分子動力學模擬探索乳克魯維酵母來源的β-半乳糖苷酶熱變性條件

曹 錕， 王若男， 熊興東， 吳 赟*， 劉新光*

(1. 廣東醫(yī)科大學廣東省醫(yī)學分子診斷重點實驗室/衰老研究所/生物化學與分子生物學研究所， 東莞 523808； 2. 廣東醫(yī)科大學科研平臺服務管理中心， 東莞 523808)

β-半乳糖苷酶是一類能夠水解半乳糖苷鍵的糖苷酶，通常由4個亞基組成四聚體，一般可催化乳糖分解為一分子的葡萄糖和一分子的半乳糖[1-3]。該酶廣泛存在于動植物、微生物體內(nèi)，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)不同來源的β-半乳糖苷酶具有較高的序列同源性和結構相似性，表明該酶的保守性較高[4-5]。近年來，該酶在蛋白質(zhì)工程、酶工程和食品工業(yè)方面的用途越來越廣泛。β-半乳糖苷酶在食品加工方面的應用主要包括以下3個方面：(1)食品級的β-半乳糖苷酶已被廣泛生產(chǎn)應用，這有利于解決世界上約70%～90%的成年人體內(nèi)由于缺乏該酶而導致的乳糖不耐受問題；(2)該酶能導致乳糖的水解并顯著提高乳制品的甜度，將該酶應用在食品生產(chǎn)加工方面能夠減少甜味劑的用量，降低生產(chǎn)成本；(3)該酶能降解細胞壁多糖并釋放出游離的半乳糖，進而加快植物乙烯的生成，最終促進果蔬軟化和成熟[6-8]。

鑒于β-半乳糖苷酶作為食品添加劑具有上述幾個重要作用，因此，探索該酶的生物活性與溫度的關系具有一定的意義，進一步確定該酶的最適酶解溫度及熱變性條件能夠為食品加工領域提供理論基礎[9-10]。然而，考慮到工業(yè)應用價值及其安全性，目前只有微生物體內(nèi)的β-半乳糖苷酶是被廣泛應用于商業(yè)酶源，如乳克魯維酵母和脆壁克魯維酵母[11-12]。因此，本研究以乳克魯維酵母體內(nèi)的β-半乳糖苷酶為研究對象，針對其1 025個氨基酸殘基進行了分子動力學模擬，該模擬體系的難點在于原子總數(shù)多、計算量大，本研究將采用顯式溶劑模型計算β-半乳糖苷酶的構象變化、熱變性溫度以及不同溫度條件下影響β-D-半乳吡喃糖GAL配體小分子的結合微環(huán)境，最終揭示乳克魯維酵母體內(nèi)的β-半乳糖苷酶的溫度耐受性機制。

1 材料與方法

1.1 分子模擬的條件

本研究中乳克魯維酵母體內(nèi)的β-半乳糖苷酶結構(code:3ob8)來自于Protein Data Bank(PDB)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(http:∥www.rcsb.org/)。通過Gromacs 2020.4軟件構建了4個獨立的模擬體系，即溫度條件分別被設置為35、50、65、80 ℃，對應的開爾文單位為308.15、323.15、338.15、353.15 K，接下來對該酶1 025個氨基酸殘基分別進行總時長為 50 ns的分子動力學模擬。選擇這4個溫度的依據(jù)分別是：35 ℃為生物體的最適生長溫度，可代表正常狀態(tài)下的β-半乳糖苷酶；50～65 ℃是經(jīng)過預實驗測試的大致變性起始溫度，也是大多數(shù)蛋白比較常見的開始發(fā)生變性的溫度區(qū)間[13-15]；80 ℃是能使自然界大多數(shù)蛋白趨于完全變性狀態(tài)的溫度[16-17]，本研究以此溫度作為該酶在乳克魯維酵母體內(nèi)可能的完全變性條件。采用Gromos43a1分子力場、SPC水模型，并將該酶的晶體構象放置于立方周期盒子中作為起始構象，設定其與盒子的邊界最小距離為1.0 nm，模擬系統(tǒng)的周期性邊界條件適用于X、Y、Z3個方向。為了中和蛋白體系的電荷，在體系中加入0.15 mol/L NaCl鹽溶液。采用蛙跳算法計算每個原子的運動，以粒子網(wǎng)格算法(Particle Mesh Ewald)計算靜電相互作用能量[18]。接下來，通過最速下降法進行400步能量最小化，并對每個模擬體系進行總時長為50 ps的位置約束模擬。正式動力學模擬的初速度被設定為隨機初始速度。

