健脾清熱通絡法改善RA濕熱痹阻證患者circRNA0003353及免疫炎癥、骨代謝指標影響的回顧性數(shù)據(jù)挖掘研究*

王杰，劉健，文建庭，王馨

安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院 安徽合肥 230031

類風濕關節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以對稱性多關節(jié)炎為主要臨床表現(xiàn)的自身免疫性疾病[1]，以關節(jié)滑膜慢性炎癥、關節(jié)的進行性破壞為特征，最終影響患者生活質(zhì)量和社會功能[2-3]。滑膜成纖維細胞（fibroblast-like synoviocytes，F(xiàn)LS）是RA病理變化過程中的關鍵效應細胞，伴隨FLS大量的增殖、凋亡不足、炎性細胞的大量浸潤，出現(xiàn)骨破壞，最終導致關節(jié)畸形、功能障礙[4]。同時circRNAs是一類新型的RNA，可作為RA臨床血標本的生物標志物。在RA骨破壞的發(fā)展中發(fā)揮著獨特的作用，在FLS、成骨細胞與破骨細胞分化、分子信號通路、免疫炎癥反應等方面具有調(diào)控作用[5]。本團隊前期通過高通量測序及GO分析研究，認為circRNA0003353是參與RA炎癥反應的關鍵circRNA[6]。

濕熱痹阻證是RA主要證型之一，主要臨床表現(xiàn)為關節(jié)腫痛而熱，屈伸不利；發(fā)熱、口渴、不欲飲、煩悶不安、小便黃；舌質(zhì)紅，苔黃膩；脈滑數(shù)或弦滑等[7]。導師劉健教授依據(jù)新安醫(yī)學從脾治痹的觀點創(chuàng)制具有清熱祛濕、健脾通絡中藥復方新風膠囊（Xinfeng capsule，XFC，由黃芪、薏苡仁、蜈蚣、雷公 藤組成，專利號：ZL201310011369.8）、黃芩清熱除痹膠囊（Huangqin Qingre Chubi capsule， HQC，由黃芩、梔子、薏苡仁、威靈仙等組成，專利號：ZL201110095718.X）治療RA濕熱痹阻證療效明顯，可以顯著降低免疫炎癥指標如紅細胞沉降率（ESR）、超敏C-反應蛋白（hs-CRP）、類風濕因子（RF）、抗環(huán)瓜氨酸肽抗體（CCP-AB）、免疫球蛋白G（IgG）、補體C3等[8-9]。但是RA濕熱痹阻證circRNA0003353表達如何，炎癥、骨代謝指標表達如何，以及XFC聯(lián)合HQC能否改善circRNA0003353及免疫炎癥、骨代謝指標尚不明確。

回顧性數(shù)據(jù)挖掘一般是指從過往大量的數(shù)據(jù)中搜索隱藏于其中的有著特殊關系性（屬于Association rule learning）的信息的過程。主要有關聯(lián)分析、聚類分析、分類分析、異常分析、特異群組分析和演變分析等[10]。本文擬采用回顧性數(shù)據(jù)挖掘之關聯(lián)規(guī)則分析，觀察RA濕熱痹阻證患者circRNA0003353及炎癥、骨代謝指標的變化，研究健脾清熱通絡法XFC聯(lián)合HQC干預后對其的影響，為臨床應用提供借鑒。

材料與方法

1 臨床病例來源

收集安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院風濕免疫科住院RA濕熱痹阻證患者（2021年4月—2021年8月）30例，25例正常人來自我院健康體檢中心。用肝素鈉抗凝管清晨空腹留取靜脈血4mL，利用Ficoll提取PBMCs，保存至-80℃冰箱備用。

2 診斷及納排標準

2.1 診斷標準 所有患者均符合2010年美國風濕病學會（ACR）聯(lián)合歐洲抗風濕病聯(lián)盟（EULAR）提出的RA診斷標準[11]；RA濕熱痹阻證中醫(yī)辨證論治方案參照2018年類風濕關節(jié)炎病證結(jié)合診療指南[7]。

2.2 納入標準 符合上述中西醫(yī)診斷；均簽署知情同意書；治療前后實驗室指標完善；住院期間均給予中醫(yī)藥治療：XFC（由黃芪、薏苡仁、蜈蚣、雷公藤組成）每粒含生藥0.4 g，專利號：ZL201310011369.8；HQC（由黃芩、梔子、薏苡仁、威靈仙等組成）每粒含生藥0.4 g，專利號：ZL201110095718.X；再加中醫(yī)辨證論治[7]1劑/d，均以四周為一療程。治療藥物由安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院中藥房和制劑室提供。

