生物堿類中藥成分微生物轉(zhuǎn)化研究進展

李 璐,亓正良,劉新利

齊魯工業(yè)大學(山東省科學院) 生物工程學院 生物基材料與綠色造紙國家重點實驗室,山東 濟南 250353

微生物轉(zhuǎn)化是指利用微生物產(chǎn)生的酶或者微生物本身將底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的過程[1]。與化學轉(zhuǎn)化相比,微生物轉(zhuǎn)化具備專一性強、條件溫和、副產(chǎn)物少、環(huán)境友好等優(yōu)勢[2]。中藥資源是國家戰(zhàn)略性資源,中藥使用在我國擁有悠久的歷史[3]。將微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)與中藥炮制相結(jié)合,可以解決中藥使用中水溶性差、毒性強、活性低、資源短缺等問題[4]。因此,微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)符合中藥現(xiàn)代化發(fā)展的需求[5]。

生物堿類物質(zhì)是中藥中一類重要的天然活性化合物[6]。生物堿是存在于自然界中的一類含氮的有機化合物(主要存在于植物,少數(shù)來源于動物),有較復雜的環(huán)狀結(jié)構(gòu),多呈堿性,大多具有生理活性,如鎮(zhèn)痛、抗菌消炎、止咳平喘、抗癌等作用[7]。當前,生物堿類中藥研究的熱點之一是利用微生物轉(zhuǎn)化生物堿類化合物,進行結(jié)構(gòu)修飾或生成新的藥效成分[8]。本文主要介紹幾種常見的生物堿類代表化合物的微生物轉(zhuǎn)化菌種、反應酶、生化反應類型、生物轉(zhuǎn)化后的藥效以及該類化合物常見的檢測方法等方面的研究進展。

1 微生物轉(zhuǎn)化在生物堿類中藥中的應用

1.1 小檗堿類生物堿微生物轉(zhuǎn)化

小檗堿,常用名黃連素,屬于異喹啉類生物堿,是黃連類中草藥中主要活性成分,被廣泛應用于治療腸道感染、降糖、降脂及抗腫瘤中[9-11]。近年來,小檗堿又成為創(chuàng)新藥物研究關(guān)注的重點,受到了國內(nèi)外學者的廣泛關(guān)注[12]。

小檗堿在使用過程中口服吸收差,致使生物利用度很低,通過生物轉(zhuǎn)化可以克服以上缺點。小檗堿具有獨特的異喹啉類官能團骨架結(jié)構(gòu)與共軛體系,微生物可對小檗堿官能團不同的結(jié)構(gòu)位點進行修飾,得到新的結(jié)構(gòu)衍生物,此舉不僅有利于使其產(chǎn)生新的活性,而且有益于增強生物利用度,使小檗堿在清熱解毒以及腫瘤,糖尿病等多發(fā)病的臨床治療中發(fā)揮重要作用[13-14]。小檗堿被不同微生物轉(zhuǎn)化后的代謝產(chǎn)物有多種,如土壤細菌鞘脂菌Sphingobiumsp.BD3100將小檗堿轉(zhuǎn)化為11-羥基小檗堿[15]；紅球菌Rhodococcussp.BD7100將小檗堿轉(zhuǎn)化為 2,3-去亞甲基小檗堿[16]；節(jié)桿菌Arthrobactersp.GBD-1、伯克霍爾德菌Burkholderiasp.CJ1將小檗堿轉(zhuǎn)化為 2,3-去亞甲基小檗堿[17]。其中代謝產(chǎn)物2,3-去亞甲基小檗堿是小檗堿類生物堿中最有效的拓撲異構(gòu)酶Ⅰ抑制劑,在抗腫瘤治療中發(fā)揮著重要作用,但相比于小檗堿而言,其抗菌及降糖活性有所降低。隨著研究的深入,研究人員發(fā)現(xiàn)一些腸道微生物也能夠生物轉(zhuǎn)化小檗堿,例如從大鼠腸道中分離到的變形桿菌屬 BM1和BM2菌株可將小檗堿轉(zhuǎn)化為小檗紅堿、藥根堿、非洲防己堿、唐松草分定和 2,3-去亞甲基小檗堿[13],代謝產(chǎn)物小檗紅堿的抗腫瘤活性相比于小檗堿有所提高,非洲防己堿能夠抑制轉(zhuǎn)移性的骨肉瘤細胞U2OS的增殖以及形成新生血管,唐松草分定具有抗菌、抗氧化作用[18]；另有研究表明,大鼠腸道內(nèi)的菌群可以將小檗堿轉(zhuǎn)化為二氫小檗堿,使其易被腸組織吸收[19]。

