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    4-1BB、CD8在口腔扁平苔蘚組織中的表達(dá)研究

    2022-05-10 02:37:18張雪蓮管翠強(qiáng)金恩龍
    口腔醫(yī)學(xué) 2022年4期
    關(guān)鍵詞:殘根基底口腔

    張雪蓮,管翠強(qiáng),,金恩龍

    口腔扁平苔蘚(oral lichen planus,OLP)是口腔黏膜慢性炎癥性疾病,可同時(shí)發(fā)生在口腔多個(gè)部位,病損表現(xiàn)多樣,相互交錯(cuò)轉(zhuǎn)變。根據(jù)黏膜狀況,OLP病損分為糜爛型及非糜爛型,糜爛型OLP伴有自發(fā)痛、刺激痛,給患者造成困擾[1]。目前OLP發(fā)病機(jī)制主要分為抗原特異性和非特異性兩種,其中前者涉及CD8+T細(xì)胞的異?;罨捌溽槍?duì)上皮基底細(xì)胞的殺傷作用[2]。4-1BB作為T細(xì)胞共刺激靶點(diǎn),優(yōu)先靶向CD8+T細(xì)胞[3],促進(jìn)CD8+T細(xì)胞的增殖[4]。4-1BB可能通過調(diào)節(jié)CD8+T細(xì)胞進(jìn)而參與OLP發(fā)生發(fā)展。本研究擬檢測(cè)OLP中4-1BB、CD8在OLP組織中的表達(dá),探討兩者與OLP臨床病理特征的相關(guān)性,闡明可能的發(fā)病機(jī)制。

    1 材料與方法

    本研究經(jīng)山西醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院倫理學(xué)委員會(huì)審批(倫理號(hào):2020sL004),所有研究對(duì)象均被告知研究?jī)?nèi)容并簽署知情同意書。

    1.1 病例收集

    選取2019年9月—2021年4月就診山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院口腔科,并經(jīng)病理確診為OLP的患者31例,納入OLP組,其中男14例,女17例。納入標(biāo)準(zhǔn):參考衛(wèi)生部規(guī)劃教材《口腔黏膜病學(xué)》第5版OLP診斷標(biāo)準(zhǔn),結(jié)合OLP臨床表現(xiàn)和組織病理學(xué)檢查確診為OLP患者。排除標(biāo)準(zhǔn)如下:①3個(gè)月內(nèi)使用過糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑等相關(guān)藥物者;②患有可能影響免疫功能的口腔疾病或免疫系統(tǒng)性疾??;③患有腫瘤或其他全身系統(tǒng)性疾病;④某些藥物、殘根殘冠或銀汞充填物引起的苔蘚樣反應(yīng);⑤其他原因不能完成實(shí)驗(yàn)者。

    同期選取15例在山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院口腔頜面外科行埋伏阻生齒拔除術(shù)的健康志愿者作為對(duì)照組,其中男8例,女7例,均經(jīng)HE染色證實(shí)上皮及固有層未見無明顯病理改變。

    1.2 調(diào)查內(nèi)容與方法

    采用統(tǒng)一的調(diào)查表,由受試者本人當(dāng)場(chǎng)填寫并回收。調(diào)查內(nèi)容包括:①癥狀評(píng)估,采用直觀模擬標(biāo)尺法[5](visual analogue scale,VAS)評(píng)估患者疼痛程度,將疼痛程度記為1~10分。②體征評(píng)估,采用OLP網(wǎng)紋-糜爛-潰瘍疾病活動(dòng)積分(reticulum-erosion-ulcer,REU)[6]對(duì)疾病活動(dòng)性進(jìn)行評(píng)分,REU評(píng)分系統(tǒng)將病損分為三型,依據(jù)部位將口腔分為10個(gè)區(qū),各部位REU評(píng)分相加之和記為REU計(jì)分,詳見表1。③心理狀況,焦慮狀況以焦慮自評(píng)量表(self-rating anxiety scale, SAS)[7]為準(zhǔn);抑郁狀況以抑郁自評(píng)量表(self-rating depression scale, SDS)[8]為準(zhǔn)。④牙石,由口腔科專業(yè)醫(yī)生檢查為準(zhǔn)。⑤檢查殘根、殘冠及尖銳牙尖情況。⑥飲食習(xí)慣,是否喜食辛辣食物,水果蔬菜攝入頻率(每周0~2次為偶爾,大于2次為經(jīng)常)。⑦睡眠情況,熬夜[9]指不因失眠引起的23時(shí)后仍未進(jìn)入睡眠狀態(tài)的現(xiàn)象;失眠[10]指每周失眠>3 d,病程>3個(gè)月。⑧消化系統(tǒng)疾病,胃炎、便秘。⑨生活習(xí)慣,吸煙、飲酒。

