哮喘平?jīng)_劑對(duì)哮喘大鼠肺組織miR-155表達(dá)的影響*

唐阿飛，楊莉，張芮，霍正星，周濤

安徽中醫(yī)藥大學(xué) 安徽合肥 230012

支氣管哮喘（bronchial asthma，簡(jiǎn)稱哮喘，asthma）是一種常見(jiàn)的呼吸系統(tǒng)疾病，由一種或者多種炎癥細(xì)胞參與的慢性氣道炎癥性疾病[1]。目前，哮喘發(fā)病率在全球呈上升趨勢(shì)，在不同年齡，不同人群中均受到影響。哮喘的發(fā)病機(jī)制目前仍沒(méi)有得到明確闡釋，近些年認(rèn)為遺傳和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)長(zhǎng)度為18～22nt的非編碼小分子RNA（ribonucleic acid，miRNA），能夠特異性地降解靶標(biāo)基因mRNA或抑制其翻譯[2]。哮喘平?jīng)_劑是安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑，在臨床使用過(guò)程中效果顯著。前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，哮喘平?jīng)_劑在改善大鼠肺功能、氣道炎癥和氣道重塑方面有著重要的作用[3-4]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)探討哮喘平?jīng)_劑對(duì)于哮喘大鼠肺組織miR-155表達(dá)的影響，進(jìn)一步明確哮喘的發(fā)病機(jī)制，為臨床提供新的診療思路。

資料與方法

1 動(dòng)物與分組

將60只健康雄性SD大鼠，以每組10只，分為正常對(duì)照組（A）、哮喘模型組（B）、桂龍咳喘寧組（C）、哮喘平?jīng)_劑高劑量組（D）、哮喘平?jīng)_劑中劑量組（E）、哮喘平?jīng)_劑低劑量組（F）。動(dòng)物常規(guī)飼養(yǎng)于室溫（25±1）℃環(huán)境中，適應(yīng)7天后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2 觀察指標(biāo)

2.1 藥物 哮喘平?jīng)_劑（蛤蚧8g，麻黃6g，山藥20g，白術(shù)10g，木蝴蝶10g，紫蘇子10g，川芎10g）由安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房提供。桂龍咳喘寧顆粒劑：桂龍藥業(yè)（山西）有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：Z20172117。

2.2 試劑與儀器 卵清蛋白（OVA，美國(guó) Sigma 公司，批號(hào)：A5253）；氫氧化鋁：上海東山化工廠；普通PCR儀，杭州晶格科學(xué)儀器有限公司，型號(hào)：K960；熒光定量PCR儀，Thermo PIKOREAL 96。

2.3 模型制備與給藥方法 A組以生理鹽水致敏和引喘，其余各組腹腔注射10%卵蛋白（OVA）0.5mL致敏，制備CVA模型。于第22天開(kāi)始用霧化吸入器噴霧1%卵白蛋白（5mL）誘喘20min，1次/d，連續(xù)2周，以大鼠出現(xiàn)煩躁不安、打噴嚏、喘鳴、抓耳朵等癥狀為激發(fā)成功。哮喘平各劑量組、桂龍咳喘寧組開(kāi)始給予相關(guān)藥物灌胃治療，空白對(duì)照組和模型對(duì)照組予以生理鹽水灌胃，連續(xù)給藥21d。連續(xù)灌胃8d。灌胃給藥與霧化激發(fā)同步進(jìn)行。

2.4 取材 加入0.2mL氯仿，劇烈振蕩15s，室溫放置3min。4℃ 12000rpm離心15min，取上清（約500ul）加入到另一EP管中。加入0.5mL異丙醇，溫和混勻，室溫放置1min。4℃12000rpm 離心10min，棄去上清。加入1mL75℅乙醇（DEPC水配制）。4℃12000rpm離心5min，棄上清。室溫放置30min干燥RNA沉淀。加入20-50 μL DEPC水， 55℃促溶10min，-80℃保存?zhèn)溆?/p>

