lncRNA SLC8A1-AS1在膿毒癥大鼠心肌組織中的表達(dá)及其對心肌細(xì)胞凋亡和炎癥因子分泌的影響

劉楓 張韓 李彥明 王勇 魯雪麗

(河南大學(xué)淮河醫(yī)院 1重癥醫(yī)學(xué)科，河南 開封 475000;2心血管內(nèi)科)

ExpressionoflncRNASLC8A1-AS1inmyocardialtissueofsepsisratsanditseffectonmyocardialcellapoptosisandsecretionofinflammatoryfactors

LIUFeng,ZHANGHan,LIYan-Ming,etal.

DepartmentofCriticalCareMedicine,HuaiheHospitalofHenanUniversity,Kaifeng475000,Henan,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the expression of lncRNA SLC8A1-AS1 in myocardial tissue of sepsis rats and its effect on myocardial cell apoptosis and secretion of inflammatory factors.MethodsqRT-PCR method was used to detect the expression level of SLC8A1-AS1 in myocardial tissue of sepsis rats. Cardiac H9C2 cells were divided into Control group,LPS group(LPS was used to induce treatment),Vector+LPS group(negative control vector was transfected,LPS was used to induce treatment),SLC8A1-AS1+LPS group(SLC8A1-AS1 overexpression vector was transfected,LPS was used to induce treatment),SLC8A1-AS1+LPS+PMA group(transfected with SLC8A1-AS1 overexpression vector,NF-κB signal activator and LPS induction treatment).Cell proliferation was detected by MTT colorimetry,cell apoptosis was detected by flow cytometry,the levels of IL-1β,IL-6 and TNF-α secreted by cells were detected by ELISA,the expression of C-Caspase-3 and p65 protein in cells level changes were detected by Western blot.ResultsThe expression level of SLC8A1-AS1 in myocardium of sepsis rats was significantly decreased(P<0.05). Compared with the Control group,the proliferation activity of cardiomyocytes in the LPS group was significantly decreased,the apoptosis rate was significantly increased,the secretion of IL-1β,IL-6 and TNF-α were significantly increased,and the expression of C-Caspase-3 and p65 proteins in the cells were significantly increased(P<0.05).Compared with the Vector+LPS group,the proliferation activity of cardiomyocytes in the SLC8A1-AS1+LPS group was significantly increased,the apoptosis rate was significantly decreased,the secretion of IL-1β,IL-6 and TNF-α were significantly decreased,and the expression of C-Caspase-3 and p65 proteins in the cells were significantly decreased(P<0.05).Compared with the SLC8A1-AS1+LPS group,the proliferation activity of cardiomyocytes in the SLC8A1-AS1+LPS+PMA group was significantly decreased,the apoptosis rate was significantly increased,the secretion of IL-1β,IL-6 and TNF-α were significantly increased,and the expression of C-Caspase-3 and p65 proteins in the cells were significantly increased(P<0.05).ConclusionsThe expression of SLC8A1-AS1 is decreased in myocardial tissue of sepsis rats,up-regulation of SLC8A1-AS1 could reduce cardiomyocyte apoptosis and secrete inflammatory factors by inhibiting NF-κB signaling.

【Keywords】 Sepsis;Cardiomyocytes;SLC8A1-AS1;Inflammation;Apoptosis

膿毒癥是由于微循環(huán)障礙、細(xì)胞凋亡等多種原因引起的全身多個臟器功能異常的疾病，凝血異常、心血管反應(yīng)失調(diào)、內(nèi)皮功能障礙是膿毒癥的常見特征，心臟是膿毒癥最常見的受損器官之一，約有一半的膿毒癥患者伴有心肌損傷〔1〕。脂多糖(LPS)是常見的體外誘導(dǎo)膿毒癥心肌細(xì)胞損傷的誘導(dǎo)因子，心肌細(xì)胞分泌炎癥因子和過度凋亡是膿毒癥心肌損傷發(fā)生的關(guān)鍵機(jī)制〔2〕。lncRNA是長度超過200 nt的長鏈非編碼RNA，其通過RNA的形式調(diào)控多個生理活動，如細(xì)胞凋亡、新陳代謝、血管再生、心臟老化、胚胎發(fā)育等〔3〕。研究報道表明，lncRNA與缺氧復(fù)氧心肌損傷、膿毒癥心肌損傷、糖尿病心肌病等心臟疾病有關(guān)〔4〕。研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA SLC8A1-AS1在心肌梗死中表達(dá)下調(diào)，而上調(diào)SLC8A1-AS1改善心臟功能，減少炎癥因子釋放，縮小心肌梗死面積，SLC8A1-AS1可能是心肌損傷的保護(hù)因子〔5〕。現(xiàn)階段對SLC8A1-AS1在膿毒癥心肌細(xì)胞損傷中的作用尚不清楚。本實驗首先檢測了膿毒癥大鼠心肌組織中SLC8A1-AS1表達(dá)水平，并以LPS誘導(dǎo)體外構(gòu)建膿毒癥心肌細(xì)胞模型，探討SLC8A1-AS1在膿毒癥心肌細(xì)胞炎癥因子分泌和細(xì)胞凋亡中的作用，為靶向分子治療膿毒癥心肌損傷提供方向。

