紅景天苷調(diào)控APC-Cdh1對(duì)永生化神經(jīng)前體細(xì)胞增殖分化的影響*

李立, 姚文龍, 張傳漢

1湖北中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室(湖北武漢 430065)；2華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院麻醉學(xué)教研室(湖北武漢 430030)

紅景天苷是從紅景天中提取的主要活性成分。大量的藥理學(xué)研究表明，紅景天苷具有提高機(jī)體免疫力，抗衰老、抗疲勞、抗腫瘤、抗炎、降血糖等多種藥理作用[1]。紅景天苷可以有效穿過血腦屏障對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)起保護(hù)作用[2-3]。張明發(fā)等[4]研究證明紅景天苷對(duì)小鼠的生長發(fā)育有促進(jìn)作用。另有多項(xiàng)研究結(jié)果顯示紅景天苷可以誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元細(xì)胞[5-6]。但是，關(guān)于紅景天苷是否可以誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞的研究較少。后期促進(jìn)復(fù)合物(anaphase promoting complex，APC)是一個(gè)多功能的泛素蛋白連接酶，通過泛素化降解不同的底物在包括細(xì)胞周期等各種細(xì)胞進(jìn)程中發(fā)揮重要的作用[7]。APC的活性主要受兩個(gè)調(diào)控因子Cdc20和Cdh1調(diào)節(jié)，Cdc20在有絲分裂的早期與APC結(jié)合，促進(jìn)有絲分裂的進(jìn)程；而Cdh1在有絲分裂的后期替代Cdc20與APC結(jié)合，調(diào)節(jié)有絲分裂的退出和G1/S期轉(zhuǎn)換[8]。研究發(fā)現(xiàn)APC-Cdh1在海馬、大腦皮層等終末分化的神經(jīng)元中大量表達(dá)，對(duì)于有絲分裂后神經(jīng)元的存活至關(guān)重要[9]，并且具有調(diào)節(jié)神經(jīng)元軸突生長[10]，促進(jìn)神經(jīng)元分化[11]等多方面作用。因此，本研究從2017年1月至2019年1月通過觀察紅景天苷對(duì)體外永生化神經(jīng)前體細(xì)胞(INPC)增殖分化及Cdh1表達(dá)的影響，探討紅景天苷體外誘導(dǎo)神經(jīng)前體分化的可能作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用紅景天苷提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 細(xì)胞Neurobasal培養(yǎng)基、無血清培養(yǎng)添加劑b27購自Gibco公司；表皮生長因子(EGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)購自PeproTech公司；紅景天苷購自默克公司；四甲基偶氮唑鹽(MTT)購自Amerisco公司；RT-PCR試劑盒購自Takara公司；小鼠抗大鼠細(xì)胞微管相關(guān)蛋白2(MAP2)抗體購自Neomarkers公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與處理 永生化神經(jīng)前體細(xì)胞(INPC)用含20 mL/L b27、20 ng/mL bFGF、20 ng/mL EGF的Neurobasal培養(yǎng)基在37℃，50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長期的INPC用2.5 g/L胰蛋白酶消化傳代，分為紅景天苷組與對(duì)照組。第2天細(xì)胞換液，紅景天苷組加入100 μg/mL的紅景天苷；對(duì)照組無任何藥物處理。

1.3 MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖能力 將INPC接種于96孔培養(yǎng)板中，5×104個(gè)細(xì)胞/孔，每組設(shè)8孔。細(xì)胞加入紅景天苷作用48 h后，每孔加入2 g/L MTT 50 μL，培養(yǎng)4 h。然后吸去上清液，每孔加入100 μL二甲基亞砜，振蕩10 min。在酶標(biāo)儀上測(cè)定吸光度，以570 nm吸光度值反映細(xì)胞活力。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期 細(xì)胞加入紅景天苷作用48 h后，用2.5 g/L胰蛋白酶消化，隨后制成單細(xì)胞懸液，PBS 洗滌2次，加入75%預(yù)冷的乙醇固定16 h，再用PBS 洗滌2次，并將細(xì)胞懸液濃度調(diào)整為1×106個(gè)/mL，加入50 μg/mL的碘化丙啶和50 μg/mL的RNA酶，避光室溫孵育1 h，最終用美國BD公司流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期，采用FlowJo軟件分析結(jié)果。

1.5 免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)MAP2的表達(dá) 細(xì)胞加入紅景天苷作用48 h后，先用PBS沖洗，再經(jīng)甲醇固定15 min，后用2 mL/L Triton-PBS透膜15 min，然后牛血清白蛋白封閉30 min，采用1∶200的MAP2抗體檢測(cè)MAP2的表達(dá)。

1.6 RT-PCR檢測(cè)Cdh1與Id2mRNA的表達(dá) 細(xì)胞加入紅景天苷作用48 h后，用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA并測(cè)定RNA濃度，取500 ng RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。RT-PCR引物見表1。PCR反應(yīng)條件為：預(yù)變性94℃，10 s；變性94℃，5 s；退火及延伸60℃，20 s；反應(yīng)40個(gè)循環(huán)。融解曲線按照2-△△Ct法分析目的基因Cdh1與Id2的相對(duì)表達(dá)量，△Ct=Ct(Cdh1或Id2)-Ct(β-actin)；△△Ct=干預(yù)組△Ct-對(duì)照組△Ct。

表1 RT-PCR引物匯總

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞增殖能力 與對(duì)照組(0.46±0.04)相比，MTT法檢測(cè)紅景天苷組(0.29±0.05)吸光度值降低(P<0.05)。

