術(shù)后腸梗阻炎癥進(jìn)展中NR4A1、MAPK及IL-6表達(dá)變化的分析

魏永， 張俊榕， 潘杰， 翁宗奇， 陳先強(qiáng)

術(shù)后腸梗阻(postoperative ileus, POI)是外科術(shù)后常見的并發(fā)癥，發(fā)生率為10%～30%[1-2]。POI的發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜，至今尚未完全闡明，其中炎癥反應(yīng)是POI的主要機(jī)制。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)14和MAPK3是炎癥反應(yīng)中最重要的激酶之一，參與炎癥反應(yīng)的發(fā)生、發(fā)展并發(fā)揮調(diào)控作用。NR4A1(nuclear receptor subfamily 4， group A-1)是孤核受體家族之一，是免疫穩(wěn)態(tài)的重要調(diào)節(jié)因子。多種細(xì)胞外刺激因素，如缺氧、炎癥、細(xì)胞應(yīng)激等可誘導(dǎo)NR4A1快速表達(dá)[3-4]。已有研究表明，NR4A1作為一種響應(yīng)蛋白，在信號傳導(dǎo)的早期發(fā)揮作用，可調(diào)控MAPK激酶和炎癥因子的表達(dá)，從而參與炎癥反應(yīng)[5-6]。本研究擬建立大鼠POI模型，檢測NR4A1、MAPK14、MAPK3和白細(xì)胞介素6(interleukin， IL-6)的表達(dá)，探討NR4A1調(diào)控POI炎癥反應(yīng)的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 18只健康雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠，體質(zhì)量(180±20) g，福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[動(dòng)物批號：SCXK(閩)2016-0002]飼養(yǎng)(普通飼料飼養(yǎng)，溫度20～26 ℃，濕度40%～70%)。本研究已獲得福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2 主要試劑 CytosporoneB (CAS321661-82-5，美國Glpbio公司)；NR4A1(DF7850，江蘇Affinity公司)；MAPK14(別名p38α， ab170099，英國Abcam公司)；MAPK3(別名ERK1,16443-1-AP，美國Proteintech公司)；IL-6酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)ELISA(MM-0190R1，武漢Elabscience公司)；TUNEL檢測試劑盒(C1088，上海碧云天公司)。

1.2 方法

1.2.1 POI造模 大鼠術(shù)前禁食12 h，可飲水。2%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔注射麻醉。麻醉后四肢固定于手術(shù)臺上，腹部備皮后碘伏消毒鋪巾。做下腹部正中線長約3 cm切口，依次切開皮膚、腹壁肌肉后進(jìn)腹。取出全部小腸外置于兩層濕紗布間，用鹽水濕紗布由小腸末端自下而上擦拭腸管至幽門環(huán)，反復(fù)6次，用時(shí)10 min，期間注意防止損傷腸系膜血管。將全部腸管放回腹腔，注意理順小腸，防止其扭轉(zhuǎn)。1-0絲線分層連續(xù)縫合肌肉及皮膚關(guān)腹。假手術(shù)組大鼠腹部只做進(jìn)腹和關(guān)腹處理。動(dòng)物麻醉清醒后禁食不禁水，注意保溫。

1.2.2 動(dòng)物分組 將18只SD大鼠數(shù)字隨機(jī)分成3組：假手術(shù)組、模型組(POI模型)和激動(dòng)劑組(POI模型+CytosporoneB)，每組6只。激動(dòng)劑組大鼠術(shù)前1 h腹腔注射CytosporoneB (13 mg/kg)；假手術(shù)組和模型組大鼠術(shù)前1 h腹腔注射同等劑量磷酸鹽緩沖液。飼養(yǎng)48 h后大鼠進(jìn)行1 mL墨汁灌胃處理，灌胃后30 min麻醉各組大鼠，開腹觀察小腸形態(tài)，測量小腸推進(jìn)率，取腹主動(dòng)脈血液和距離盲腸10 cm的一段回腸組織樣本做相關(guān)指標(biāo)檢測。

