低氧條件下巨噬細(xì)胞分泌CCL22促進(jìn)三陰乳腺癌轉(zhuǎn)移

陳 敏， 胡紹勇， 何成思， 鄒爭志*

(1. 廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院影像科， 廣州 511300； 2. 南方醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院影像科， 廣州 510630； 3. 華南師范大學(xué)生物光子學(xué)研究院激光生命科學(xué)研究所暨激光生命科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 廣州 510631)

乳腺癌是女性中最常見的惡性腫瘤，其死亡率和發(fā)病率每年持續(xù)上升，近年來已上升至女性腫瘤中的第一位。誘發(fā)乳腺癌發(fā)生發(fā)展的原因很多，有遺傳因素、環(huán)境因素、原癌基因和抑癌基因的突變等，其中環(huán)境因素可能是乳腺癌發(fā)病率上升的重要因素。根據(jù)癌組織免疫組織化學(xué)檢查結(jié)果，乳腺癌分為4種臨床病理亞型：Luminal-A型、Luminal-B型、三陰乳腺癌 (Triple Negative Breast Cancer，TNBC)和Her-2型，其中Her-2型又分為HR陰性型和HR陽性型。TNBC是指雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)和Her-2均為陰性的乳腺癌，占所有乳腺癌病理類型的10%～20.8%，具有特殊的病理特征，表現(xiàn)為高侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移性、預(yù)后較差、5年復(fù)發(fā)率較高、病人整體5年生存率較低。然而，與Luminal型腫瘤相比較，其對化療藥更敏感。因此，臨床上常聯(lián)合手術(shù)或放療聯(lián)合化療藥物治療TNBC。

乳腺癌發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致病人死亡的一個重要原因，因此，針對腫瘤轉(zhuǎn)移的干預(yù)治療能顯著提高乳腺癌患者的生存時間。TNBC在臨床上的表現(xiàn)多為遠(yuǎn)處肺轉(zhuǎn)移和腦轉(zhuǎn)移。TNBC發(fā)生轉(zhuǎn)移的因素十分復(fù)雜，有腫瘤細(xì)胞內(nèi)在的因素，也有腫瘤細(xì)胞周圍微環(huán)境的因素，甚至遠(yuǎn)處靶器官的微環(huán)境也是重要的因素。腫瘤細(xì)胞內(nèi)在的因素主要包括促腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的激活和抑腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的失活，如BRAC1/2基因突變激活和TP53基因失活。腫瘤細(xì)胞周圍微環(huán)境的成分主要包括腫瘤細(xì)胞周圍免疫細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞)、腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞以及細(xì)胞因子，這些因素對腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲及凋亡有重要的影響[1-2]。腫瘤細(xì)胞能否在遠(yuǎn)處靶器官駐留增殖完全依賴于靶器官提供的生長因子微環(huán)境。已有研究表明乳腺癌微環(huán)境中巨噬細(xì)胞通過分泌CCL18促進(jìn)TNBC細(xì)胞轉(zhuǎn)移[3-4]。實(shí)體腫瘤中由于微小血管的缺陷不能提供足夠的氧分子，因而表現(xiàn)為低氧的微環(huán)境。已有研究發(fā)現(xiàn)低氧微環(huán)境能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移[5],然而低氧微環(huán)境對TAM的促腫瘤轉(zhuǎn)移功能是否存在潛在影響，目前尚未見研究報(bào)導(dǎo)。本研究旨在探討腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(Tumor-Associated Macrophages，TAM)在低氧環(huán)境下對TNBC細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響，以期為臨床TNBC轉(zhuǎn)移的干預(yù)治療提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑

佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯(Phorbol 12-myristate 13-aceteat,PMA)購自Sigma公司，貨號：P1585，細(xì)胞培養(yǎng)液的質(zhì)量濃度：20 ng/mL；DAPI和DMSO購自Sigma公司；胰蛋白酶消化液購自Thermo Scientific公司；CCL18試劑盒購自R&D Systems公司；IL-10試劑盒購自eBiosciences公司；CCL17和CCL22試劑盒購自Ray Biotech公司，TRIzolTM試劑購自Thermo Fisher公司，RT-PCR試劑盒購自Thermo Fisher公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

