基于多數(shù)據(jù)庫分析HLA-DPB1在肺腺癌中的潛在價(jià)值

楊恒 張軍 郭強(qiáng) 林稱意 羅衛(wèi)民 原野 程棟梁 羅湘玉 劉華 郭家龍

肺癌導(dǎo)致的死亡占所有腫瘤死亡的18.4%，是世界上最常見的腫瘤相關(guān)死亡原因[1-2]。據(jù)文獻(xiàn)估計(jì)，2020年肺癌死亡人數(shù)將占美國(guó)所有腫瘤死亡人數(shù)的首位，約22.38%[3]。肺癌發(fā)病早期臨床癥狀不明顯，部分確診時(shí)已為晚期，伴有縱隔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移甚至遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[4]。因此，肺腺癌(lung adenocarcinoma,LUAD)的早期診斷和有效治療對(duì)于病人獲得較好預(yù)后就顯得尤為重要[5]。近年來，腫瘤免疫和免疫治療在腫瘤的治療中受到重視，正逐漸成為癌癥治療的方向[6-7]。人類白細(xì)胞骯原-DPB1(HLA-DPB1)抗原常表達(dá)于免疫T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等表面，主要通過識(shí)別并結(jié)合相關(guān)肽分子向活化的CD4+T細(xì)胞提供免疫信息，促進(jìn)其增殖和細(xì)胞毒性，從而在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用[8-10]。本研究通過多個(gè)在線數(shù)據(jù)庫分析HLA-DPB1在LUAD發(fā)生發(fā)展和免疫浸潤(rùn)作用，為L(zhǎng)UAD的診斷、免疫治療和預(yù)后評(píng)價(jià)提供新型潛在靶點(diǎn)。

對(duì)象與方法

1.Oncomine分析：Oncomine數(shù)據(jù)庫(www.oncomine) 是一個(gè)基于基因芯片的數(shù)據(jù)庫和整合數(shù)據(jù)挖掘平臺(tái)，可直接在線訪問Oncomine數(shù)據(jù)庫，能幫助我們了解全基因組表達(dá)相關(guān)的研究[11]。本研究中Oncomine用于分析LUAD中HLA-DPB1的RNA水平。篩選條件：P<0.0001；倍數(shù)變化=1.5；數(shù)據(jù)類型為mRNA；分析類型:癌組織 vs正常組織。

2.Timer數(shù)據(jù)庫：Timer數(shù)據(jù)庫(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)是一個(gè)全面系統(tǒng)分析多種腫瘤免疫浸潤(rùn)的數(shù)據(jù)庫之一[12]。首先在基因模塊我們分析了HLA-DPB1在人類部分腫瘤與相對(duì)應(yīng)的腫瘤旁正常組織之間表達(dá)的差異性。然后分析HLA-DPB1表達(dá)水平與腫瘤浸潤(rùn)細(xì)胞免疫基因標(biāo)志物B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、M1巨噬細(xì)胞、M2巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞(DC)、T輔助細(xì)胞1(Th1))細(xì)胞、T輔助細(xì)胞2(Th2)細(xì)胞、T濾泡輔助細(xì)胞(Tfh)細(xì)胞、T輔助細(xì)胞17(Th17))的相關(guān)性。

3.UALCAN分析：UALCAN(http://ualcan.path.uab.edu)是對(duì)TCGA基因表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行深層次分析的開放數(shù)據(jù)庫[13]。本研究通過在該數(shù)據(jù)庫分析HLA-DPB1在LUAD和正常樣本的表達(dá),與LUAD臨床病理學(xué)特征(包括腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等)之間的相關(guān)性及潛在的預(yù)后價(jià)值。

4.GEPIA 數(shù)據(jù)庫 ：在 GEPIA 數(shù)據(jù)庫(http://gepia.cancer-pku.cn/)中[14]，我們分析了HLA-DPB1在LUAD和正常肺組織中的表達(dá)譜，并探究其表達(dá)水平與肺腺癌病人臨床分期和預(yù)后之間的關(guān)系。在相關(guān)性分析模塊中驗(yàn)證了Timer數(shù)據(jù)庫中相關(guān)性較強(qiáng)的LUAD浸潤(rùn)細(xì)胞免疫標(biāo)志物基因與HLA-DPB1表達(dá)水平之間的相關(guān)性。