2.5 熒光定量PCR檢測(cè)miR-155的表達(dá) 取100mg肺組織，加入1mlTRIzol，提取肺組織總RNA。RNA取反應(yīng)液200ng作為熒光定量的模板，在10μL反應(yīng)體系中，加入2×one-step qPCR mix 10μL，F(xiàn)orward primer （10uM）、Reverse primer（10uM）和RT primer（10uM）各0.4μL。反 應(yīng) 條 件 如 下：95℃10min、95℃10sec、60℃60sec，40個(gè)循環(huán)。數(shù)據(jù)采用儀器自帶軟件relative quantification study方法分析，mRNA相對(duì)表達(dá)量=2-△△Ctx100%。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析，事后檢驗(yàn)采用LSD法，當(dāng)P＜0.05時(shí)，認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 氣道病理形態(tài)學(xué)觀察

正常對(duì)照組肺組織無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，氣道上皮細(xì)胞完整，氣道壁未見(jiàn)明顯增厚；哮喘模型組肺組織有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，氣道上皮細(xì)胞不全，管壁狹窄，哮喘平高劑量組和桂龍咳喘寧組較模型組明顯改善，其它組肺組織形態(tài)學(xué)改變介于哮喘平?jīng)_劑高劑量組與模型組之間。見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠肺組織形態(tài)學(xué)比較（HE染色，×400倍）

2 哮喘平?jīng)_劑對(duì)哮喘大鼠miR-155表達(dá)水平的影響

哮喘模型組肺組織中miR-155表達(dá)顯著低于正常對(duì)照組（P＜0.01）；與哮喘模型組比較，桂龍咳喘寧組、高劑量組、中劑量組、低劑量組肺組織中miR-155表達(dá)顯著升高（P＜0.01或P＜0.05），見(jiàn)表1，圖2。

圖2 哮喘平?jīng)_劑對(duì)哮喘模型大鼠miR155表達(dá)水平的影響（±s， n=10）

表1 哮喘平?jīng)_劑對(duì)哮喘大鼠miR155表達(dá)水平的影響（ ±s， n=10）

表1 哮喘平?jīng)_劑對(duì)哮喘大鼠miR155表達(dá)水平的影響（ ±s， n=10）

注：與正常對(duì)照組比較*P＜0.05；與哮喘模型組比較#P＜0.05。

組別 例數(shù) miR155正常對(duì)照組 10 1.00±0.14哮喘模型組 10 0.08±0.01*哮喘平高劑量組 10 0.54±0.06#哮喘平中劑量組 10 0.43±0.05#哮喘平低劑量組 10 0.11±0.00#桂龍咳喘寧組 10 0.17±0.02#

討 論

目前認(rèn)為哮喘是由一種因素導(dǎo)致的慢性氣道炎癥性疾病。其主要的病理特點(diǎn)為氣道炎癥和氣道重塑。哮喘的發(fā)病機(jī)制不完全清楚，但近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，基于離子通道和信號(hào)通路干預(yù)氣道重塑進(jìn)程在哮喘發(fā)病機(jī)制中起重要作用[5-6]。吸入型糖皮質(zhì)激素是目前首選的控制氣道炎癥、改善氣道阻塞的藥物， 早期應(yīng)用可有效地改善肺功能和氣道阻塞， 但激素對(duì)肺功能和氣道阻塞的改善作用并不能代表其能夠抑制氣道重塑[7-8]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為哮喘的病因病機(jī)在于先天稟賦不足和外感六淫之邪侵襲所致[9-11]。中醫(yī)藥在治療哮喘有著獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。閆云霞[12]在治療哮喘方面運(yùn)用柴胡滲濕湯，發(fā)現(xiàn)柴胡滲濕湯通過(guò)抑制TGF-β1的表達(dá)來(lái)改善哮喘氣道炎癥和氣道重塑。宣桂琪[13]通過(guò)氣陰雙補(bǔ)方發(fā)現(xiàn)中藥復(fù)方能夠減輕氣道平滑肌，降低肺組織中TGF-β1mRNA。張念志教授基于哮病“虛-瘀-痰”理論，運(yùn)用益氣活血化痰之法擬方哮喘平?jīng)_劑治療支氣管哮喘，臨床應(yīng)用二十余年床效果 頗佳[14]。