2.3 排除標準 關節(jié)嚴重畸形，完全喪失關節(jié)功能者；合并有心、肝、腎等嚴重疾病以及嚴重關節(jié)外表現(xiàn)；妊娠或哺乳期婦女；腫瘤性疾病；觀察期間應用免疫抑制劑和生物制劑的患者。

本研究經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準（倫理編號：2019AH-12）。

3 觀察指標

一般性指標：年齡、性別、病程；circRNA0003353表達；免疫炎癥指標：ESR、CRP、RF、IgA、IgG、IgM、C3、C4；骨代謝指標：BALP、OC、OPG、RANKL。

4 實驗試劑及儀器

4.1 DMEM 培養(yǎng)基（Hyclone）；胎牛血清（浙江天杭生物公司）；二甲基亞砜（DMSO，Sigma 公司）；ELISA試劑盒（JYM0155Hu，JYM0082Hu，武漢基因美生物科技公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa）；DAPI（Solarbio）；Fluoromount-G熒光封片劑（SourthernBiotech）；山羊抗兔的二抗（Cy3）（紅光）（Beyotime，A0516）。

4.2 熒光顯微鏡（Motic，BA410E）；普通PCR儀（杭州晶格科學儀器有限公司，K960）；熒光定量PCR儀（Thermo Scientific，PIKOREAL 96）；高速臺式冷凍離心機（安徽嘉文儀器裝備有限公司，JW-3021HR）；酶標儀（雷杜生命科學股份有限公司，RT-6000）

5 實驗方法

5.1 RT-qPCR檢測circRNA0003353的表達Trizol提取各組RA-FLS總RNA，逆轉(zhuǎn)錄反應，進行擴增反應，瓊脂糖凝膠電泳，采用Gelpro32 凝膠圖像分析軟件對PCR產(chǎn)物進行半定量分析，以β-actin表達量為參照采用2-△△Ct進行相對定量分析。

5.2 ELISA法檢測免疫炎癥指標ESR、CRP、RF、IgA、IgG、IgM、C3、C4，骨代謝指標BALP、OC、OPG、RANKL的表達 采集RA濕熱痹阻證患者組與正常對照組血液，室溫下自然凝固10-20分鐘，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。收集上清，保存過程中如出現(xiàn)沉淀，應再次離心。將上清液加入酶標板中（每孔100uL），37℃孵育1.5h，采用ELISA方法，嚴格按照各試劑盒說明書進行操作，酶標儀測定490 nm處的OD值，以上重復3次。

6 關聯(lián)規(guī)則分析

對circRNA0003353及臨床指標以四分位數(shù)為界，四分位數(shù)內(nèi)取值定為“T”，四分位數(shù)外取值定為“F”，治療中有XFC聯(lián)合HQC用藥定為“T”僅有XFC或HQC取值定為“F”，設最小支持度設置為35%，最小置信度設置為85%，使用SPSS Clementine 11.1進行分析。其計算公式如下[12]:

7 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 23. 0軟件進行統(tǒng)計學處理，采用Graphpad 8.0進行圖表制作，計量資料滿足正態(tài)性以表示，采用兩獨立樣本t檢驗；不滿足正態(tài)性以四分位數(shù)表示，采用秩和檢驗；多組數(shù)據(jù)比較采用oneway ANOVA檢驗，以P＜0.05有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 RA濕熱痹阻證患者一般資料、circRNA0003353、炎癥指標、骨代謝指標變化

在納入的正常對照組與RA濕熱痹阻證患者組病例中，RA濕熱痹阻證患者年齡（52.12±11.64）歲，男5例（16.67%），女25例（83.33%），正常人患者年齡（49.66±14.09）歲，男4例（16%），女21例（84%），2組患者在年齡、性別上無顯著差異（P＞0.05），具有可比性；與正常對照組相比，RA濕熱痹阻證患者circRNA0003353、RANKL、ESR、CRP、RF、CCP-AB、IgA、IgG、IgM、C3和C4指標升高（P＜0.05），OC、BALP、OPG指標降低（P＜0.05）。見表1。