研究人員對小檗堿微生物轉(zhuǎn)化的酶學機制進行研究,發(fā)現(xiàn)去甲基化酶或具有類似功能的代謝酶可能是腸道微生物轉(zhuǎn)化小檗堿過程中起重要作用的酶,其中研究最為深入的是催化生成 2,3-去亞甲基小檗堿的酶—細胞色素 P450(CYP450)[20]。CYP450 作為一種生物體中常見的藥物代謝催化酶,能夠?qū)⒕哂衼喖锥趸谋交衔镞M行去亞甲基催化[21],而小檗堿C2、C3位具有典型的亞甲二氧苯基結(jié)構(gòu),因此CYP450是代謝具有亞甲二氧基結(jié)構(gòu)的小檗堿類生物堿的關(guān)鍵酶[22]。

微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)產(chǎn)生了新的藥效成分,不僅解決了小檗堿類生物堿利用率低問題,而且還能增強其藥理活性,產(chǎn)生了更高的研究價值[23]。隨著對微生物中小檗堿類催化酶研究的不斷深入,小檗堿類生物堿的微生物轉(zhuǎn)化途徑變得清晰,同時獲得多個具有新型生物活性的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物,使小檗堿類生物堿具有廣泛的應用前景。但現(xiàn)階段的微生物轉(zhuǎn)化小檗堿類化合物研究大多停留在實驗室階段?，F(xiàn)如今,微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)在中藥炮制中的優(yōu)勢逐漸被業(yè)界認可,在未來的研究工作中,小檗堿微生物轉(zhuǎn)化研究中高效的菌種、穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化體系、限速酶的挖掘是發(fā)展的主要方向[24]。

1.2 喜樹堿類生物堿微生物轉(zhuǎn)化

癌癥是影響居民健康甚至奪去人們寶貴生命的疾病,近年來,我國癌癥整體發(fā)病率居高不下,因此研制抗癌藥物刻不容緩[25]。但在化學合成藥物的研發(fā)過程中,往往伴隨著高成本、長周期、高失敗率等一系列問題,而且化學藥物在臨床中可能出現(xiàn)毒副作用及耐藥性等問題,所以研究人員著手從中藥中提取有效成分,開發(fā)新的抗癌藥物并投入臨床應用[26]。喜樹(Camptothecaacuminata),為中國所特有的珙桐科喬木植物,是南方主要造林樹種之一。喜樹中含有抗癌作用的生物堿,由該類生物堿及衍生物所制成的藥物有著較好抗癌療效,被廣泛的應用于臨床中,具有極高的醫(yī)用價值。

喜樹堿(Camptothecin,CPT)是一種從中藥喜樹中分離得到的萜類吲哚生物堿[27],最早由Wall等[28]從喜樹的莖部分離得到,喜樹堿及其衍生物通過特異性地阻斷拓撲異構(gòu)酶I(Topo I)的合成來發(fā)揮抗癌作用。喜樹堿對肝癌、胃癌、膀胱癌等有良好抗癌活性,成為繼紫杉醇后又一具有較好發(fā)展前景的植物來源的抗癌藥[29]。但是喜樹中喜樹堿含量極低,不容易獲得,造成喜樹堿抗癌藥物的短缺；大量砍伐喜樹,不僅滿足不了藥物的需求,還會造成自然環(huán)境的破壞和不合理的資源利用。因此開發(fā)獲取喜樹堿的新途徑,就成為現(xiàn)在急需解決的問題。