    表1 REU評(píng)分系統(tǒng)Tab.1 REU score system

    1.3 主要試劑

    兔抗4-1BB多克隆抗體(愛博泰克,中國(guó)武漢),兔抗CD8α單克隆抗體、HRP羊抗兔二抗、DAB顯色試劑盒(Cell Signaling Technology,美國(guó)),Leica顯微鏡(Leica,德國(guó)),科研及病理玻片掃描分析系統(tǒng)(3D Histech,匈牙利)。

    1.4 實(shí)驗(yàn)方法

    對(duì)照組切取埋伏阻生齒遠(yuǎn)中切口周圍正常黏膜組織,OLP組切取病損明顯部位黏膜組織。將切取的新鮮組織標(biāo)本固定,脫水,石蠟包埋,常溫保存。石蠟切片經(jīng)HE染色后使用光學(xué)顯微鏡證實(shí)診斷。OLP診斷標(biāo)準(zhǔn):固有層淺層出現(xiàn)以淋巴細(xì)胞為主的帶狀浸潤(rùn),基底角質(zhì)形成細(xì)胞液化變性,無上皮異型增生。在OLP上皮最薄部分評(píng)價(jià)基底細(xì)胞損傷程度等級(jí)[11]:0級(jí),無損傷;1級(jí),基底細(xì)胞間出現(xiàn)分離;2級(jí),基底細(xì)胞偶有細(xì)胞質(zhì)空泡化;3級(jí),基底細(xì)胞出現(xiàn)液化變性。

    1.5 染色結(jié)果分析

    免疫組織化學(xué)法染色:用PBS緩沖液代替一抗作為陰性對(duì)照。組織連續(xù)切片,脫蠟、入水,封閉,抗原修復(fù),血清封閉,加入4-1BB(1∶200)、CD8(1∶100)一抗,4 ℃孵育過夜,取出后加入二抗孵育30 min,DAB顯色,復(fù)染,脫水、透明、封片。

    每張切片計(jì)數(shù)5個(gè)高倍視野中的CD8陽(yáng)性細(xì)胞數(shù),取平均值作為CD8計(jì)數(shù)最終結(jié)果。

    對(duì)4-1BB進(jìn)行半定量分析,每張切片隨機(jī)選取觀察5個(gè)高倍視野(high power field, HPF),計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞平均百分比后計(jì)分:0分為[0,1%];1分為(1%,25%];2分為(25%,75%];3分為(75%,100%]。染色強(qiáng)度計(jì)分:0分(無著色),1分(淡黃色),2分(棕黃色),3分(棕褐色)。以兩計(jì)分的乘積判斷染色結(jié)果:0~2分為陰性(-),3~5分為弱陽(yáng)性(+),6~8分為陽(yáng)性(++),9~12分為強(qiáng)陽(yáng)性(+++),其中+~+++為陽(yáng)性表達(dá)。

    1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    采用SPSS 23.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,連續(xù)性變量使用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差或中位數(shù)表示;分類變量使用頻數(shù)(百分比)表示。計(jì)量變量的多組比較使用單因素方差分析或Kruskal-WallisH檢驗(yàn);分類變量應(yīng)用卡方檢驗(yàn);Spearman檢驗(yàn)各連續(xù)性變量的相關(guān)性;卡方檢驗(yàn)分析等級(jí)變量的相關(guān)性。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié) 果

    2.1 基本資料分析

    OLP組患者共31例,平均年齡(45.4±13.1)歲。其中糜爛型患者15例,男5例,女10例,平均年齡(40.8±14.2)歲;非糜爛型患者16例,男9例,女7例,平均年齡(49.8±10.8)歲。對(duì)照組患者共15例,平均年齡(48.4±12.7)歲。統(tǒng)計(jì)分析表明,OLP組和對(duì)照組年齡、性別的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(年齡t=0.543,P=0.465;性別t=0.271,P=0.603)。