1.2 模擬結果的分析

首先，采用Gromacs 2020.4軟件的gmx rms、gmx gyrate、gmx rmsf和gmx sasa工具分別計算了蛋白的均方根誤差(Root Mean Square Deviation,RMSD)、回旋半徑(Radius of gyration，Rg)、溶劑可及表面積(Solvent Accessible Surface Area,SASA)以及每個氨基酸殘基的α-C的均方根波動值(Root Mean Square Fluctuation,RMSF)，并通過VMD-1.9.1可視化軟件觀測4個不同模擬軌跡中蛋白構象的變化。然后，參考文獻[18-21],用gmx distance工具測量了β-半乳糖苷酶的底物——GAL糖分子結合位點殘基之間的距離，并分別采用Origin8.5 和 PyMOL 軟件繪制圖形及結構圖。

2 結果與分析

2.1 β-半乳糖苷酶的三維結構概況

乳克魯維酵母體內(nèi)的β-半乳糖苷酶的結構是由4個相同亞基組成的同源四聚體，每個亞基由1 025個氨基酸殘基組成，其相對分子質(zhì)量約為118 500。三維構象的主要特點是多數(shù)β-折疊區(qū)域暴露在蛋白表面，而α-螺旋則位于蛋白中心區(qū)域(圖1A)，這一特征與大多數(shù)蛋白的結構特點呈相反狀態(tài)。GAL糖分子、Mg2+和Mn2+離子的主要結合位點位于α-螺旋之中，β-折疊則對蛋白骨架的穩(wěn)定起關鍵作用。在模擬體系中添加了水分子和NaCl鹽離子，能量優(yōu)化后的立方體盒子參數(shù)x、y、z均為13.992 78 nm(圖1B)，展示了該蛋白的立方體模擬體系。

圖1 β-半乳糖苷酶結構及其模擬體系構型展示

2.2 蛋白整體構象變化的原子表述

為了監(jiān)測蛋白平衡狀態(tài)的構象與原始結構之間的平均偏差，采用RMSD來評價體系是否達到平衡狀態(tài)。由圖2A可知：35 ℃時，β-半乳糖苷酶最先達到平衡狀態(tài)，對應的RMSD也是最低的，約為0.35 nm;50 ℃時，β-半乳糖苷酶的RMSD升高較為明顯，并且該酶未達到平衡狀態(tài)，結合文獻[22]的結果：β-半乳糖苷酶的熔解溫度大約為51 ℃，因此，判斷50 ℃大致可以代表該酶的熔解溫度臨界值，而該酶在50 ℃條件下的模擬結果則能夠代表其在熔解溫度時的各項指標；65 ℃和80 ℃時，β-半乳糖苷酶的RMSD的最大值大于0.51 nm，在50 ns內(nèi)無法達到平衡狀態(tài)，說明這2個溫度條件下的蛋白結構非常不穩(wěn)定，已經(jīng)發(fā)生了變性，故將65 ℃和80 ℃定義為變性條件。SURVE和MAHONEY[22]已證實β-半乳糖苷酶的熔解溫度大約為51 ℃，因此，本研究設置的模擬條件中的50 ℃能夠代表該酶的熔解溫度。

RMSF的變化能夠評價蛋白質(zhì)碳骨架的每個原子相對于其平均位置的漲落，由此可以判斷不同溫度時蛋白的變性程度。由圖2B可知：35 ℃時，β-半乳糖苷酶對應的RMSF最低，此時的蛋白具備正常的酶活力，則將35 ℃的結果視為正常值；80 ℃時，β-半乳糖苷酶有大量氨基酸殘基的RMSF遠高于正常值且呈現(xiàn)劇烈的波動，說明蛋白質(zhì)碳骨架在變性狀態(tài)下的不穩(wěn)定性增加。這些結果說明高溫將導致該酶的空間結構被破壞。

蛋白質(zhì)碳骨架的回旋半徑隨模擬時長的變化能夠代表結構的松散程度。由圖2C可知：經(jīng)過50 ns的模擬，35 ℃時β-半乳糖苷酶對應的α-C的Rg平均值約為 3.20 nm；在50 ℃、65 ℃時，該酶對應的α-C的Rg平均值分別為 3.24、3.23 nm，這表明當處于熔解溫度臨界值(50 ℃)時，該酶的結構開始改變；80 ℃時，該酶的氨基酸殘基呈現(xiàn)出剛性，大量的成鍵已被破壞，對應的α-C的Rg平均值為3.32 nm。這些結果表明，乳克魯維酵母體內(nèi)的β-半乳糖苷酶從50 ℃開始呈現(xiàn)不同程度的變性，當溫度升高至80 ℃時，蛋白構象已經(jīng)趨于完全變性的狀態(tài)。