1 材料與方法

1.1材料 清潔級SD大鼠購自鄭州大學(xué)實驗動物中心，體重180～200 g，雌雄各半。大鼠心肌H9C2細(xì)胞購自深圳市拓普生物科技有限公司；腫瘤壞死因子(TNF)-α含量檢測試劑盒購自深圳市科潤達(dá)生物工程有限公司；酶切含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-3抗體購自北京百奧萊博科技有限公司；白細(xì)胞介素(IL)-6含量檢測試劑盒購自武漢艾美捷科技有限公司；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自大連TaKaRa；IL-1β含量檢測試劑盒購自上海研謹(jǐn)生物科技有限公司；p65抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology；陰性對照表達(dá)載體(pcDNA)、SLC8A1-AS1過表達(dá)載體(pcDNA-SLC8A1-AS1)均由武漢金開瑞生物工程有限公司構(gòu)建。

1.2膿毒癥心肌損傷大鼠模型構(gòu)建 Model組大鼠按照下述方法構(gòu)建模型〔6〕：用10%水合氯醛麻醉大鼠，將大鼠仰臥置于操作臺上，消毒，于大鼠的前腹部中線行3 cm剖腹手術(shù)，將腹腔打開，分離盲腸，以3.0無菌絲線結(jié)扎盲腸，并用16號針頭將結(jié)扎位置對穿2次，擠壓盲腸，觀察穿孔位置出現(xiàn)少量糞便時，將盲腸返回，縫合，關(guān)腹，將切口消毒。Normal組大鼠不做穿刺，其余同Model組。最后每組剩余9只。各組大鼠在造模后24 h，再次以水合氯醛麻醉，處死，打開胸腔，留取心肌組織。

1.3qRT-聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測膿毒癥大鼠心肌組織中SLC8A1-AS1表達(dá) 利用Trizol試劑分別提取心肌組織中的總RNA，以RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得第1條cDNA，反轉(zhuǎn)錄體系如下：1 μl的總RNA、1 μl的5×gDNA Eraser Buffer、1 μl的gDNA Eraser、6 μl的無RNA酶水，放在42℃孵育2 min。繼續(xù)在上述體系中添加4 μl的5×PrimerScript Buffer、1 μl的RT Primer mix、1 μl的PrimerScript RT Enzyme mixI、10 μl的Reaction mix before，最后添加RNase free dH2O至20 μl，放在37℃孵育15 min，放在85℃孵育5 s，置于4℃保存。取cDNA，配制如下體系：2 μl的上游和下游引物、5 μl的cDNA模板、0.4 μl的DYE II、10 μl的2×SYBR RT-PCR mix，最后添加ddH2O至20 μl。置于PCR儀中，設(shè)置程序為：95℃ 30 s(預(yù)變性)，95℃ 5 s(變性)，60℃退火延伸，循環(huán)40次。結(jié)果以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為參照，以2-△△Ct法計算SLC8A1-AS1表達(dá)水平。