    兩組基本臨床資料比較發(fā)現(xiàn)失眠、焦慮、局部機(jī)械刺激因素(殘根、殘冠、尖銳牙尖)及喜食辛辣是OLP發(fā)生的相關(guān)因素(P<0.05),見表2。

    表2 OLP組與對(duì)照組臨床資料比較

    2.2 CD8與4-1BB的表達(dá)

    對(duì)照組患者未表達(dá)CD8(圖1A),但OLP組31例患者中均可以檢測(cè)到CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn),大部分位于固有層淺層(圖1B~C),偶見上皮內(nèi)CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)。依據(jù)免疫組化結(jié)果,使用均值作為分界值,CD8分界值為246個(gè)/HPF,其中CD8+T細(xì)胞高密度浸潤(rùn)為13例,低密度浸潤(rùn)為18例。糜爛組中CD8+T細(xì)胞高密度浸潤(rùn)有12例,非糜爛組僅1例,糜爛組中CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)程度高于非糜爛組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=11.431,P=0.035)。

    在31例OLP患者中,有23例4-1BB為陽(yáng)性,陽(yáng)性率為74.19%。4-1BB主要位于固有層深層(圖1D~E),在部分血管內(nèi)皮上也觀察到了4-1BB。統(tǒng)計(jì)分析顯示:OLP組4-1BB的表達(dá)高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=17.091,P<0.001);糜爛組中4-1BB陽(yáng)性表達(dá)率為86.67%,非糜爛組為62.50%,4-1BB在糜爛組中的表達(dá)高于非糜爛組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=11.390,P=0.040)。

    A:CD8在正常組織中的表達(dá)( ×400);B:CD8在OLP組織中的表達(dá)( ×100);C:CD8在OLP組織中的表達(dá)( ×400);D:4-1BB在正常組織中的表達(dá)( ×400);E:4-1BB在OLP組織中的表達(dá)( ×100);F:4-1BB在OLP組織中的表達(dá)( ×400);黑色箭頭為陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞

    2.3 CD8與4-1BB與臨床病理特征之間的關(guān)系

    比較不同分型OLP患者臨床病理特征后發(fā)現(xiàn)糜爛型OLP患者REU評(píng)分、VAS評(píng)分、基底細(xì)胞損傷程度均高于非糜爛型患者,且結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表3)。

    表3 不同分型OLP患者REU評(píng)分、VAS評(píng)分、基底細(xì)胞損傷程度比較Tab.3 Comparison of REU scores, VAS scores, and the degree of basal cell injury in different types of OLP

    Spearman相關(guān)分析發(fā)現(xiàn),4-1BB與CD8表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.389,P=0.031)。CD8、4-1BB與VAS評(píng)分、REU評(píng)分分別呈正相關(guān)(P<0.05),CD8浸潤(rùn)程度與基底細(xì)胞損傷程度呈正相關(guān)(P<0.05)(表4),但CD8、4-1BB與年齡、性別、心理狀況、牙石、口腔局部機(jī)械刺激(殘根、殘冠及尖銳牙尖)飲食習(xí)慣、生活習(xí)慣、消化系統(tǒng)疾病、睡眠習(xí)慣無相關(guān)性(P>0.05)。

    表4 CD8、4-1BB與臨床病理特征的相關(guān)性分析Tab.4 Correlation analysis of CD8 and 4-1BB with clinicopathological characteristics in OLP

    3 討 論

    OLP病因復(fù)雜,研究表明OLP與免疫、心理、感染、內(nèi)分泌等多種因素有關(guān)。本研究通過比較OLP患者與健康對(duì)照組的臨床因素,發(fā)現(xiàn)失眠、焦慮、局部機(jī)械刺激因素及喜食辛辣可能是OLP發(fā)生的相關(guān)因素,這與郭夢(mèng)瑤等[12]的發(fā)現(xiàn)類似。社會(huì)心理因素不僅是OLP發(fā)病的危險(xiǎn)因素,還與OLP復(fù)發(fā)有關(guān)[13-14],配合心理疏導(dǎo)有助于緩解病情。持續(xù)的辛辣飲食刺激及殘根、殘冠、尖銳牙尖的長(zhǎng)期機(jī)械刺激對(duì)口腔黏膜造成微小創(chuàng)傷,加重炎癥浸潤(rùn),影響局部血液微循環(huán)。對(duì)OLP患者應(yīng)定期隨訪,同時(shí)引導(dǎo)患者建立健康的生活習(xí)慣,改善患者心理狀態(tài)。