圖2 模擬過程中β-半乳糖苷酶整體的波動性展示

2.3 蛋白構象的溶劑可及表面積

由蛋白整體的SASA隨著時間變化情況(圖3A)可知：經(jīng)過50 ns的模擬，35 ℃時的SASA平均值為383.58 nm2，達到β-半乳糖苷酶的熔解溫度(50 ℃)時則升高到 388.52 nm2，更進一步證實了50 ℃為變性起始溫度。而在變性條件(65 ℃、80 ℃)下對應的SASA平均值分別為386.1、386.57 nm2。這些數(shù)據(jù)的變化趨勢與RMSD、Rg的變化趨勢保持一致，表明當大于50 ℃后，蛋白將發(fā)生不可逆的變性。將GAL結合位點殘基Asn-88、Asp-187、His-389、Glu-414、His-416、Asn-481、Glu-482、Glu-551、His-554和Asp-623歸為一個組，并統(tǒng)計了該組對應的SASA平均值。與35 ℃時的SASA平均值(17.82 nm2)相比，80 ℃時的GAL的結合位點的SASA平均值高達19.34 nm2(圖3B)。這些結果表明，高溫促使GAL的結合位點殘基被暴露在蛋白表面，這與正常狀態(tài)下的GAL活性中心被包埋在蛋白骨架之中相矛盾，故可判斷高溫導致的變性殘基不利于GAL的結合。

圖3 溫度對β-半乳糖苷酶溶劑可及表面積的影響

2.4 35 ℃和80 ℃條件下β-半乳糖苷酶二級結構變化以及GAL的結合能力

為了鑒定β-半乳糖苷酶在正常條件與變性條件下的二級結構變化，采用do_dssp插件解析了蛋白二級結構各組分的含量[23]。與35 ℃時的結果相比，80 ℃時β-半乳糖苷酶的二級結構出現(xiàn)較大的改變(圖4A、B)：35 ℃時平均有358個氨基酸殘基形成β-轉(zhuǎn)角，269個氨基酸殘基參與形成無規(guī)卷曲；然而在80 ℃時，平均有333個氨基酸殘基形成β-轉(zhuǎn)角，287個氨基酸殘基參與形成無規(guī)卷曲。這些數(shù)據(jù)說明，高溫會導致β-半乳糖苷酶中一部分氨基酸殘基由β-轉(zhuǎn)角轉(zhuǎn)化為無規(guī)卷曲，從而改變二級結構各組分的含量占比并破壞了蛋白質(zhì)結構的穩(wěn)定性，最終使酶喪失生物活性。

因此，上述分子模擬的數(shù)據(jù)進一步證實溫度過高會導致β-半乳糖苷酶變性。接下來，研究了GAL糖分子的結合位點殘基Asn-88、Asp-187、His-389、Glu-414、His-416、Asn-481、Glu-482、Glu-551、His-554和Asp-623的空間成鍵并測量了殘基之間的空間距離。結果(圖4C、D)表明：35 ℃時的β-半乳糖苷酶內(nèi)部依靠約13個氫鍵緊密結合GAL糖分子，而與之形成鮮明對比的是，80 ℃時的結合位點殘基對之間的空間距離變大，這種現(xiàn)象是由于結合位點殘基被暴露在蛋白表面而造成的，表現(xiàn)在Asn-88與Glu-551、Asp-623與Glu-482、His-554與His-416的距離分別為1.40、1.77、1.62 nm，空間距離越大越不利于GAL的結合，即β-半乳糖苷酶失去了催化β-D-半乳吡喃糖的功能。

3 小結

本研究采用分子動力學模擬的計算方法研究β-半乳糖苷酶的溫度耐受性，分析并揭示了不同溫度條件對該酶穩(wěn)定性及酶活性產(chǎn)生的影響。結果表明：β-半乳糖苷酶在35 ℃時的蛋白結構及氨基酸波動性比較穩(wěn)定；當溫度升高至50 ℃，β-半乳糖苷酶的Rg和SASA均增大，說明蛋白結構逐漸失去柔性，該蛋白二級結構各組分的含量占比也會隨之改變。這與SURVE等[11]報道的β-半乳糖苷酶的熔解溫度約為51 ℃的結論相一致。更重要的是，本研究首次報道了當溫度高于熔解溫度的臨界值(50 ℃)時，GAL糖分子的活性中心殘基將會暴露在蛋白表面，這將導致β-半乳糖苷酶喪失催化GAL的能力，進一步造成該酶無法降解細胞壁多糖、無法解決人體的乳糖不耐受等關鍵問題。因此，在乳制品發(fā)酵、催熟果蔬軟化及增加甜度、飼料加工等方面，必須嚴格控制溫度低于50 ℃，以確保β-半乳糖苷酶的活性。總之，本研究在原子水平上探索了β-半乳糖苷酶的熔解溫度臨界值，揭示了β-半乳糖苷酶活性及溫度耐受性等關鍵信息，為相關的食品生產(chǎn)加工以及發(fā)酵提供理論支持，具有一定的工業(yè)應用價值。

圖4 溫度對β-半乳糖苷酶二級結構及其與GAL分子結合能力的影響