1.2.3 腹腔內(nèi)小腸形態(tài)情況 打開腹腔，肉眼觀察小腸形態(tài)情況，包括腸管有無積氣、積液、充血、水腫。

1.2.4 小腸推進(jìn)率測量 將不同組大鼠處死后取出整段小腸(保留胃、盲腸)，測量小腸長度L1及幽門到墨汁最遠(yuǎn)處的距離L2，計(jì)算小腸推進(jìn)率：

小腸推進(jìn)率=(L2/L1)×100%

1.2.5 組織病理學(xué)檢查 將腸組織固定于4%甲醛溶液，乙醇脫水、石蠟包埋、切片，蘇木精-伊紅(hematoxylin and eosin， H-E)染色。采用光學(xué)顯微鏡觀察腸道組織的病理改變。

1.2.6 TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡情況 石蠟切片預(yù)處理準(zhǔn)備、烤片、脫蠟、水化、修復(fù)、洗滌，加TUNEL檢測液、封片鏡檢。

1.2.7 免疫組織化學(xué)檢測NR4A1表達(dá) 石蠟切片烤片、脫蠟、水化、修復(fù)、洗滌、一抗NR4A1(1∶100)磷酸鹽緩沖液浸洗玻片，辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)(1∶100)，磷酸鹽緩沖液充分淋洗。DAB顯色、蘇木精復(fù)染、鹽酸酒精分化、返藍(lán)、脫水、透明、封片、鏡檢。

1.2.8 免疫熒光檢測MAPK14和MAPK3表達(dá) 石蠟切片包埋、切片脫臘水化、抗原修復(fù)、通透、封閉、一抗孵育MAPK14 (1∶150)和MAPK3 (1∶50)、熒光二抗cy3 (1∶150)、復(fù)染核、封片。

1.2.9 ELISA法檢測IL-6水平 取大鼠血液及回腸組織樣本進(jìn)行處理，分離血漿，采用雙抗夾心法加樣、加酶、溫育，覆膜置于37 ℃溫箱60 min，配液，洗滌，甩干，洗滌5次，拍干，加入顯色劑，37 ℃避光顯色，加終止液，酶標(biāo)儀分析。

2 結(jié) 果

2.1 免疫組織化學(xué)檢測腸組織中NR4A1蛋白表達(dá)情況 假手術(shù)組中可見大量NR4A1蛋白，呈棕黃色。與假手術(shù)組比較，模型組中的棕黃色程度明顯減少，僅少數(shù)陽性顆粒在細(xì)胞核中表達(dá)，NR4A1蛋白表達(dá)明顯降低；與模型組比較，激動(dòng)劑組中的棕黃色程度明顯增加，NR4A1蛋白表達(dá)明顯升高(圖1)。

A：假手術(shù)組；B：模型組；C：激動(dòng)劑組。NR4A1：孤核受體。圖1 大鼠腸組織NR4A1表達(dá)Fig.1 Expression of NR4A1 in intestinal tissue of rats

2.2 腸組織病理形態(tài)學(xué)、細(xì)胞凋亡及小腸推進(jìn)率情況

2.2.1 病理形態(tài)學(xué) 假手術(shù)組為正常的腸組織結(jié)構(gòu)，無明顯形態(tài)改變。與假手術(shù)組比較，模型組的腸組織水腫嚴(yán)重，細(xì)胞邊界不清，具有大量炎性細(xì)胞浸潤；與模型組比較，激動(dòng)劑組的腸組織炎性浸潤程度具有明顯的改善(圖2A)。

2.2.2 TUNEL檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果 與假手術(shù)組比較，模型組腸組織中細(xì)胞凋亡明顯升高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，激動(dòng)劑組腸組織中細(xì)胞凋亡明顯降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖2B)。

2.2.3 小腸推進(jìn)率情況 與假手術(shù)組比較，模型組中小腸推進(jìn)率顯著降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.000 1)；與模型組比較，激動(dòng)劑組小腸推進(jìn)率顯著提高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.000 1，圖2C)。

