lncRNA Gm4419靶向miR-204-5p調(diào)控LPS誘導的心肌細胞損傷機制

陳豫賢 于淑君 姜正明 代聚平 裴曉寧

(1南陽醫(yī)學高等專科學校第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科一病區(qū)，河南 南陽 473000；2鄭州大學第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科五病區(qū))

心肌梗死(MI)的發(fā)病率和死亡率逐漸升高，全球每年有超過700萬人經(jīng)歷MI，死亡率大約10%，20%的存活患者可能在發(fā)病的第1年發(fā)生第2次心血管事件〔1〕。研究MI引起的心肌細胞損傷的機制，對MI的治療具有重要意義。研究表明，非編碼RNA包括miRNA、lncRNA和circRNA在心血管疾病特別是MI的病理生理過程中具有重要作用，調(diào)節(jié)心肌細胞凋亡、炎癥、血管生成和纖維化等過程〔2〕。有報道顯示，lncRNA Gm4419在氧糖剝奪/復氧(OGD/R)誘導的小膠質(zhì)細胞〔3〕、創(chuàng)傷性星形膠質(zhì)細胞損傷〔4〕和高糖誘導的系膜細胞〔5〕中表達上調(diào)，與細胞損傷、凋亡、炎癥因子的表達有關。lncRNA Gm4419在MI中的作用尚不清楚。miR-204-5p在促炎因子刺激的腎小管上皮細胞〔6〕、腦缺血大鼠模型和OGD誘導的腦微心肌細胞〔7〕、腎缺血再灌注損傷大鼠的腎組織〔8〕中下調(diào)表達，與炎癥因子釋放有關?；谝陨涎芯拷Y(jié)論和預測結(jié)果，本研究假設，在脂多糖(LPS)誘導的心肌細胞損傷中l(wèi)ncRNA Gm4419可靶向調(diào)控miR-204-5p的表達影響LPS誘導的心肌細胞損傷，通過建立心肌細胞H9C2的LPS損傷模型，對假設進行驗證，以期為心肌損傷修復提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1材料 大鼠心肌細胞H9C2購自北京北納生物；胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司，胰蛋白酶、LPS購自Sigma-Aldrich公司；Total RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、qRT-聚合酶鏈反應(PCR)試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司；Lipofectamine 2000試劑盒購自美國Invitrogen公司；丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；雙熒光素酶報告系統(tǒng)購自美國Promega公司；B細胞淋巴瘤(Bcl)-2抗體、Bcl-2相關X蛋白(Bax)抗體、酶切-含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)-3抗體和抗GAPDH抗體購自英國Abcam公司；雙染色流式法細胞凋亡檢測試劑盒購自BD公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；流式細胞儀購自BD公司，實時熒光(PCR)儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 將H9C2細胞培養(yǎng)于含有10 %胎牛血清、100 U/ml青霉素和10 mg/L 鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件：飽和濕度、37℃ 5%CO2恒溫密閉培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。隔天換培養(yǎng)液，當細胞生長至對數(shù)生長期，1∶3消化傳代。

1.2.2細胞LPS模型構(gòu)建 根據(jù)劉丹〔9〕建模方法構(gòu)建MI體外細胞模型，以10 mg/L LPS處理H9C2細胞6 h，記為LPS組，H9C2細胞以正常DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，記為Con組。

1.2.3實驗分組與處理根據(jù)Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明，在H9C2細胞中分別轉(zhuǎn)染si-Gm4419、si-NC、miR-204-5p、miR-NC、si-Gm4419+anti-miR-204-5p、si-Gm4419+anti-miR-NC，上述處理轉(zhuǎn)染48 h后分別進行LPS模型建立，分別記為LPS+si-Gm4419組、LPS+si-NC組、LPS+miR-204-5p組、LPS+miR-NC組、LPS+si-Gm4419+anti-miR-204-5p組、LPS+si-Gm4419+anti-miR-NC組。處理結(jié)束后，進行各項指標檢測。

后續(xù)lncRNA Gm4419與miR-204-5p靶向關系分析時，H9C2細胞分別轉(zhuǎn)染miR-NC+野生型(WT)-Gm4419，miR-NC+突變型(MUT)-Gm4419，均記為miR-NC組；miR-204-5p+WT-Gm4419，miR-204-5p+MUT-Gm4419，均記為miR-204-5p組。另外H9C2細胞轉(zhuǎn)染si-Gm4419、si-NC、pcDNA-Gm4419、pcDNA，分別記為si-Gm4419組、si-NC組、pcDNA-Gm4419組、pcDNA組，轉(zhuǎn)染48 h后檢測miR-204-5p表達。