三陰乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231和BT-549(購自ATCC)置于含φ=10%的胎牛血清(Gbico)的DMEM培養(yǎng)基中，人源單核細(xì)胞THP-1(購自中科院上海細(xì)胞庫)置于含φ=10%的胎牛血清的1640培養(yǎng)基中。常氧培養(yǎng)條件為：37 ℃、φ=5%的CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱；低氧培養(yǎng)條件為：置于37 ℃恒溫箱內(nèi),持續(xù)通入V(N2)∶V(CO2)∶V(O2)=94∶5∶1的混合氣體,維持飽和濕度；所有細(xì)胞經(jīng)檢測無支原體污染。

1.3 THP-1誘導(dǎo)分化為巨噬細(xì)胞

將1×106個THP-1接種于6孔板，每孔添加PMA,使其終質(zhì)量濃度為20 ng/mL，培養(yǎng)72 h后去除未貼壁細(xì)胞，貼壁細(xì)胞即為M0巨噬細(xì)胞。

1.4 Transwell法檢測腫瘤細(xì)胞遷移

對數(shù)生長期乳腺癌細(xì)胞經(jīng)過巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h，然后經(jīng)胰酶消化，用無血清RMPI-1640培養(yǎng)液按照每孔200 μL細(xì)胞懸液含10 000個細(xì)胞的密度接種于Transwell上室。下室為500 μL腫瘤細(xì)胞的生長培養(yǎng)液。置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)18 h后，取上室于φ=75%的酒精中固定20 min，經(jīng)過PBS清洗3次，用棉簽搽除小室內(nèi)側(cè)細(xì)胞，最后經(jīng)過10 μg/mL的DAPI染色后，在顯微鏡下觀察并統(tǒng)計(jì)遷移的細(xì)胞數(shù)量。

1.5 RT-PCR檢測

對數(shù)生長期MDA-MB-231細(xì)胞經(jīng)過巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h后，用TRIzolTM試劑提取總RNA，用SuperScript IV 一步法RT-PCR試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后完成RT-PCR檢測。檢測基因引物如下：E-cadherin：5-TTGCTACTGGAACAGGGACA-3(正向)，5-GTATTGGGAGGAAGGTCTGC-3(反向)；Vimentin：5-GAAGAGAACTTTGCCGTTGA-3(正向)，5-CGAAGGTGACGAGCCATT-3(反向)；SNAIL1：5-TTACCTTCCAGCAGCCCTAC-3(正向)，5-GACAGAGTCCCAGATGAGCA-3(反向)；內(nèi)參基因:GAPDH 5-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3(正向)，5-GTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3(反向)。

1.6 腫瘤轉(zhuǎn)移CT掃描

THP1誘導(dǎo)而來的TAM，經(jīng)過低氧培養(yǎng)后，收集TAM條件培養(yǎng)液處理MDA-MB-231細(xì)胞48 h。MDA-MB-231細(xì)胞經(jīng)過胰酶消化后，用無血清RMPI-1640培養(yǎng)液按照100 μL含100 000個細(xì)胞的密度，經(jīng)過尾靜脈注射移植于裸鼠體內(nèi)。裸鼠經(jīng)過飼養(yǎng)45 d后，通過CT掃描拍照。CT儀器為東芝64排多層螺旋CT，型號：TSX-101A。掃描方法：將小鼠固定四肢放置在CT掃描床中間，掃描范圍從小鼠頭部至小鼠尾部，包完整只小鼠。掃描完成后，以橫斷位肺窗及軟組織窗為主參數(shù)，重建工作站, 用1 mm薄層重建出全胸圖片后選取圖像，統(tǒng)計(jì)轉(zhuǎn)移灶。