DAPI：4，6-二脒基-2-苯基吲哚；Apoptotic cell：凋亡細(xì)胞；Merge：融合。Sham：假手術(shù)組；Model：模型組；Stimulator：激動(dòng)劑組。A：病理H-E染色；B：細(xì)胞凋亡；C：小腸推進(jìn)率。與Sham組比較，△：P<0.01，△△△： P<0.000 1；與Model組比較，△：P<0.01，△△△：P<0.000 1。圖2 腸組織病理學(xué)檢查、細(xì)胞凋亡及小腸推進(jìn)率情況Fig.2 Pathological examination of intestinal tissue, apoptosis and small intestine propulsion rate

2.3 免疫熒光檢測MAPK14和MAPK3的表達(dá) 與假手術(shù)組比較，模型組中MAPK14和MAPK3顯著上調(diào)，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.000 1)；與模型組比較，激動(dòng)劑組中MAPK14和MAPK3顯著下調(diào)，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.000 1)。MAPK14和MAPK3激活下可誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，NR4A1激動(dòng)劑顯著抑制MAPK14和MAPK3的表達(dá)，進(jìn)而抑制炎癥因子(圖3)。

DAPI：4，6-二脒基-2-苯基吲哚；Merge：融合；MAPK：絲裂原活化蛋白激酶；ERK:細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶。Sham：假手術(shù)組；Model：模型組；Stimulator：激動(dòng)劑組。A：MAPK14表達(dá)；B：MAPK3表達(dá)。與Sham組比較，△△△：P<0.000 1；與Model組比較，△△△：P<0.000 1。圖3 腸組織MAPK14和MAPK3表達(dá)情況Fig.3 Expression of MAPK14 and MAPK3 in intestinal tissue

2.4 IL-6含量水平變化 與假手術(shù)組比較，模型組血漿和腸組織中IL-6含量升高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.000 1)；與模型組比較，激動(dòng)劑組血漿和腸組織中IL-6的含量降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.000 1，P<0.001，圖4)。

IL-6：白細(xì)胞介素6。Sham：假手術(shù)組；Model：模型組；Stimulator：激動(dòng)劑組。A：血漿；B：腸組織。與Sham組比較，△△△：P<0.000 1；與Model組比較，△△：P<0.001；△△△：P<0.000 1。圖4 血漿和腸組織IL-6含量水平Fig.4 IL-6 level of plasma and intestinal tissue

3 討 論

POI是腹部外科手術(shù)后常見的并發(fā)癥，與手術(shù)創(chuàng)傷程度、炎癥反應(yīng)、術(shù)后疼痛、阿片類藥物、應(yīng)激等多因素有關(guān)[7]。POI的主要臨床表現(xiàn)為腹脹、惡心、嘔吐、腹痛不明顯及肛門停止排氣、排便等癥狀。POI可導(dǎo)致患者推遲進(jìn)食時(shí)間、延長住院時(shí)間、降低手術(shù)療效及增加額外醫(yī)療費(fèi)用等。雖然微創(chuàng)技術(shù)持續(xù)發(fā)展，手術(shù)方法也不斷改進(jìn)，但POI仍不可避免發(fā)生。