藥用植物中的普遍生活著內(nèi)生真菌,這些內(nèi)生真菌是重要的藥用資源,成為解決生物活性物質(zhì)特別是抗癌藥物短缺的一條重要途徑。研究人員從喜樹中廣泛分離篩選產(chǎn)生喜樹堿的內(nèi)生真菌,并進行發(fā)酵、代謝產(chǎn)物分析檢測。盛貽林等[27]從喜樹的組織中分離篩選得到15株純化真菌,通過搖瓶發(fā)酵,以及TLC法與HPLC法對其菌絲體提取物進行分析,發(fā)現(xiàn)有1株菌株能夠產(chǎn)生喜樹堿,其喜樹堿產(chǎn)量可達227 μg/L；劉開輝等[29]從秦巴山區(qū)喜樹中分離得到一株喜樹堿內(nèi)生真菌M-20(實驗室編號),形態(tài)特征和基因序列分析顯示,菌株M-20屬于Xylaria真菌,其喜樹堿產(chǎn)量為 233.3 μg/L；李霞等[30]從喜樹中分離得到了大約50種菌株,其中一株產(chǎn)喜樹堿的菌株通過形態(tài)學鑒定為青霉屬,這是首次在喜樹植物中發(fā)現(xiàn)產(chǎn)喜樹堿的青霉屬菌株。

10-羥基喜樹堿(HCPT)是喜樹堿分子10位碳原子上的氫被羥基取代后的喜樹堿衍生物,同喜樹堿相比,10-羥基喜樹堿的抗腫瘤效果更好,毒性更低[31]。另外,研究發(fā)現(xiàn)10-羥基喜樹堿對前列腺癌、膀胱癌等多種癌癥均有較好療效,因此廣泛應用于臨床治療中。

但10-羥基喜樹堿在喜樹總生物堿中的含量極低,僅占十萬分之二,提取難度較大,并且10-羥基喜樹堿的化學合成過程也過于復雜,無法實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。研究人員利用微生物轉(zhuǎn)化的方法,有效地解決了10-羥基喜樹堿合成的問題[31]。研究人員進行菌株篩選,發(fā)現(xiàn)了多種表現(xiàn)良好的菌株,可以將喜樹堿轉(zhuǎn)化為10-羥基喜樹堿。朱關(guān)平等[32]研究發(fā)現(xiàn)無毒黃曲霉菌株T-419能將喜樹堿轉(zhuǎn)化為10-羥基喜樹堿,實際得率提高到喜樹堿投料量的十分之一；朱殿生等[33]研究發(fā)現(xiàn)毛霉和禾谷鐮刀菌有較好的微生物轉(zhuǎn)化能力,能夠使喜樹堿轉(zhuǎn)化為10-羥基喜樹堿等喜樹堿類衍生物,并且實驗得出毛霉對喜樹堿的最佳轉(zhuǎn)化溫度為30 ℃,最佳轉(zhuǎn)化時間為96 h,最佳轉(zhuǎn)化濃度為150 μg/mL,最佳轉(zhuǎn)化初始pH為6.0。另外,喜樹中分離篩選得到的內(nèi)生真菌也可以產(chǎn)10-羥基喜樹堿。王磊等[31]分離篩選喜樹中可以將喜樹堿轉(zhuǎn)化為10-羥基喜樹堿的內(nèi)生真菌,最終獲得菌株F1105,經(jīng)鑒定該菌株為青霉菌屬；閔長莉[34]等采用組織塊法從喜樹中分離得到13株純化的內(nèi)生真菌,通過TLC 和 HPLC 分析,發(fā)現(xiàn)其中1個菌株可以產(chǎn)10-羥基喜樹堿,發(fā)酵液中產(chǎn)量可達677 μg/L,通過形態(tài)觀察將其初步鑒定歸屬為無孢類群；汪學軍[35]等從喜樹中分離篩選出產(chǎn)10-羥基喜樹堿的內(nèi)生真菌XK002,經(jīng)過形態(tài)學和分子生物學方法鑒定該菌株為蘋果腐皮殼菌ValsamaliMiyabeetYamada。