1.7 ELISA法檢測細(xì)胞因子濃度

將TAM條件培養(yǎng)液按一定比例稀釋。在對應(yīng)96孔的ELISA板的每個孔中加入100 μL上述條件培養(yǎng)液，置于4 ℃冰箱過夜。倒空液體，用紙巾吸干表面，并拍干殘留液體，用300 μL洗滌液清洗2次。然后加300 μL封閉液于每個孔中，室溫孵育1 h，倒掉殘余液體(方法同上)。每個孔中加100 μL羊抗小鼠二抗，室溫孵育1 h，倒掉殘余液體(方法同上)。每個孔中加滿洗滌液，倒空液體并拍干殘留液體，重復(fù)3次。用洗滌液浸泡5 min，拍干殘留液體，每個孔中加100 μL底物，顯色30 min后，立即在酶標(biāo)儀(Tecan)上檢測，波長為405～410 nm。

1.8 分析乳腺癌組織CCR4表達(dá)

通過在線軟件TCGA(https:∥www.aclbi.com/static/index.html#/tcga)，分析數(shù)據(jù)庫中乳腺癌組織和癌旁正常組織CCR4的表達(dá)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 巨噬細(xì)胞在低氧條件下促進(jìn)三陰乳腺癌細(xì)胞遷移

為了評估低氧是否激活了TAM的促三陰乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移功能，本研究選取了BT-549細(xì)胞和MDA-MB-231細(xì)胞進(jìn)行遷移實(shí)驗(yàn)。首先，分別收集M0巨噬細(xì)胞、TAM和低氧培養(yǎng)的TAM的條件培養(yǎng)液(Condition Media，CM)；然后，用以上收集的3種CM處理BT-549細(xì)胞和MDA-MB-231細(xì)胞48 h后完成遷移實(shí)驗(yàn)。結(jié)果(圖1)表明：相對于M0巨噬細(xì)胞CM處理的TNBC細(xì)胞，經(jīng)過TAM的CM處理的TNBC細(xì)胞具有更強(qiáng)的遷移能力；與正常培養(yǎng)的TAM相比，低氧培養(yǎng)的TAM進(jìn)一步促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞遷移，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

圖1 3種CM處理的三陰乳腺癌細(xì)胞Transwell實(shí)驗(yàn)

上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal Transition，EMT)是腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移過程中的一個重要特征。為了進(jìn)一步驗(yàn)證腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力，通過RT-PCR檢測了EMT標(biāo)志物基因(E-cadherin、ZEB1、SNAIL1)的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果(圖2)表明：相對于常氧培養(yǎng)的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞，低氧處理的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞更能顯著地誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞的EMT轉(zhuǎn)化，表現(xiàn)為上皮型標(biāo)志基因E-cadherin表達(dá)下降和間質(zhì)型標(biāo)志基因ZEB1、SNAIL1表達(dá)上升。

圖2 RT-PCR檢測3種CM處理的MDA-MB-231細(xì)胞遷移相關(guān)基因表達(dá)

2.2 巨噬細(xì)胞促進(jìn)三陰乳腺癌細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移

以上體外實(shí)驗(yàn)表明TAM在低氧條件下能夠促進(jìn)TNBC細(xì)胞遷移，接下來探討低氧培養(yǎng)的TAM是否能夠促進(jìn)TNBC在體內(nèi)的轉(zhuǎn)移。MDA-MB-231細(xì)胞分別經(jīng)過TAM的CM和低氧培養(yǎng)的TAM的CM處理72 h后，經(jīng)尾靜脈注入裸鼠體內(nèi)。飼養(yǎng)4周后，經(jīng)過CT掃描觀察肺部。結(jié)果(圖3)表明低氧處理的TAM顯著誘導(dǎo)了MDA-MB-231細(xì)胞的肺轉(zhuǎn)移：低氧處理的TAM誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞在肺部的腫瘤轉(zhuǎn)移灶數(shù)目顯著高于常氧培養(yǎng)的TAM。