1.2.4實時熒光PCR檢測RNA的表達 Total RNA提取試劑盒提取各組細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，lncRNA Gm4419和miR-204-5p mRNA。lncRNA Gm4419上游引物：5'-GGAACCAAGCAGACCGAAGAC-3'， 下游引物：5'-CCCCAACCCACAGG-AACATAA-3'；miR-204-5p上游引物：5'-TTCCCTTTGTCATCCTATGCCT-3'， 下游引物：5'-TGGTGTCGTGGAGTCG-3'；用2-ΔΔCt法進行數(shù)據(jù)分析。

1.2.5流式細胞術(shù)測定細胞凋亡率 將各組H9C2細胞接種于6孔板中(5×105個細胞/孔)，培養(yǎng)24 h，收集并洗滌細胞2次，將細胞稀釋為1×105個/ml，取300 μl 1×結(jié)合緩沖液重懸細胞，然后加入5 μl Annexin V-FITC和 10 μl碘化丙啶，室溫避光15 min，再加入200 μl 1×結(jié)合緩沖液，上流式細胞儀分析細胞凋亡率。

1.2.6檢測細胞中MDA、SOD和GSH-Px的含量 收集各組H9C2細胞，超聲破碎細胞，取細胞破碎上清，按照MDA、SOD和GSH-Px試劑盒說明書操作，檢測細胞內(nèi)MDA、SOD和GSH-Px的含量。

1.2.7雙熒光素酶報告系統(tǒng)實驗 將構(gòu)建的含有l(wèi)ncRNA Gm4419與miR-204-5p預測結(jié)合位點的野生型(WT-Gm4419)和突變型(MUT-Gm4419)雙熒光素酶報告載體，分別與miR-NC或miR-204-5p共轉(zhuǎn)染H9C2細胞。轉(zhuǎn)染48 h，裂解細胞30 min，并離心收集上清，檢測螢火蟲相對熒光素酶活性。

1.2.8Western印跡檢測凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2和酶切caspase3 提取各組H9C2細胞總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉(zhuǎn)聚偏氟乙烯(PVDF)膜，室溫封閉2 h，加入一抗(Bcl-2抗體1∶2 000，Bax抗體 1∶2 000，酶切caspase3抗體 1∶1 000，GAPDH抗體1∶5 000)，4℃過夜孵育，洗膜3次，加入稀釋的酶標二抗，室溫孵育2 h，顯影拍照，分析蛋白灰度。

1.3統(tǒng)計學處理 采用SPSS19.0軟件進行獨立樣本t檢驗、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1lncRNA Gm4419和miR-204-5p在LPS誘導的心肌細胞損傷中的表達 采用10 mg/L LPS處理H9C2 6 h，與Con組心肌細胞H9C2中miR-204-5p水平(1.01±0.07)相比，LPS組(0.44±0.04)顯著降低(P<0.05)。

2.2干擾lncRNA Gm4419表達對LPS誘導的心肌細胞氧化應激的影響 與Con組相比，LPS組H9C2細胞中l(wèi)ncRNA Gm4419含量顯著升高(P<0.05)，MDA含量顯著升高(P<0.05)，SOD和GSH-Px活性顯著降低(P<0.05)；干擾lncRNA Gm4419的H9C2細胞LPS誘導后結(jié)果相反，見表1。說明LPS可促進lncRNA Gm4419表達并促進H9C2產(chǎn)生氧化應激損傷；干擾lncRNA Gm4419可減輕LPS誘導的H9C2細胞損傷，提高細胞的抗氧化應激能力。

2.3干擾lncRNA Gm4419表達對LPS誘導的心肌細胞凋亡的影響 與Con組相比，LPS誘導的H9C2細胞凋亡率、凋亡蛋白Bax和酶切caspase-3表達顯著升高(P<0.05)，抗凋亡蛋白Bcl-2表達顯著降低(P<0.05)，；干擾lncRNA Gm4419表達組H9C2經(jīng)LPS誘導后結(jié)果相反，見表1，圖1及圖2。說明干擾lncRNA Gm4419可抑制LPS誘導的H9C2細胞凋亡。

表1 干擾lncRNA Gm4419表達對LPS誘導的H9C2細胞氧化應激、凋亡及細胞損傷的影響

圖1 干擾lncRNA Gm4419表達對LPS誘導的心肌細胞H9C2凋亡的影響

1～4：Con組,LPS組，LPS+si-NC組，LPS+si-Gm4419組圖2 凋亡相關蛋白表達

2.4miR-204-5p過表達對LPS誘導的心肌細胞損傷的影響 與Con組相比，LPS誘導的H9C2細胞中MDA含量表達量顯著升高(P<0.05)，SOD活性、GSH-Px活性顯著降低(P<0.05)；而miR-204-5p過表達則結(jié)果相反，見表2，圖3，圖4。說明過表達miR-204-5p可減輕LPS誘導的H9C2細胞損傷并抑制細胞凋亡。