    研究發(fā)現(xiàn),CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫毒性應(yīng)答在感染、自身免疫、腫瘤中發(fā)揮重要作用[15]。本研究中OLP患者局部組織中CD8+T細(xì)胞數(shù)量增加,且在糜爛型OLP多于非糜爛型。Sun等[16]使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血中T細(xì)胞表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)重型糜爛型OLP患者外周血CD8+T細(xì)胞數(shù)目多于非糜爛型OLP患者。這表明在不同臨床類型OLP中,CD8表達(dá)會(huì)出現(xiàn)差異,CD8對(duì)臨床病情可能具有指導(dǎo)意義。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),臨床癥狀體征評(píng)分越高,基底細(xì)胞損傷程度越重,固有層CD8+T細(xì)胞數(shù)量越多。此外,Enomoto等[17]發(fā)現(xiàn)與鱗狀上皮內(nèi)CD8+T細(xì)胞低密度組相比,上皮內(nèi)CD8+T細(xì)胞呈高密度浸潤(rùn)組的細(xì)胞毒性免疫應(yīng)答更加完善,病情更傾向緩解。

    為了進(jìn)一步檢測(cè)淋巴細(xì)胞功能狀態(tài),本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了4-1BB的表達(dá)。4-1BB又稱CD137,與其配體4-1BBL是一對(duì)正向共刺激信號(hào),兩者作用后觸發(fā)雙向信號(hào)傳導(dǎo),即4-1BB通過募集TNFR相關(guān)因子(TRAF)1和TRAF2,激活JNK/SAPK通路,誘導(dǎo)IL-2、IFN-γ、Bcl-xL和Bfl-1分泌,促進(jìn)T細(xì)胞增殖,保護(hù)其免于凋亡[17];4-1BBL反向信號(hào)傳導(dǎo),激活NF-κB、Src /Akt通路、Src/mTOR/p70S6K通路,促進(jìn)抗原提呈細(xì)胞的成熟,驅(qū)動(dòng)促炎因子的產(chǎn)生[18],誘導(dǎo)強(qiáng)效的免疫應(yīng)答。本研究發(fā)現(xiàn),與正常組織相比,OLP中4-1BB表達(dá)上調(diào),且在糜爛型OLP中表達(dá)高于非糜爛型,這表明4-1BB的異常活化可能與OLP的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。4-1BB的高表達(dá)表明OLP的免疫微環(huán)境以促炎反應(yīng)為主,這與Wei等[19]的結(jié)論一致。

    REU評(píng)分系統(tǒng)較單純糜爛與非糜爛分組更能體現(xiàn)口腔各部位病損狀況[20]及臨床病情的嚴(yán)重程度。本研究進(jìn)一步探討CD8、4-1BB是否與病情進(jìn)展及病理特征有關(guān),發(fā)現(xiàn)兩者與REU、VAS評(píng)分存在相關(guān)性,CD8與基底細(xì)胞損傷程度呈正相關(guān),這與OLP可能是CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的針對(duì)上皮細(xì)胞的毒性免疫應(yīng)答假說一致[1]。很多學(xué)者研究4-1BB在自身免疫疾病及腫瘤免疫中的作用,發(fā)現(xiàn)4-1BB通過增強(qiáng)T細(xì)胞的Th1/Tc1極化[21],促進(jìn)CD8+T細(xì)胞、NK細(xì)胞的增殖以及CD8+T細(xì)胞旁觀者的活化與增殖[22],重振PD-1介導(dǎo)的耗竭CD8+T細(xì)胞活力[23]等多種途徑增強(qiáng)CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性免疫應(yīng)答,加重組織損傷。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明4-1BB與CD8表達(dá)呈正相關(guān),猜測(cè)4-1BB通過多種途徑促進(jìn)固有層中CD8+T細(xì)胞異常聚集繼而加重組織損傷與臨床病情。本課題組將通過體內(nèi)及細(xì)胞研究進(jìn)一步驗(yàn)證兩者間的關(guān)聯(lián)。

    綜上所述,OLP患者局部組織中4-1BB表達(dá)升高,且其與CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)程度呈正相關(guān),4-1BB可能通過調(diào)控CD8+T細(xì)胞數(shù)目及效應(yīng)功能參與OLP的發(fā)生發(fā)展。

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