圖3 CT掃描檢測三陰乳腺癌細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移灶

2.3 低氧誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌CCL22

已有研究[6]報(bào)導(dǎo)TAM能分泌CCL18、CCL17、CCL22和IL-10等促腫瘤轉(zhuǎn)移因子。因此，本研究通過ELISA實(shí)驗(yàn)，將CCL18、CCL17、CCL22和IL-10因子分別在低氧、常氧培養(yǎng)的TAM條件培養(yǎng)液中進(jìn)行檢測，以探討低氧是否刺激TAM表達(dá)這4種轉(zhuǎn)移因子。檢測結(jié)果(圖4)表明CCL22可能是低氧TAM刺激TNBC轉(zhuǎn)移的重要因子：CCL18在TAM中表達(dá)最高，而CCL22和IL-10表達(dá)相對較低；低氧能夠顯著刺激CCL22表達(dá)的上升，而對其他3個細(xì)胞因子表達(dá)無顯著影響。

2.4 CCL22促進(jìn)三陰乳腺癌遷移

為了進(jìn)一步證明CCL22是否促進(jìn)了TNBC的轉(zhuǎn)移，TNBC細(xì)胞MDA-MB-231和BT-549經(jīng)0、5、10 ng/mL的CCL22處理48 h，然后進(jìn)行Transwell實(shí)驗(yàn)。結(jié)果(圖5)顯示：5、10 ng/mL的CCL22能夠顯著地促進(jìn)MDA-MB-231、BT-549細(xì)胞的遷移。

圖4 通過ELISA方法檢測巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的質(zhì)量濃度

圖5 不同質(zhì)量濃度的CCL22誘導(dǎo)的三陰乳腺癌細(xì)胞Transwell實(shí)驗(yàn)

2.5 CCR4介導(dǎo)低氧條件下巨噬細(xì)胞促進(jìn)三陰乳腺癌細(xì)胞遷移

已有報(bào)道[6]表明CCL22通過與其受體CCR4結(jié)合來激活細(xì)胞的下游信號，從而促進(jìn)細(xì)胞的運(yùn)動與遷移。接下來，本研究探討CCR4基因是否在腫瘤細(xì)胞中存在高表達(dá)，從而促進(jìn)TNBC細(xì)胞的遷移。通過TCGA在線數(shù)據(jù)庫分析CCR1至CCR5基因的表達(dá)，結(jié)果(表1)表明CCL22與CCR4的結(jié)合在促進(jìn)乳腺癌轉(zhuǎn)移中起了重要作用：相對于正常組織，CCR3、CCR4和CCR5在腫瘤組織中表達(dá)顯著升高，其中，CCR4升高最顯著。

表1 CCR家族基因在乳腺癌組織與正常組織中表達(dá)的差異與比值Table 1 The expression and ratio of CCR family members in breast cancer tissue and normal tissue

3 討論

TNBC占乳腺癌病例的10%～20%。由于雌激素受體、孕激素受體和Her-2均為陰性，目前缺乏特異性針對TNBC的抗激素療法。目前，除了傳統(tǒng)的化療外，僅有少數(shù)的靶向治療方法應(yīng)用于臨床的TNBC治療。TNBC是高轉(zhuǎn)移性的乳腺癌，其轉(zhuǎn)移機(jī)制十分復(fù)雜。已有研究發(fā)現(xiàn)，TNBC的高轉(zhuǎn)移與腫瘤細(xì)胞自身癌基因信號通路的激活及抑癌基因信號通路的失活有關(guān)，如：PI3K/AKT和WNT/β-catenin信號通路的激活[7-8]。盡管已有針對這些信號通路的靶向抑制劑，然而并沒有在臨床上應(yīng)用。實(shí)體腫瘤常處于缺氧環(huán)境，有研究發(fā)現(xiàn)缺氧能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移[9]，機(jī)制研究表明缺氧激活了HIFα信號通路，從而促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的遷移能力[10]。腫瘤微環(huán)境存在大量的免疫細(xì)胞，其中TAM與乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。目前的觀點(diǎn)認(rèn)為，TAM主要分為M1型和M2型，其中M1型主要起抗腫瘤作用，而M2型起促腫瘤作用[11]。 如：鄒爭志等[12]發(fā)現(xiàn)M2型TAM能夠增強(qiáng)宮頸癌對化療藥的抵抗，證明了M2型TAM具有促腫瘤發(fā)展的作用；在乳腺癌的研究中，CHEN等[3]發(fā)現(xiàn)TNBC細(xì)胞促進(jìn)TAM轉(zhuǎn)化成M2型，M2型TAM通過分泌CCL18反過來促進(jìn)TNBC細(xì)胞的轉(zhuǎn)移；TU等[13]發(fā)現(xiàn)M2型TAM分泌IRF7調(diào)節(jié)因子和促進(jìn)miR-1587在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)，從而誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移；ALLEN等[14]發(fā)現(xiàn)TAM通過激活炎性乳腺癌細(xì)胞RhoC-GTPase信號通路來促進(jìn)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。本研究發(fā)現(xiàn)TAM能夠顯著促進(jìn)TNBC細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，該研究結(jié)果與已有研究結(jié)果[13]是一致的。更重要的是，本研究發(fā)現(xiàn)低氧能夠更進(jìn)一步地增強(qiáng)TAM促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的能力。