1.4細(xì)胞轉(zhuǎn)染和分組 心肌H9C2細(xì)胞分為以下4組：(1)Control組：正常培養(yǎng)；(2)LPS組：在實驗0 h時用10 μg/ml的LPS處理培養(yǎng)；(3)Vector+LPS組：在實驗前12 h，在細(xì)胞中轉(zhuǎn)染陰性對照表達(dá)載體，然后在實驗0 h時，用10 μg/ml的LPS處理培養(yǎng)；(4)SLC8A1-AS1+LPS組：在實驗前12 h，在細(xì)胞中轉(zhuǎn)染SLC8A1-AS1過表達(dá)載體，然后在實驗0 h時，用10 μg/ml的LPS處理培養(yǎng)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行。取培養(yǎng)12 h以后的各組細(xì)胞，按1.3方法檢測SLC8A1-AS1表達(dá)變化。

1.5方法

1.5.1四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)比色法檢測細(xì)胞增殖 將心肌細(xì)胞按1.4分組方法接種到96孔板中，每個孔內(nèi)接種104個細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)12 h后，在每孔中添加10 μl的MTT溶液，繼續(xù)放在37℃孵育4 h。將上清溶液棄掉，加入100 μl的二甲基亞砜溶液，在37℃孵育10 min。檢測490 nm的OD值。計算細(xì)胞存活率。

1.5.2流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 收集培養(yǎng)12 h后各組細(xì)胞，將細(xì)胞用磷酸鹽緩沖液(PBS)反復(fù)洗滌2次。用PBS將細(xì)胞密度調(diào)整為1×106個細(xì)胞/ml。取1 ml的細(xì)胞懸浮液，1 000 r/min離心10 min，將上清棄掉，PBS洗滌1次，添加300 μl的結(jié)合緩沖液，添加5 μl的Annexin V-FITC，于室溫結(jié)合20 min，繼續(xù)加入5 μl的碘化丙啶(PI)，在室溫反應(yīng)20 min。添加200 μl的結(jié)合緩沖液，用流式細(xì)胞儀檢測。

1.5.3酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測IL-1β、IL-6、TNF-α水平 收集培養(yǎng)12 h后各組細(xì)胞培養(yǎng)液上清，分別用ELISA檢測培養(yǎng)液上清中IL-1β、IL-6、TNF-α含量，步驟完全按照IL-1β含量檢測試劑盒、IL-6含量檢測試劑盒、TNF-α含量檢測試劑盒的說明書進(jìn)行。

1.5.4Western印跡檢測酶切Caspase-3、p65蛋白表達(dá)變化 培養(yǎng)12 h后各組細(xì)胞中添加放射免疫沉淀試驗(RIPA)裂解液，放在冰上充分裂解20 min，15 000 r/min離心10 min，吸取上清溶液轉(zhuǎn)移至新的EP管中，放在-80℃保存。根據(jù)二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度檢測試劑盒測定蛋白含量。根據(jù)常規(guī)方法制備10%分離膠和5%濃縮膠。在蛋白樣品中添加1/5體積的6×上樣緩沖液，放在100℃孵育10 min。每個孔內(nèi)添加40 μg的蛋白樣品。在濃縮膠中采用70 V的電壓電泳，30 min后，肉眼可見藍(lán)色染料進(jìn)入到分離膠，此時將電壓調(diào)整為100 V繼續(xù)電泳，觀察藍(lán)色染料進(jìn)入到分離膠的底部后，停止電泳。將聚偏氟乙烯(PVDF)膜放在甲醇中浸泡1 min。設(shè)置100 V的電壓電泳2 h。將PVDF膜放在5%牛血清白蛋白溶液中，于室溫結(jié)合1 h。將PVDF膜放在一抗溶液中，在4℃孵育過夜。PVDF膜放在二抗溶液中，在室溫結(jié)合1 h。按照電化學(xué)發(fā)光(ECL)。用Image J分析條帶的灰度值。內(nèi)參為GAPDH，以灰度值計算目的蛋白相對表達(dá)變化。二抗按照1：2 000稀釋，酶切Caspase-3、p65一抗按照1∶800稀釋。

1.5.5核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB信號激活劑佛波酯(PMA)對SLC8A1-AS1影響心肌細(xì)胞的作用檢測 取轉(zhuǎn)染SLC8A1-AS1過表達(dá)載體的心肌細(xì)胞，用10 μg/ml的LPS和1 μmol/L的NF-κB信號激活劑PMA處理培養(yǎng)，記為SLC8A1-AS1+LPS+PMA組，以SLC8A1-AS1+LPS組為參照，用1.5.1方法檢測細(xì)胞增殖，1.5.2方法檢測細(xì)胞凋亡變化，1.5.3方法檢測細(xì)胞分泌的IL-1β、IL-6、TNF-α水平，1.5.4方法檢測細(xì)胞中酶切Caspase-3、p65蛋白表達(dá)變化。