喜樹內(nèi)生菌長期生活在含有生物堿的環(huán)境中,對生物堿具有良好的耐受性,又因內(nèi)生菌與喜樹長期共生,很可能含有與喜樹相同或相似的代謝途徑和合成酶類[36]。雖然目前關(guān)于喜樹內(nèi)生菌發(fā)酵合成喜樹堿及其衍生物的關(guān)鍵酶及其代謝途徑的報道較少,但是關(guān)于喜樹堿生物合成途徑中關(guān)鍵酶研究的進展較快。研究喜樹堿生物合成途徑中關(guān)鍵酶,可為我們解析喜樹內(nèi)生菌合成喜樹堿及其衍生物的關(guān)鍵酶及其代謝途徑提供可靠依據(jù)。以不同喜樹內(nèi)生菌DNA作為模板,克隆得到喜樹堿的生物合成途徑中部分關(guān)鍵酶并與喜樹植株以cDNA為模板克隆出的喜樹堿生物合成途徑中的關(guān)鍵酶基因進行比較。喜樹堿的生物合成途徑中有4個關(guān)鍵酶基因[37]——異胡豆苷合酶(STR)、色氨酸脫羧酶(TDC)、10-羥基香葉醇羥化酶(G10H)以及10-羥基香葉醇脫氫酶(HGO)。STR是萜類生物堿合成的關(guān)鍵酶,能催化由莽草酸途徑得到的色胺與由甲羥戊酸途徑經(jīng)多步反應生成的裂環(huán)馬錢子苷結(jié)合形成異胡豆苷； TDC可提供催化色氨酸形成喜樹堿及其衍生物的吲哚環(huán)所需要的色胺； G10H可以催化香葉醇生成10-羥基-香葉醇,是一種細胞色素P450氧化酶。萬如意等[38]在喜樹中分離到的內(nèi)生芽孢桿菌可發(fā)酵合成喜樹堿及其衍生物,并從其基因組中克隆出喜樹堿生物合成途徑中的G10H、HGO、TDC 和STR關(guān)鍵酶基因。這為喜樹堿類生物堿微生物轉(zhuǎn)化所涉及到的關(guān)鍵酶提供了思路,但依然需要進一步研究。

此外,喜樹堿生成10-羥基喜樹堿的過程中,篩選的菌株產(chǎn)生的羥化酶起主要作用。羥化酶對喜樹堿進行催化的過程中,發(fā)生了結(jié)構(gòu)上的修飾——喜樹堿第10位碳原子上的氫被羥基取代,生成最終產(chǎn)物10-羥基喜樹堿。過程中發(fā)生的反應類型為羥基化反應[39]。

喜樹堿及其多種衍生物在臨床中被用作常見的抗癌類藥物,因此關(guān)于喜樹堿類生物堿的轉(zhuǎn)化就成了研究熱門。近年來,研究人員研究發(fā)現(xiàn)以喜樹內(nèi)生細菌的DNA為模板能夠克隆出部分喜樹堿生物合成途徑的關(guān)鍵酶基因,這為喜樹內(nèi)生菌能發(fā)酵合成喜樹堿及其衍生物提供了初步理論依據(jù)。將來進一步挖掘出喜樹內(nèi)生菌參與轉(zhuǎn)化反應的限速酶,了解其轉(zhuǎn)化機理,有助于喜樹堿及其衍生物更廣泛地應用于食品、臨床、飼料生產(chǎn)等行業(yè),同時也可以改變現(xiàn)在微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)無法大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的局面,推進喜樹中藥現(xiàn)代化的進程。同時,微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)具有減毒增效的作用,這也是微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)應用在生物堿類中藥上的重要作用之一。