5.Lung cancer explorer、PrognoScan和Kaplan-Meier plotter數(shù)據(jù)庫：本研究通過PrognoScan(http://www.abren.net/PrognoScan/)、Lung cancer explorer(http://lce.biohpc.swmed.edu/)和Kaplan-Meier plotter(http://kmplot.com/analysis/)在線數(shù)據(jù)庫分析HLA-DPB1的表達(dá)水平與LUAD病人預(yù)后之間的相關(guān)性[15-17]。

結(jié)果

1.HLA-DPB1在LUAD組織中的表達(dá)降低，并且與LUAD病人臨床病理學(xué)特征和Tp53突變相關(guān):數(shù)據(jù)庫分析顯示，HLA-DPB1在乳腺癌、肝癌、胰腺癌、白血病、腎癌、卵巢癌、神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤等癌癥中表達(dá)上升，而在一部分腫瘤中表達(dá)下降，如肺癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌、膀胱癌、黑色素瘤和骨髓瘤中表達(dá)降低(圖1A)。

A.Oncomine數(shù)據(jù)庫中HLA-DPB1在腫瘤中的表達(dá)；B.Timer數(shù)據(jù)庫中HLA-DPB1在腫瘤中的表達(dá)。aP<0.05;bP<0.01;c,P<0.001。

此外，通過Timer數(shù)據(jù)庫進(jìn)一步分析HLA-DPB1在各種腫瘤中的表達(dá)，我們得出與Oncomine數(shù)據(jù)庫相同的結(jié)論(圖1B)。

在GEPIA數(shù)據(jù)庫中，我們同樣發(fā)現(xiàn)HLA-DPB1在LUAD組織中的表達(dá)下降，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)，我們還發(fā)現(xiàn)HLA-DPB1的表達(dá)水平還與LUAD病人的臨床分期有關(guān)(圖2A～B)。我們?cè)?UALCAN 數(shù)據(jù)庫中也發(fā)現(xiàn)HLA-DPB1在LUAD組織中低表達(dá)，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2C)。接下來，我們?cè)诙鄶?shù)據(jù)中心來源的Lung cancer explorer數(shù)據(jù)庫中對(duì)HLA-DPB1表達(dá)水平進(jìn)行Meta分析發(fā)現(xiàn)HLA-DPB1在LUAD中處于低表達(dá)的狀態(tài)，預(yù)示著低表達(dá)HLA-DPB1的病人預(yù)后不良(P=2.1E-8)。

A.HLA-DPB1在肺腺癌病人組織中表達(dá)下降；B.HLA-DPB1表達(dá)下降與肺腺癌病人臨床分期相關(guān)；C.HLA-DPB1在肺腺癌病人組織中表達(dá)下降。

另外，我們還發(fā)現(xiàn)了HLA-DPB1表達(dá)水平與LUAD病人臨床病理學(xué)特征和Tp53突變相關(guān)(表1)。由此可表明HLA-DPB1表達(dá)水平與LUAD病人的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。

表1 HLA-DPB1表達(dá)水平與肺腺癌臨床病理學(xué)特征相關(guān)

2.HLA-DPB1在LUAD病人中的預(yù)后價(jià)值：通過使用PrognoScan數(shù)據(jù)庫評(píng)估HLA-DPB1表達(dá)水平對(duì)LUAD病人生存率的影響，我們發(fā)現(xiàn)HLA-DPB1表達(dá)與LUAD病人的預(yù)后具有顯著相關(guān)性(圖3)。HARVARD-LC數(shù)據(jù)集顯示HLA-DPB1高表達(dá)與LUAD病人具有較好的總生存期( HR=0.64，95%CI=0.42～0.97，COXP=0.036822)(圖3A)。此外，MICHIGAN-LC、GSE13213、GSE13213數(shù)據(jù)集均顯示升高HLA-DPB1表達(dá)的LUAD病人傾向于具有更好的總生存期( HR=0.56，95%CI=0.32～0.99，COXP=0.047121；HR=0.47，95%CI=0.33～0.69，COXP=0.000087；HR=0.67，95%CI=0.49～0.91，COXP=0.010309)(圖3B～D)。