表1 RA濕熱痹阻證患者與正常人實驗室指標對比

2 circRNA0003353與RA濕熱痹阻證患者炎癥指標、骨代謝指標之間的相關性分析

Spearman相關性分析結(jié)果顯示，RA濕熱痹阻證患者circRNA0003353表達與ESR、RF、RANKL呈正相關（P＜0.05）。見圖1。

圖1 circRNA0003353與RA濕熱痹阻證患者炎癥指標、骨代謝指標之間的相關性分析

3 RA濕熱痹阻證治療前后circRNA0003353、免疫炎癥指標和骨代謝指標的變化

健脾清熱通絡法治療后，RA濕熱痹阻證患者circRNA0003353的表達下降，骨代謝指標OC、OPG、BALP升高，RANKL降低（p＜0.05），免疫炎癥指標ESR、CRP、CCP-AB、RF、IgG降低（p＜0.05），見表2。

表2 RA濕熱痹阻證治療前后免疫炎癥指標、骨代謝指標及其余各指標的變化

4 XFC聯(lián)合HQC與實驗室指標改善的關聯(lián)規(guī)則分析

關聯(lián)規(guī)則結(jié)果顯示，XFC+HQC對實驗室指標改善的支持度均大于35%、置信度均大于85%、提升度均大于1；支持度最高的前三位分別是XFC+HQC與circRNA0003353（90.00%），XFC+HQC與OPG（90.00%），XFC+HQC與RANKL（90.00%），見圖2，表3。

圖2 XFC聯(lián)合HQC與各指標改善的關聯(lián)規(guī)則分析圖

表3 XFC聯(lián)合HQC與各指標改善的關聯(lián)規(guī)則分析

討 論

中醫(yī)藥治療RA濕熱痹阻證在療效和安全性上具有顯著優(yōu)勢，國醫(yī)大師范永升先生臨證經(jīng)驗認為活動期RA主要以風濕熱痹型為主，運用清熱祛風通絡法治療RA效果明顯，主要使用清熱解毒、祛濕通絡、活血止痛之類中藥[13]。梁國強[14]研究發(fā)現(xiàn)相比于西藥對照組，吳門三黃湯聯(lián)合西藥組可以有效地降低ESR、C反應蛋白、IL-1等指標。王杰[15]通過數(shù)據(jù)挖掘和動物實驗研究發(fā)現(xiàn)XFC聯(lián)合HQC可以顯著降低RA濕熱痹阻證患者體內(nèi)免疫炎癥指標，改善AA濕熱證大鼠關節(jié)炎腫脹程度，抑制IL-1β、IL-6、TNF-α表達，升高IL-10表達。但是采用具有健脾清熱通絡法XFC和HQC聯(lián)合應用改善RA濕熱痹阻證circRNA、免疫炎癥及骨代謝指標鮮見報道，本文研究結(jié)果表明與正常對照組相比，RA濕熱痹阻證患者體內(nèi)circRNA0003353高表達，免疫炎癥指標ESR、CRP、RF、CCP-AB、IgA、IgG、IgM、C3和C4指標，骨代謝指標RANKL升高，而OC、BALP、OPG指標降低，且circRNA0003353表達與ESR、RF、RANKL呈正相關。XFC聯(lián)合HQC可以下調(diào)circRNA0003353表達，降低炎癥指標，改善骨代謝失衡。

具有健脾化濕、清熱通絡的XFC、HQC是國家發(fā)明專利（專利號：ZL201310011369.8；ZL201110095718.X），XFC由黃芪、薏苡仁、蜈蚣、雷公 藤組成，以黃芪、薏苡仁為君藥，具有健脾化濕通絡作用，其中黃芪甲苷可以通過調(diào)控JNK信號通路相關細胞因子表達抑制TNF-α誘導的RA滑膜成纖維細胞增殖[16]。動物實驗表明[17]薏苡仁蛋白和薏苡仁揮發(fā)油對可以減輕AA大鼠關節(jié)紅腫的癥狀，降低關節(jié)炎癥。HQC由黃芩、梔子、薏苡仁、威靈仙等組成，以黃芩、梔子為君藥，其中黃芩素可減輕RA患者外周血單個核細胞炎癥反應[18]，梔子苷可升高IL-10表達，降低IL-17[19]。諸藥合用，共奏健脾化濕、清熱通絡之效，從而起到改善免疫炎癥和骨代謝的作用。

但是本文對于circRNA0003353是如何調(diào)控炎癥、骨代謝指標以及XFC聯(lián)合HQC如何通過調(diào)控circRNA0003353改善炎癥、骨代謝指標尚未研究。下一步我們將用系統(tǒng)生物學方法，觀察circRNA0003353干擾和過表達狀態(tài)下對下游指標的調(diào)控關系，以及XFC聯(lián)合HQC的干預機制。