1.6統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行t檢驗、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1SLC8A1-AS1在膿毒癥大鼠心肌組織中表達(dá)下調(diào) Model組大鼠心肌組織中SLC8A1-AS1表達(dá)水平(0.51±0.05)顯著低于Normal組(1.00±0.12，t=11.308，P<0.001)。表明SLC8A1-AS1在膿毒癥大鼠心肌組織中表達(dá)下調(diào)。

2.2SLC8A1-AS1過表達(dá)載體上調(diào)膿毒癥心肌細(xì)胞模型中SLC8A1-AS1表達(dá)水平 與Control組心肌細(xì)胞中SLC8A1-AS1表達(dá)水平(1.00±0.10)相比，LPS組(0.42±0.06)顯著降低(P<0.05)。與Vector+LPS組心肌細(xì)胞中SLC8A1-AS1表達(dá)水平(0.43±0.05)相比，SLC8Al-AS1+LPS組(1.25±0.13)顯著升高(P<0.05)。表明膿毒癥心肌細(xì)胞模型中SLC8A1-AS1表達(dá)下調(diào)，而SLC8A1-AS1過表達(dá)載體明顯上調(diào)膿毒癥心肌細(xì)胞模型中SLC8A1-AS1表達(dá)水平。

2.3上調(diào)SLC8A1-AS1對膿毒癥心肌細(xì)胞模型細(xì)胞增殖活性和凋亡影響 與Control組比較，LPS組心肌細(xì)胞存活率顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著升高，酶切Caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。與Vector+LPS組比較，SLC8A1-AS1+LPS組心肌細(xì)胞存活率顯著升高，細(xì)胞凋亡率顯著降低，酶切Caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。見圖1、圖2、表1。表明膿毒癥心肌細(xì)胞模型細(xì)胞增殖活性降低，細(xì)胞凋亡增多，而上調(diào)SLC8A1-AS1明顯提高膿毒癥心肌細(xì)胞模型細(xì)胞增殖活性，減少細(xì)胞凋亡。

1～4:Control組,LPS組,Vector+LPS組,SLC8A1-AS1+LPS組，圖3同圖1 Western印跡檢測酶切Caspase-3蛋白表達(dá)

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡變化

2.4上調(diào)SLC8A1-AS1對膿毒癥心肌細(xì)胞模型炎癥因子分泌影響 與Control組比較，LPS組心肌細(xì)胞分泌的IL-1β、IL-6、TNF-α水平顯著升高(P<0.05)。與Vector+LPS組比較，SLC8A1-AS1+LPS組心肌細(xì)胞分泌的IL-1β、IL-6、TNF-α水平顯著降低(P<0.05)。見表1。表明膿毒癥心肌細(xì)胞模型細(xì)胞分泌炎癥因子增多，而上調(diào)SLC8A1-AS1明顯抑制膿毒癥心肌細(xì)胞模型分泌炎癥因子。

表1 上調(diào)SLC8A1-AS1后膿毒癥心肌細(xì)胞模型存活率、凋亡率和酶切Caspase-3蛋白、IL-1β、IL-6、TNF-α水平

2.5上調(diào)SLC8A1-AS1對膿毒癥心肌細(xì)胞模型NF-κB信號影響 與Control組心肌細(xì)胞中p65蛋白表達(dá)水平(0.20±0.15)相比，LPS組(0.76±0.07)顯著升高(P<0.05)。與Vector+LPS組心肌細(xì)胞中p65蛋白表達(dá)水平(0.75±0.05)相比，SLC8A1-AS1+LPS組(0.41±0.04)顯著降低(P<0.05)。見圖3。表明膿毒癥心肌細(xì)胞模型NF-κB信號被激活，而上調(diào)SLC8A1-AS1明顯抑制膿毒癥心肌細(xì)胞模型NF-κB信號激活水平。