圖3 PrognoScan數(shù)據(jù)庫顯示更高的HLA-DPB1表達(dá)水平意味著更好的預(yù)后

另外，我們?cè)贕EPIA、Kaplan-Meier Plotter和Lung cancer explorer數(shù)據(jù)庫中進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)高表達(dá)HLA-DPB1的LUAD病人比低表達(dá)HLA-DPB1的病人預(yù)后更好(GEPIA:P=0.0022;Kaplan-Meier Plotter:P=2.7E-11;Lung cancer explorer:P<0.01)。這些結(jié)果表明，HLA-DPB1的表達(dá)降低可能是LUAD病人預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素。

3.HLA-DPB1表達(dá)水平與LUAD免疫浸潤(rùn)細(xì)胞水平相關(guān)：結(jié)果發(fā)現(xiàn)HLA-DPB1表達(dá)水平與LUAD免腫瘤純度(tumor purity)、B 淋巴細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和樹突細(xì)胞具有顯著相關(guān)性(P<0.05)。見圖4。

圖4 HLA-DPB1表達(dá)水平與肺腺癌腫瘤浸潤(rùn)細(xì)胞相關(guān)

在Timer數(shù)據(jù)庫的Correlation模塊中，我們發(fā)現(xiàn)HLA-DPB1表達(dá)水平與LUAD免疫浸潤(rùn)細(xì)胞(CD8+T 細(xì)胞、T 細(xì)胞、B 細(xì)胞、M1巨噬細(xì)胞、M2巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、樹突細(xì)胞等)上的免疫標(biāo)志物顯著相關(guān)(表2)。細(xì)致的講，在LUAD中，HLA-DPB1表達(dá)水平與CD8A、CD8B、CD3D、CD3E、CD2、CD19、CD79A、CD86、CSF1R、CCL2、CD68、IL10、IRF5、PTGS2、CD163、VSIG4、MS4A4A、CEACAM8、NRP1、TBX21、STAT1、IFNG、STAT6、IL13、IL21、STAT5B、TGFB1、PDCD1、CTLA4和LAG3等免疫標(biāo)志物顯著相關(guān)。

表2 HLA-DPB1表達(dá)水平與LUAD腫瘤浸潤(rùn)細(xì)胞免疫標(biāo)志物相關(guān)性分析

進(jìn)一步通過GEPIA數(shù)據(jù)庫驗(yàn)證HLA-DPB1表達(dá)水平與LUAD免疫浸潤(rùn)細(xì)胞之間的相關(guān)性(表2)。我們發(fā)現(xiàn)，HLA-DPB1表達(dá)水平與LUAD浸潤(rùn) CD8+ T細(xì)胞、T細(xì)胞、單核細(xì)胞等顯著相關(guān)。具體而言，HLA-DPB1表達(dá)水平與LUAD免疫標(biāo)志物CD8A、CD8B、CD19、CD79A、CCL2、IRF5、PTGS2、CD163、CEACAM8、NRP1、TBX21、STAT1、IFNG、STAT6、IL13、IL21、STAT5B、TGFB1、PDCD1、CTLA4和LAG3等細(xì)胞免疫標(biāo)志物顯著相關(guān)。GEPIA分析結(jié)果與Timer數(shù)據(jù)庫結(jié)果相一致(表3)，均表明HLA-DPB1在LUAD免疫浸潤(rùn)細(xì)胞中具有重要的調(diào)節(jié)作用，可能是參加腫瘤免疫逃逸過程中的重要部分。

表3 GEPIA數(shù)據(jù)庫中分析HLA-DPB1表達(dá)水平與LUAD免疫浸潤(rùn)標(biāo)志物水平之間的相關(guān)性

討論

腫瘤免疫治療的核心是喚醒體內(nèi)免疫細(xì)胞，通過克服腫瘤免疫逃逸的機(jī)制來清除過度增殖的癌細(xì)胞[18]，包括免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)器、采用細(xì)胞療法、腫瘤抗原疫苗和免疫檢查點(diǎn)抑制劑[19-20]。目前，腫瘤微環(huán)境中的非細(xì)胞成分，如各種激素、可溶性蛋白、趨化因子、分子和細(xì)胞外基質(zhì)等，已成為癌癥發(fā)展的研究重點(diǎn)和熱點(diǎn)[21]。因此，探索并發(fā)現(xiàn)新型生物標(biāo)志物來預(yù)測(cè)LUAD病人預(yù)后，并提供新的治療靶點(diǎn)來改善病人預(yù)后顯得至關(guān)重要。

