(jié)棉花抗枯萎病反應(yīng),負(fù)向調(diào)節(jié)棉花對(duì)黃萎病的抗性[30-31],WRKY75正向調(diào)節(jié)茉莉酸鹽介導(dǎo)的植物對(duì)壞死型真菌病原菌的防御[32]。本試驗(yàn)中WRKY48上調(diào)表達(dá),WRKY75下調(diào)表達(dá),可能分別正向和負(fù)向調(diào)控山藥對(duì)炭疽病的響應(yīng)。表明,WRKY家族同一個(gè)基因不僅在不同的作物調(diào)控功能不盡相同,即使在同一作物的調(diào)控功能也不同。棉花中MYB108通過(guò)與鈣離子和鈣調(diào)素樣蛋白GhCML11協(xié)同作用正向調(diào)節(jié)棉花黃萎病響應(yīng)[33]。TIFY10C是水稻中一個(gè)茉莉酸信號(hào)途徑的抑制子,通過(guò)與OsCOI1形成復(fù)合體或與其他蛋白質(zhì)形成異源二聚體抑制茉莉酸信號(hào)途徑,JA處理導(dǎo)致TIFY10C降解,從而對(duì)白葉枯病信號(hào)作出響應(yīng)[34]。蘇蕷8號(hào)下調(diào)表達(dá)MYB108和TIFY10C,可能負(fù)向調(diào)節(jié)山藥對(duì)炭疽病的響應(yīng)。GATA12、HOX11、RSS3、ZFP7、DREB類轉(zhuǎn)錄因子在植物生長(zhǎng)發(fā)育,激素信號(hào)途徑、次生代謝產(chǎn)物合成、抗逆反應(yīng)等方面發(fā)揮重要作用[35-40],在植物病害調(diào)控方面未見相關(guān)報(bào)道。

    3.4 植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與山藥炭疽病抗性

    生長(zhǎng)素信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程涉及了2類轉(zhuǎn)錄因子,一類是生長(zhǎng)素響應(yīng)因子AFR家族,另一類是Aux/IAA轉(zhuǎn)錄因子家族,AFR能和生長(zhǎng)素早期誘導(dǎo)基因如 Aux/IAA,SAUR,GH3等家族的啟動(dòng)子響應(yīng)元件特異結(jié)合形成二聚體,激活或者抑制基因表達(dá)。當(dāng)生長(zhǎng)素濃度較高時(shí),生長(zhǎng)素與泛素連接酶復(fù)合體SCFTIR1結(jié)合后,會(huì)促使Aux/IAA抑制因子的泛素化與降解,產(chǎn)生眾多ARF蛋白并激活生長(zhǎng)素信號(hào)途徑[41]。病原菌侵染導(dǎo)致生長(zhǎng)素水平失衡,進(jìn)而改變其信號(hào)途徑相關(guān)基因的表達(dá)。水稻GH3-2過(guò)量表達(dá)后能增強(qiáng)水稻對(duì)白葉枯病菌、細(xì)菌性條斑病菌和稻瘟病的抗性[42]。擬南芥生長(zhǎng)素信號(hào)缺失突變體axr2(Auxin resistant 2) 對(duì)丁香假單胞桿菌的抗性增強(qiáng),表明生長(zhǎng)素信號(hào)途徑不利于擬南芥對(duì)丁香假單胞桿菌的免疫反應(yīng)[43]。本研究中,LAX4、IAA4、IAA21、SAUR36、SAUR71在炭疽菌侵染24 h均上調(diào)表達(dá),且LAX4和IAA21在抗病品種表達(dá)量顯著高于感病品種,推測(cè)生長(zhǎng)素信號(hào)途徑有利于山藥對(duì)炭疽病的免疫反應(yīng)。

    茉莉酸信號(hào)途徑中茉莉酸合成關(guān)鍵酶基因OPR1和脫落酸合成關(guān)鍵酶基因NCED上調(diào)表達(dá),有利于增強(qiáng)蘇蕷8號(hào)炭疽病抗性。JA在馬鈴薯晚疫病菌侵染期間,會(huì)識(shí)別Pep-13致病因子,激活茉莉酸信號(hào)途徑,誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生、PR基因的表達(dá)及細(xì)胞超敏死亡,增強(qiáng)對(duì)馬鈴薯晚疫病的抗性[44]。ABA可以破壞煙草中由水楊酸介導(dǎo)的對(duì)煙草花葉病毒(TMV)和葉斑病的抵抗[45],亦可控制植物氣孔關(guān)閉,促進(jìn)胼胝質(zhì)沉積阻止病菌侵染,正向調(diào)控植物的抗病性[46]。油桐在尖孢鐮孢菌侵染后,VmAP2/ERF036和其同源基因VfAP2/ERF036表現(xiàn)出相反的表達(dá)模式,VmAP2/ERF036的表達(dá)受到抑制,表明二者的抗病調(diào)節(jié)模式不同[47]。ERF036在蘇蕷8號(hào)下調(diào)表達(dá),可能負(fù)向調(diào)控山藥炭疽菌的侵染。GASA(Gibberellic Acid-stimulated Arabidopsis)蛋白是一類CRP蛋白,大多數(shù)成員受赤霉素調(diào)控。目前只在馬鈴薯、辣椒和法國(guó)菜豆中發(fā)現(xiàn)GASA蛋白參與植物防御反應(yīng)[48-50]。但已有證據(jù)表明,GASA蛋白可通過(guò)促進(jìn)水楊酸SA合成基因的表達(dá)和植物體內(nèi)SA的水平來(lái)抵抗非生物脅迫[51]。本研究中GASA14在炭疽菌侵染24 h上調(diào)表達(dá),GASA2下調(diào)表達(dá),它們?nèi)绾螀⑴c蘇蕷8號(hào)抗病性還需要進(jìn)一步研究。

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