該方中山藥益肺養(yǎng)陰，補(bǔ)腎健脾，蛤蚧補(bǔ)肺益腎，納氣定喘，助陽(yáng)益精，兩者聯(lián)用為君藥。白術(shù)健脾益氣，利水滲濕為臣藥輔之。麻黃發(fā)汗解表，宣肺平喘，木蝴蝶可清肺熱，利咽喉、紫蘇子降肺氣，化痰涎，三者共用佐藥宣肺利肺，止咳平喘，全方結(jié)構(gòu)嚴(yán)謹(jǐn)，切中病機(jī)，標(biāo)本兼顧，共奏益氣、活血、化痰、止咳之效。

項(xiàng)目組既往研究表明，哮喘平?jīng)_劑能明顯改善哮喘癥狀和肺功能[15]，通過(guò)調(diào)節(jié)嗜酸性粒細(xì)胞（EOS）和嗜酸細(xì)胞陽(yáng)離子蛋白（ECP），抑制TNF-α、IL-4、IL-17的表達(dá)而減輕哮喘的高反應(yīng)性和氣道炎癥[4，16]。另外，哮喘平?jīng)_劑能夠通過(guò)抑制Bcl-2和促進(jìn)Bax二者之間的表達(dá)水平和調(diào)節(jié)MMP-9/TIMP-1的平衡，減輕哮喘氣道重塑，改善哮喘癥狀[4，17，18]。為進(jìn)一步探究哮喘平?jīng)_劑干預(yù)哮喘的分子機(jī)制，項(xiàng)目組首次以miRNA作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，或許為闡明哮喘的發(fā)病機(jī)制提供新的思路。

miRNA是一種長(zhǎng)度為18～22個(gè)nt，具有高度特異性的單鏈小分子非編碼RNA，廣泛參與細(xì)胞的生長(zhǎng)，發(fā)育，繁殖，對(duì)于免疫系統(tǒng)也有著重要作用[19-20]。近些年認(rèn)為miRNA可能在哮喘的發(fā)病中起到重要作用。Lu[21]等認(rèn)為，miR-21在調(diào)節(jié)哮喘Thl/Th2機(jī)制中有著重要的作用。Dragon[22]等發(fā)現(xiàn)在哮喘患者肺組織中高表達(dá)的miR-26a、miR-200c、let-7b、miR-16和miR-125b，可能是參與調(diào)控氣道及肺組織相關(guān)基因表達(dá)的miRNA。miR-133、miR-25、miR-146a和miR-26a的機(jī)制是通過(guò)改變炎性因子（如IL-1β、TNF-α、IFN-γ）的表達(dá)[23]。在哮喘發(fā)生發(fā)展過(guò)程中miR155能夠影響炎性因子的表達(dá)（IL-35，IL-6），也能夠調(diào)控IL-13的通路，調(diào)節(jié)T細(xì)胞向T1分化[2]。因此推測(cè)miR-155在哮喘發(fā)病過(guò)程中有著重要的作用[24-25]。miR-155的表達(dá)水平降低可導(dǎo)致哮喘炎癥細(xì)胞因子表達(dá)增多，氣道重塑加重[26]。也有學(xué)者指出來(lái)RNA的異常表達(dá)可能會(huì)增加哮喘的嚴(yán)重度[27]。

本研究中哮喘模型組大鼠miR-155的相對(duì)表達(dá)量較正常對(duì)照組明顯減少（P＜0.01），說(shuō)明造模成功。其中，哮喘平高、中劑量組與桂龍咳喘寧組相比，可顯著升高大鼠miR-155相對(duì)表達(dá)量（P＜0.01），說(shuō)明哮喘平高、中劑量效果優(yōu)于上市中藥制劑桂龍咳喘寧，提示哮喘平?jīng)_劑高、中劑量可有效增強(qiáng)miR-155的相對(duì)表達(dá)量，減輕炎癥反應(yīng)和哮喘癥狀。

綜上所述，哮喘平?jīng)_劑能直接或間接上調(diào)miR-155的相對(duì)表達(dá)量，提高機(jī)體的保護(hù)機(jī)制，最終達(dá)到緩解氣道炎癥和阻止氣道重塑進(jìn)程的效果，這可能為臨床治療哮喘提供了新思路。