1.3 紫杉醇微生物轉(zhuǎn)化

紫杉醇是從紅豆杉屬植物中提取出的二萜類生物堿化合物,具有較好的抗癌活性,可用于乳腺癌、宮頸癌、卵巢癌、肺癌等發(fā)病率較高的癌癥的治療,是臨床上使用最廣泛的抗癌藥物之一[40]?；谧仙即急旧盹@著的抗癌特性,紫杉醇的微生物轉(zhuǎn)化研究引起了各國學者的關(guān)注,一方面研究人員利用微生物技術(shù)轉(zhuǎn)化生成紫杉醇[41-42],提高紫杉醇的產(chǎn)量,解決紫杉醇在紅豆杉中含量很低的問題；另一方面研究人員利用微生物技術(shù)將紫杉醇轉(zhuǎn)化為活性和水溶性更好的紫杉醇衍生物[43]。

美國施貴寶公司(BMS)的Hanson等[44]利用微生物轉(zhuǎn)化進行紫杉醇的半合成,他們從白色類諾卡氏菌(NocardioidesalbusSC13911)、黃色類諾卡氏菌(N.luteusSC13912)、莫拉氏菌(Moraxellasp.)三種微生物中分離出C-13 側(cè)鏈水解酶、C-10 脫乙酰酶、C-7 木糖甙酶三種酶,分別將紅豆杉中的數(shù)種紫杉烷(BaccatinⅢ、10-deacetyl Taxol、7-xylosyl Taxol、7-xyloxyl-10-deacetyl Taxol、cephalomannie等)的13、10及7位進行水解,得到較多單一的10-deacetyl BaccatinⅢ 作為紫杉醇合成的前體。再利用化學反應,連接上13位的側(cè)鏈,即可得到紫杉醇。

占紀勛等[45]利用32株微生物(包括真菌和細菌)對紫杉醇進行微生物轉(zhuǎn)化的篩選,經(jīng)TLC檢測發(fā)現(xiàn)銅綠假單孢菌PseudomonasaeruginosaAS1.860、稻黃桿菌FlavobacteriumoryzaeAS1.1584等4種菌株具有轉(zhuǎn)化紫杉醇的能力。選取銅綠假單孢菌對紫杉醇進行擴大實驗,最終分離產(chǎn)生了三種產(chǎn)物:BaccatinⅢ、BaccatinⅤ和10-deacetyl BaccatinⅢ。經(jīng)實驗證明,銅綠假單孢菌AS1.860可產(chǎn)生與施貴寶公司所發(fā)現(xiàn)的C-13側(cè)鏈水解酶相同功能的水解酶[44],同時參與紫杉醇轉(zhuǎn)化的還有乙酰基水解酶和羥基異構(gòu)化酶,在紫杉醇的微生物轉(zhuǎn)化過程中,發(fā)生了酯鍵水解的反應機制。

目前,紫杉醇微生物轉(zhuǎn)化面臨合成途徑尚未完全明晰,傳代過程菌種易失活,異源活性植入難度較大等問題,因此大部分微生物轉(zhuǎn)化工作還停留在初步階段。但微生物轉(zhuǎn)化的作用不可忽視,未來要加強對微生物轉(zhuǎn)化中問題的深入研究,優(yōu)化反應條件,提純重要的酶、克隆酶的基因,使微生物轉(zhuǎn)化在紫杉醇類生物堿合成和結(jié)構(gòu)修飾中更好的發(fā)揮作用,也為未來工業(yè)化大生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1.4 馬錢子微生物轉(zhuǎn)化