2.2 細(xì)胞周期 與對(duì)照組相比，紅景天苷組G1～G0期細(xì)胞所占比例增加，由47.9%增加到56.8%(P<0.05)，而S期細(xì)胞減少，由35.8%減少到24.5%(P<0.05)，G2～M期細(xì)胞所占百分比兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1、表2。

圖1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布

表2 兩組細(xì)胞周期分布的比較

2.3 INPC向神經(jīng)元分化的比較 給予干預(yù)48 h后，對(duì)照組細(xì)胞以橢圓形或三角形為主，細(xì)胞突起較短；紅景天苷組細(xì)胞主要呈現(xiàn)2種形態(tài)，一種呈圓形或橢圓形的神經(jīng)元樣細(xì)胞，具有一個(gè)或兩個(gè)長突起；另一種表現(xiàn)為星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞，具有多個(gè)粗長突起。對(duì)照組分化為神經(jīng)元的比例為(32.1±8.7)%，紅景天苷組分化為神經(jīng)元的比例為(64.3±6.2)%，兩組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

圖2 免疫熒光檢測(cè)兩組細(xì)胞MAP2的表達(dá)(×200)

2.4 RT-PCR檢測(cè)Cdh1、Id2 mRNA的表達(dá) PCR結(jié)果顯示，兩組細(xì)胞中β-actin的表達(dá)無明顯差異，但紅景天苷組Cdh1表達(dá)較對(duì)照組升高，而Id2表達(dá)較對(duì)照組降低。Cdh1和Id2相對(duì)表達(dá)量兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 Cdh1和Id2 mRNA的表達(dá)

3 討論

本研究中采用的INPC由高峰等[12]通過將含有猿腎病毒40大T抗原基因(SV40Tag)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的新生鼠神經(jīng)前體細(xì)胞構(gòu)建。該細(xì)胞株保留了原代神經(jīng)前體細(xì)胞的細(xì)胞表型，具有自我更新和多向分化的潛能?？茖W(xué)研究證明神經(jīng)前體細(xì)胞在神經(jīng)系統(tǒng)的生長發(fā)育和修復(fù)替代受損的神經(jīng)細(xì)胞中發(fā)揮重要的作用[13]。因此，如何誘導(dǎo)神經(jīng)前體細(xì)胞分化成神經(jīng)細(xì)胞值得探討。

本研究結(jié)果顯示INPC經(jīng)過100 μg/mL紅景天苷處理48 h后，通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)G1～G0期細(xì)胞增多，S期減少，說明紅景天苷使INPC細(xì)胞周期停滯于G1/S轉(zhuǎn)折點(diǎn)。雖然G2～M期細(xì)胞總數(shù)沒有明顯改變，但不能說明沒有G2/M阻滯。另外，通過MTT法檢測(cè)表明紅景天苷使INPC增殖能力受到抑制。說明紅景天苷對(duì)神經(jīng)前體細(xì)胞增殖有抑制作用。

INPC具有多向分化的潛能。其可以被誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞或星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞。MAP2是成熟神經(jīng)元特異性的標(biāo)記物，本研究通過MAP2免疫熒光結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，經(jīng)過紅景天苷處理后MAP2陽性染色的神經(jīng)細(xì)胞比例明顯增加。該結(jié)果提示紅景天苷促進(jìn)INPC向神經(jīng)元分化。因此，我們得出結(jié)論紅景天苷可以抑制INPC增殖，促進(jìn)其分化。

已有文獻(xiàn)報(bào)道紅景天苷可以誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元[5-6]，這與本研究結(jié)果一致。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)紅景天苷是通過調(diào)控cyclin A、cyclin B、cyclin D1及p21等細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞的增值，改變細(xì)胞周期[14-15]。因此，我們從細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的角度進(jìn)一步探討紅景天苷促進(jìn)INPC分化的機(jī)制。

Cdh1是細(xì)胞內(nèi)泛素蛋白酶小體系統(tǒng)中一個(gè)重要的調(diào)節(jié)蛋白，在有絲分裂晚期及G1期，它與后期促進(jìn)復(fù)合物APC結(jié)合，激活A(yù)PC，泛素化降解周期蛋白和其他蛋白質(zhì)，調(diào)控細(xì)胞周期的進(jìn)程[16]。分化抑制因子2(inhibition of differentiation 2，Id2)是一種抑制細(xì)胞分化，促進(jìn)細(xì)胞增值的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。在發(fā)育的神經(jīng)系統(tǒng)中，Id2促進(jìn)細(xì)胞增值。但是APC-Cdh1復(fù)合物可以結(jié)合并降解Id2，從而使細(xì)胞退出細(xì)胞周期[17]。本研究發(fā)現(xiàn)紅景天苷在抑制INPC增殖、促進(jìn)其分化的同時(shí)，Cdh1表達(dá)明顯增加，Id2表達(dá)明顯減少，這提示Cdh1和Id2與INPC增殖分化有關(guān)。其可能的機(jī)制為：紅景天苷通過上調(diào)Cdh1的表達(dá)，從而提高了APC-Cdh1的活性，APC-Cdh1繼而結(jié)合并降解Id2，從而使得INPC從細(xì)胞周期退出，分化成神經(jīng)元。

綜上所述，紅景天苷100 μg/mL能抑制INPC的增殖，促進(jìn)其分化，后期促進(jìn)復(fù)合物APC的調(diào)控因子Cdh1及其底物分化抑制因子Id2的表達(dá)變化是其作用機(jī)制之一。

利益相關(guān)聲明：文章所有作者聲明文章無利益沖突。

作者貢獻(xiàn)說明：李立負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、實(shí)施和論文撰寫；姚文龍負(fù)責(zé)結(jié)果分析；張傳漢負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)和論文修改。