HLA-DPB1是位于人類第6號(hào)染色體上的主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ級(jí)(major histocompatibility complex,class Ⅱ,MCH Ⅱ) 相關(guān)DPB1區(qū)域的免疫浸潤(rùn)細(xì)胞之一，該區(qū)域具有高度多態(tài)性[22]。HLA-DPB1抗原常表達(dá)于免疫T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等表面，主要通過識(shí)別并結(jié)合相關(guān)肽分子向活化的CD4+ T細(xì)胞提供免疫信息，促進(jìn)其增殖和細(xì)胞毒性，從而在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。有研究報(bào)告證明，HLA-DPB1可以促進(jìn)免疫力，對(duì)血液系統(tǒng)的免疫治療至關(guān)重要[23-24]。與正常乳房樣本相比，HLA-DPB1的mRNA表達(dá)在乳腺癌組織中也有所增加，尤其是在雌激素受體陰性、基底樣變和三陰性乳腺癌狀態(tài)下的乳腺癌組織中。生存分析顯示，升高HLA-DPB1表達(dá)水平預(yù)示著病人有較好的總生存期、無復(fù)發(fā)生存期和遠(yuǎn)處無轉(zhuǎn)移生存期[9]。HLA-DPA1 表達(dá)水平下降與小兒腎上腺皮質(zhì)腫瘤(adult adrenocortical tumors，ACT)患兒的不良預(yù)后顯著相關(guān)。HLA-DPB1低表達(dá)水平與ACT病人短5年無終末生存期相關(guān)。此外，HLA-DPB1是影響ACT病人預(yù)后的獨(dú)立因素[10]。

本研究利用多個(gè)在線數(shù)據(jù)庫分析HLA-DPB1在LUAD中潛在的臨床價(jià)值。我們發(fā)現(xiàn)，HLA-DPB1在LUAD病人腫瘤組織中的表達(dá)下降， 并且HLA-DPB1的低表達(dá)與LUAD病人的臨床病理特征(性別、年齡、吸煙史、腫瘤分期、組織學(xué)亞型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況以及Tp53突變情況)和生存時(shí)間相關(guān)，HLA-DPB1表達(dá)降低的病人預(yù)后較差，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Meta分析進(jìn)一步證實(shí)其結(jié)果的可靠性，表明HLA-DPB1有望成為L(zhǎng)UAD病人治療的新靶點(diǎn)和預(yù)測(cè)預(yù)后的新標(biāo)志。

本研究在Timer和GEPIA數(shù)據(jù)庫中證實(shí)，HLA-DPB1表達(dá)水平與免疫細(xì)胞標(biāo)志物CD8A、CD8B、CD19、CD79A、CCL2、IRF5、PTGS2、CD163、CEACAM8、NRP1、TBX21、STAT1、IFNG、STAT6、IL13、IL21、STAT5B、TGFB1、PDCD1、CTLA4和LAG3 等表達(dá)水平相關(guān)。HLA-DPB1與LUAD免疫浸潤(rùn)關(guān)系密不可分。本研究缺乏臨床LUAD組織標(biāo)本中HLA-DPB1的表達(dá)情況，是研究的不足。本研究結(jié)果表明，HLA-DPB1在LUAD組織中的表達(dá)下降，升高 HLA-DPB1表達(dá)水平有望改善LUAD病人的預(yù)后。HLA-DPB1表達(dá)水平與LUAD免疫浸潤(rùn)細(xì)胞和免疫標(biāo)志物分子水平顯著相關(guān)，預(yù)示著其在LUAD進(jìn)展過程中具有重要的生物學(xué)作用，且為L(zhǎng)UAD病人的治療提供了一個(gè)新的思路。