馬錢子又名番木鱉、苦實,為馬錢科植物馬錢(StrychnosnuxvomicaL.)的干燥成熟種子[46]。馬錢子含有多種吲哚類生物堿,含量最高的是士的寧(strychnine)和馬錢子堿(brucine),這既是馬錢子主要的藥效成分,也是其毒性成分[47]。臨床應用中,馬錢子生物堿類成分在類風濕性關(guān)節(jié)炎、腫瘤、跌打損傷、中風偏癱等疾病治療中發(fā)揮著重要作用[48]。然而,馬錢子毒副作用較大,士的寧是含量最高且毒性最大的馬錢子來源的生物堿,成人口服5～10 mg士的寧會出現(xiàn)中毒現(xiàn)象,30～100 mg可致人死亡；馬錢子堿口服中毒量為15～100 mg。當馬錢子堿和士的寧在臨床中達到中毒劑量后,往往可引起驚厥、痙攣、心率失常等不良反應,甚至危及生命[49-50],這極大限制了在臨床上的應用。所以馬錢子生物堿的減毒增效就成為了近年來中藥現(xiàn)代化研究的一個熱點。

采用微生物轉(zhuǎn)化馬錢子中的主要毒性成分士的寧和馬錢子堿,有望提高馬錢子中藥抗炎、鎮(zhèn)痛的藥效,同時較大幅度地減弱士的寧和馬錢子堿毒性。在現(xiàn)代工藝中,常采用發(fā)酵法對毒性中藥進行微生物轉(zhuǎn)化,來達到減毒增效的目的[51]。

發(fā)酵屬于中藥炮制的重要方法之一,現(xiàn)代中藥發(fā)酵技術(shù)通常結(jié)合傳統(tǒng)中藥發(fā)酵技術(shù)與生物工程學和微生物學,在保留中藥活性成分的同時,又可以對中藥毒性成分結(jié)構(gòu)進行修飾,產(chǎn)生新成分[52]。這也成為馬錢子減毒增效的重要途徑之一。潘揚等[53]利用“雙向發(fā)酵”技術(shù),選用了槐耳、猴頭等20種真菌,將馬錢子作為“藥性基質(zhì)”進行發(fā)酵,并對發(fā)酵后產(chǎn)生的新“藥性菌質(zhì)”中的士的寧、馬錢子堿用HPLC法進行含量檢測,同時比較馬錢子生物堿指紋譜的變化。實驗發(fā)現(xiàn)發(fā)酵后的馬錢子類生物堿成分發(fā)生了明顯的質(zhì)與量的變化,其中馬錢子堿、士的寧含量顯著下降,而士的寧、馬錢子堿氮氧化物(毒性較小的生物堿)含量增加。且指紋譜中顯示出5個新產(chǎn)生的或含量變化較大的未知成分。

朱紅栓菌對馬錢子藥材有較強適應性,具有清熱、解毒、消炎之功效。劉亮鏡等[54]在適宜條件下利用朱紅栓菌Trametescinnabarina對馬錢子進行固體發(fā)酵,研究發(fā)酵前后士的寧和馬錢子堿毒性大小的變化。發(fā)酵前測得馬錢子混懸液的 LD50為91.8 mg/kg,而經(jīng)過發(fā)酵后的馬錢子混懸液的LD50達到119.1 mg/kg。經(jīng)過發(fā)酵的馬錢子的 LD50上升率為29.7%,證明馬錢子經(jīng)朱紅栓菌發(fā)酵后毒性明顯降低,而且發(fā)酵品的鎮(zhèn)痛作用和抗炎作用與生品沒有明顯區(qū)別。證明了朱紅栓菌可以通過發(fā)酵法完成對馬錢子的微生物轉(zhuǎn)化,實現(xiàn)減毒增效作用。