POI發(fā)生和發(fā)展的機(jī)制十分復(fù)雜，涉及多方面因素相互作用，分為早期階段和持續(xù)階段。POI的持續(xù)階段主要是腸組織炎癥反應(yīng)作用，其持續(xù)時(shí)間與腸肌層炎癥反應(yīng)的程度呈正相關(guān)[8]。抑制炎癥反應(yīng)是防治POI最直接和最有效的方法。POI的炎癥反應(yīng)機(jī)制涉及多個(gè)信號傳導(dǎo)通路共同作用。手術(shù)操作刺激胃腸道1 h即可激活細(xì)胞內(nèi)MAPK14(p38α)、MAPK3(ERK1)、JNK/SAP等炎癥反應(yīng)相關(guān)的信號通路，引起一系列連鎖反應(yīng)，導(dǎo)致腸道部位的巨噬細(xì)胞和肥大細(xì)胞激活和核轉(zhuǎn)錄因子的活化，從而產(chǎn)生和釋放大量IL-6、TNF-α及IL-1等促炎細(xì)胞因子和趨化因子，其中IL-6 在炎癥反應(yīng)中具有廣泛的影響。IL-6等促炎因子激活中性粒細(xì)胞，引起腸道的炎癥反應(yīng)，最終導(dǎo)致POI的發(fā)生[9-11]。ZHU等[12]發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌術(shù)后發(fā)生POI患者的腹腔引流液中IL-6、TNF-α等炎癥因子含量水平明顯升高，腹腔炎癥因子可預(yù)測POI的發(fā)生及持續(xù)時(shí)間。ZHANG等[13]發(fā)現(xiàn)，激活p38MAPK、ERK1/2信號通路可誘導(dǎo)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，抑制p38可降低IL-6和TNF-α表達(dá)水平，抑制ERK1/2可降低IL-6表達(dá)水平。WEHNER等[10]的研究表明，抑制小腸常駐巨噬細(xì)胞中p38信號通路可以有效預(yù)防POI。XIONG等[14]的研究發(fā)現(xiàn)，通過阻斷p38/MK2信號通路可以有效地抑制小鼠POI中炎癥因子表達(dá)，減少炎癥細(xì)胞的浸潤，從而減輕腸道炎癥。因此，通過抑制MAPK信號通路，可以預(yù)防或減輕POI炎癥反應(yīng)，改善腸梗阻癥狀。

NR4A1屬于孤核受體家族的重要一員，參與多種細(xì)胞過程，包括增殖、分化、凋亡、代謝和發(fā)育。NR4A1在免疫穩(wěn)態(tài)、動(dòng)脈粥樣硬化、代謝類疾病、腫瘤的發(fā)生、發(fā)展等過程中扮演著重要角色[15-16]。最近有研究表明，NR4A1在炎癥反應(yīng)中具有負(fù)性調(diào)節(jié)作用[5-6,17]。NR4A1是一種磷酸化的蛋白。磷酸化可以調(diào)節(jié)NR4A1的活性，在刺激或炎癥反應(yīng)時(shí)可激活MAPK激酶，導(dǎo)致NR4A1的磷酸化。NR4A1處于失活狀態(tài)，促進(jìn)核因子NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，與 NF-κB位點(diǎn)結(jié)合，促進(jìn)下游細(xì)胞因子IL-6、TNF-α釋放大量炎癥因子，進(jìn)一步導(dǎo)致局部或全身炎癥反應(yīng)[18-19]。NR4A1在巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞中表達(dá)降低，而炎癥因子(如IL-1和IL-6)表達(dá)升高[3-4]。HAMERS等[20]發(fā)現(xiàn)，NR4A1通過抑制p38MAPK和NF-κB表達(dá)而降低ET-1水平，ARDS大鼠肺組織中NR4A1表達(dá)明顯降低，NR4A1激動(dòng)劑CytosporoneB減輕了ARDS的炎癥和損傷。ANOUK等[21]發(fā)現(xiàn)，小鼠結(jié)腸炎模型中敲除NR4A1基因，結(jié)腸炎癥明顯加重，激活NR4A1表達(dá)可減輕結(jié)腸炎癥。本研究結(jié)果顯示，大鼠POI腸組織中NR4A1表達(dá)明顯降低，MAPK14、MAPK3及IL-6的表達(dá)顯著升高；CytosporoneB激活NR4A1表達(dá)可顯著降低MAPK14、MAPK3及IL-6表達(dá)，減輕腸組織的炎癥和水腫，提高小腸推進(jìn)率。

綜上所述，大鼠POI腸組織中NR4A1低表達(dá)在炎癥反應(yīng)及POI進(jìn)展中起著重要作用。激活NR4A1表達(dá)可減輕POI腸組織炎癥和緩解梗阻癥狀，其作用機(jī)制可能與通過抑制MAPK信號通路有關(guān)。