盡管有一些研究報(bào)道低氧能直接促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[15]、TAM增強(qiáng)了TNBC細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能[16]。然而，關(guān)于TAM在低氧狀態(tài)下的促腫瘤轉(zhuǎn)移能力是否增強(qiáng)尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。本研究通過小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，證明了缺氧能夠激活TAM的促腫瘤轉(zhuǎn)移功能。機(jī)制上的研究[17]也表明:低氧刺激了TAM細(xì)胞CCL22表達(dá)的上調(diào)，CCL22通過分泌到腫瘤微環(huán)境來促進(jìn)TNBC細(xì)胞的遷移；CCL22是一個促腫瘤轉(zhuǎn)移的重要趨化因子，其表達(dá)受到多個信號通路的調(diào)節(jié)；IL4和IL13通過激活STAT3信號通路來促進(jìn)CCL22的表達(dá)，而IFN-γ抑制CCL22的表達(dá)。本研究指出低氧促進(jìn)巨噬細(xì)胞表達(dá)CCL22，這意味著低氧有可能激活了促進(jìn)CCL22表達(dá)的信號通路，或抑制了下調(diào)CCL22表達(dá)的信號通路。低氧是否激活I(lǐng)L4和IL13信號或抑制IFN-γ信號，需要進(jìn)一步的研究。有研究[18]報(bào)道低氧能夠激活STAT3，STAT3進(jìn)一步上調(diào)HIFα的表達(dá)。HIFα作為一個轉(zhuǎn)錄因子能夠調(diào)節(jié)許多基因的表達(dá)，然而至今尚未有研究報(bào)道HIFα調(diào)節(jié)CCL22的表達(dá)。本研究通過TCGA在線數(shù)據(jù)庫分析CCR家族基因在乳腺癌中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)相對于正常組織，CCR4在乳腺癌組織表達(dá)升高最顯著。CCR家族下游存在許多與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的信號通路，如PKC、JNK、AKT、MAPK等信號通路[19]。CCL22通過激活CCR4來促進(jìn)TNBC轉(zhuǎn)移是否與上面這幾條信號通路有關(guān)，在本研究中并沒有闡明清楚，需要進(jìn)一步的驗(yàn)證。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)TAM在低氧條件下促進(jìn)三陰乳腺癌細(xì)胞遷移，并進(jìn)一步在小鼠體內(nèi)模型中驗(yàn)證了TAM促進(jìn)三陰乳腺癌細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移。通過機(jī)制研究，發(fā)現(xiàn)低氧誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌CCL22，CCL22在促進(jìn)三陰乳腺癌遷移中起了重要作用；通過TCGA在線數(shù)據(jù)庫，進(jìn)一步證明CCL22受體CCR4和腫瘤的發(fā)展密切相關(guān)。