潘自皓等[55]以提高短刺小克銀漢霉CunninghamellablakesleeanaAS3.0970對馬錢子中 2 種毒性主效成分—馬錢子堿與士的寧的轉(zhuǎn)化率,構(gòu)建高效的微生物轉(zhuǎn)化體系為目標,采用液態(tài)發(fā)酵技術(shù),實現(xiàn)對馬錢子生物堿鹽的微生物轉(zhuǎn)化。利用短刺小克銀漢霉在一定條件下對馬錢子堿硫酸鹽和士的寧硝酸鹽進行液態(tài)發(fā)酵,經(jīng)實驗發(fā)現(xiàn)2種底物的平均轉(zhuǎn)化率分別提高了約17%與22%,而且此微生物轉(zhuǎn)化體系減毒增效作用更強。實驗結(jié)果還表明底物濃度與轉(zhuǎn)化時間是影響微生物轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵因素,當?shù)孜镔|(zhì)量濃度和轉(zhuǎn)化時間達到20 mg/L和3 d時,轉(zhuǎn)化率最高。

研究表明采用微生物法轉(zhuǎn)化馬錢子,使其主要毒性成分馬錢子堿和士的寧含量下降,而士的寧氮氧化物和馬錢子堿氮氧化物含量升高[56],且轉(zhuǎn)化后的鎮(zhèn)痛作用和抗炎作用與生品相當甚至有所提高,說明可通過發(fā)酵手段對馬錢子生物堿類進行減毒增效。驗證表明馬錢子堿和士的寧在生物轉(zhuǎn)化中可能發(fā)生了分解及氧化反應,使士的寧和馬錢子堿氮氧化物含量增加[57]。目前,關(guān)于馬錢子生物堿微生物轉(zhuǎn)化相關(guān)的酶學機制的研究卻很少。深入研究馬錢子發(fā)酵轉(zhuǎn)化相關(guān)的酶學機制,尋找馬錢子毒性組分的轉(zhuǎn)化途徑,挖掘參與轉(zhuǎn)化反應的酶,尤其是篩選限速酶,可以更清晰的了解馬錢子這種毒性中藥的轉(zhuǎn)化機制,推動其在臨床以及醫(yī)藥保健等領(lǐng)域更廣泛的應用。隨著對馬錢子類生物堿微生物轉(zhuǎn)化的深入研究,馬錢子類生物堿藥物在臨床中的應用會更加廣泛,提供更好的治療效果。

2 生物堿類化合物的HPLC檢測方法

高效液相色譜法(HPLC)是一種常用的的色譜技術(shù),各組分通過與固定相、流動相之間的相互作用,在色譜柱中進行分離純化,可用于分離、鑒定及量化中藥混合物中的各組分。高效液相色譜法因其柱效高、分辨率高、穩(wěn)定方便,能同時測定幾種生物堿的含量,故在生物堿類化合物的分析檢測中應用最多。很多文獻中有分離測定上述生物堿的HPLC條件,現(xiàn)將其進行總結(jié),見表1。

表1 分離測定生物堿類化合物的HPLC條件

表1(續(xù))

用HPLC法測定生物堿類化合物的含量,不僅操作簡便,樣品用量少,而且樣品分離效果好,檢測的樣品均達到了基線分離,精密度、穩(wěn)定性和回收率均很好,可作為測定生物堿含量分析的常規(guī)方法之一。

3 總 結(jié)

綜上所述,微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)在生物堿類中藥精深加工中有著廣泛的應用。雖然現(xiàn)階段生物堿類中藥在藥理研究以及加工技術(shù)等方面都取得了一定的進展,但是某些重要的生物堿存在化合物含量低,穩(wěn)定性差,毒性較高等局限性。微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)有望解決上述問題,為實現(xiàn)有效制備化學合成難以完成的生物堿及其類衍生物奠定基礎(chǔ)。目前,生物轉(zhuǎn)化技術(shù)尚未廣泛應用于生物堿類中藥的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn),需要在深入挖掘微生物轉(zhuǎn)化機制,提高活性成分的分離純化效率等方面開展系統(tǒng)深入的研究。總之,微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)對中藥的研發(fā)和生產(chǎn)具有重要的理論價值和應用前景,對中藥現(xiàn)代化有著重大的意義。