表2 miR-204-5p過表達對LPS誘導的心肌細胞損傷的影響

1，2：LPS+miR-NC組，LPS+miR-204-5p組圖3 凋亡相關蛋白表達

圖4 細胞凋亡流式圖

2.5lncRNA Gm4419靶向調(diào)控miR-204-5p的表達 通過LncBase Predicted v.2預測發(fā)現(xiàn)，lncRNA Gm4419的序列中含有與miR-204-5p互補的序列，見圖5。雙熒光素酶報告系統(tǒng)結(jié)果顯示，過表達miR-204-5p可顯著下調(diào)野生型WT-Gm4419組細胞中螢火蟲熒光素酶相對活性(P<0.05)，見表3。pcDNA組miR-204-5p水平(1.00±0.09)顯著高于pcDNA-Gm4419(0.56±0.05)；si-NC組miR-204-5p水平(1.01±0.08)顯著低于si-Gm4419組(2.37±0.24，均P<0.05)

圖5 lncRNA Gm4419序列中含有與miR-204-5p互補的核苷酸序列

表3 雙熒光素酶報告實驗

2.6抑制miR-204-5p表達逆轉(zhuǎn)了干擾lncRNA Gm4419表達對LPS誘導的心肌細胞損傷的作用 與LPS+si-Gm4419+anti-miR-NC組相比，LPS+si-Gm4419+anti-miR-204-5p組miR-204-5p、SOD、GSH-Px、Bcl-2水平均顯著下降，而MDA、凋亡率、Bax及酶切caspase-3水平均顯著上升(均P<0.05)。見圖6、圖7、表4。

1，2：LPS+si-Gm4419+anti-miR-NC組,LPS+si-Gm4419+anti-miR-204-5p組圖6 Western印跡檢測各組Bcl-2、Bax及酶切caspase-3水平

圖7 抑制miR-204-5p表達逆轉(zhuǎn)了干擾lncRNA Gm4419表達對LPS誘導的心肌細胞凋亡的作用

表4 抑制miR-204-5p表達逆轉(zhuǎn)了干擾lncRNA Gm4419表達對LPS誘導的H9C2細胞損傷的作用

3 討 論

LPS是革蘭陰性菌細胞壁的重要組成，可引起炎癥反應，高劑量的LPS可導致心臟功能障礙和心肌損傷，誘導心肌細胞產(chǎn)生炎癥〔10〕。研究表明，lnc RNA在調(diào)節(jié)心血管正常生理狀態(tài)和疾病狀態(tài)中發(fā)揮重要作用，lncRNA Novlnc6與急性AMI有關，lncRNA Mhrt與心力衰竭有關，MALAT1和Tie-1-AS可以調(diào)節(jié)血管的生長和功能，還有一些lncRNA與心肌細胞的肥大、線粒體功能和凋亡有關〔11〕。有研究表明，lncRNA Gm4419在高糖誘導的系膜細胞中表達上調(diào)，可能通過核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB信號通路調(diào)控系膜細胞中炎癥因子的表達〔12〕。還有報道表明，lncRNA Gm4419在OGD/R誘導的小膠質(zhì)細胞損傷〔3〕中和創(chuàng)傷性星形膠質(zhì)細胞損傷〔4〕中高表達，與細胞損傷和凋亡相關。本研究結(jié)果說明lncRNA Gm4419在H9C2氧化損傷中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。miR-204-5p與肝細胞癌進展〔13〕、黑色素瘤的耐藥〔14〕及乳腺癌細胞的EMT進展〔15〕有關。miR-204-5p通過靶向MEF2C和ERRγ抑制成肌細胞分化〔16〕。miR-204-5p在骨關節(jié)炎(OA)軟骨細胞中表達下調(diào)，其高表達可促進了軟骨細胞Ⅱ型和Ⅳ型膠原的表達，抑制軟骨細胞的增殖〔17〕。研究還發(fā)現(xiàn)，miR-204-5p在大鼠大腦中動脈閉塞(MCAO)腦缺血模型大鼠腦組織中表達下降，長非編碼RNA MI相關轉(zhuǎn)錄本(MIAT)可靶向miR-204-5p調(diào)控高遷移率族蛋白(HMG)B1表達，減輕腦缺血后腦微血管內(nèi)皮細胞(CMEC)損傷〔7〕。在小鼠心肌缺血再灌注(IR)損傷中，miR-204-5p通過KCNQ1OT1/miR-204-5p/LGALS3軸調(diào)控小鼠心肌IR損傷〔18〕。本研究結(jié)果說明miR-204-5p在心肌細胞損傷中發(fā)揮作用。