2.6NF-κB信號激活劑對上調(diào)SLC8A1-AS1影響膿毒癥心肌細(xì)胞模型增殖、凋亡和炎癥因子分泌的作用 與SLC8A1-AS1+LPS組比較，SLC8A1-AS1+LPS+PMA組心肌細(xì)胞中p65蛋白表達(dá)水平顯著升高，細(xì)胞存活率顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著升高，細(xì)胞中酶切Caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著升高，細(xì)胞分泌的IL-1β、IL-6、TNF-α水平顯著升高(P<0.05)。見圖4，表2，圖5。表明NF-κB信號激活劑逆轉(zhuǎn)上調(diào)SLC8A1-AS1影響膿毒癥心肌細(xì)胞模型增殖、凋亡和炎癥因子分泌的作用。

圖3 Western印跡檢測上調(diào)SLC8A1-AS1對膿毒癥心肌細(xì)胞模型中p65蛋白表達(dá)影響

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

表2 NF-κB信號激活劑處理前后上調(diào)SLC8A1-AS1的膿毒癥心肌細(xì)胞模型存活率、凋亡率及細(xì)胞中p65、酶切Caspase-3蛋白水平和細(xì)胞分泌的IL-1β、IL-6、TNF-α水平

1～2：SLC8A1-AS1+LPS組、SLC8A1-AS1+LPS+PMA組圖5 Western印跡檢測p65、酶切Caspase-3蛋白表達(dá)

3 討 論

lncRNA與細(xì)胞生長、細(xì)胞凋亡、炎癥等有關(guān)〔7〕。研究證實，lncRNA調(diào)控人類疾病進(jìn)展，并且lncRNA有望成為疾病治療的分子靶點(diǎn)〔8〕。心肌損傷是造成心臟功能異常的關(guān)鍵，其也受到lncRNA的調(diào)控作用〔9〕。有研究顯示，SLC8A1-AS1在心肌梗死動物模型中表達(dá)下調(diào)，而上調(diào)SLC8A1-AS1能減輕心肌損傷，減少梗死面積，抑制炎癥〔5〕。

膿毒癥是一種全身系統(tǒng)疾病，其死亡率和發(fā)病率均極高，心功能障礙、心肌抑制等是膿毒癥患者常見的并發(fā)癥，心肌損傷也是誘導(dǎo)多個器官衰竭的關(guān)鍵因素〔10〕。研究顯示，膿毒癥心肌細(xì)胞釋放大量的炎癥因子如IL-1β、IL-6、TNF-α，這些炎癥因子一方面可加重炎癥反應(yīng)，促進(jìn)炎癥損傷，另一方面還可激活細(xì)胞凋亡，促進(jìn)心功能損傷〔11，12〕。細(xì)胞凋亡是一個極為復(fù)雜的過程，其中Caspase蛋白家族廣泛參與細(xì)胞凋亡調(diào)控過程，Caspase蛋白家族成員較多，在正常情況下以沒有活性的酶原形式存在，只有被活化后才可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生〔13～15〕。Caspase-3是Caspase凋亡反應(yīng)中下游因子，酶切Caspase-3能不可逆激活細(xì)胞凋亡〔16，17〕。本研究結(jié)果表明，LPS誘導(dǎo)的體外膿毒癥心肌細(xì)胞模型凋亡率增加，細(xì)胞中酶切Caspase-3蛋白表達(dá)減少，細(xì)胞分泌的IL-1β、IL-6、TNF-α增多，而上調(diào)SLC8A1-AS1能減弱LPS對心肌細(xì)胞的上述作用，說明SLC8A1-AS1有抑制體外膿毒癥心肌細(xì)胞模型凋亡和炎癥因子釋放的作用。

lncRNA發(fā)揮作用的機(jī)制較為復(fù)雜，目前尚未完全闡明，其可通過作用于下游基因或信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)而發(fā)揮多重生物學(xué)功能〔18～20〕。NF-κB作用復(fù)雜，具有多向轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用，在哺乳動物體內(nèi)廣泛存在，參與免疫反應(yīng)、腫瘤生長、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等多個過程〔21〕。NF-κB家族龐大，其中p65是NF-κB信號發(fā)揮作用的關(guān)鍵亞單位〔22〕。研究顯示，NF-κB過度激活加重心肌細(xì)胞損傷，而抑制NF-κB信號能夠減弱心肌損傷〔23，24〕。