基于網絡藥理學和分子對接探討斑蝥復方制劑治療宮頸癌的作用機制#

文靜 劉霜飛 丁逸 徐琴 王杉 周晴 羅宇航 魏瑩

（1.川北醫(yī)學院藥學院，四川 南充 637100；2.川北醫(yī)學院臨床醫(yī)學系，四川 南充 637100；3.川北醫(yī)學院基礎醫(yī)學院，四川 南充 637100）

宮頸癌主要由感染人乳頭瘤病毒（Human papilloma virus，HPV）引起，是最常見的婦科惡性腫瘤，該病死亡率高，且發(fā)病率呈逐年上升趨勢，是全球面臨的一項重大公共衛(wèi)生挑戰(zhàn)[1]。目前臨床常采用以手術和放療為主、化療為輔的綜合治療方案[2]。中醫(yī)藥具有多靶點、多途徑、多環(huán)節(jié)以及整體調控的特點，對HPV的治療具有一定的優(yōu)勢，臨床實踐表明，治療HPV中藥方劑的成方規(guī)律為抗癌解毒藥與補氣藥為主，補血藥與活血化瘀藥為輔[3]。

斑蝥復方制劑具有扶正祛邪、抗腫瘤和免疫調節(jié)作用[4]，在臨床主要與手術、化療聯合使用起到臨床輔助治療的效果，增強抗癌作用，減輕化療藥物的毒副反應。

本研究基于網絡藥理學方法[5]聯合分子對接技術研究斑蝥復方制劑的活性成分及潛在作用機制，以期為后續(xù)斑蝥復方制劑治療HPV的體內外研究及新藥的開發(fā)提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 斑蝥復方制劑活性成分和潛在作用靶點的篩選

通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php），以斑蝥復方制劑主要組成藥物斑蝥、黃芪、人參為關鍵詞檢索TCMSP數據庫，并以口服生物利用度（Oral bioavailability，OB）≥30%和類藥性（Drug-likeness，DL）≥0.18為篩選條件，獲取藥物的主要活性成分。利用Uniprot數據庫對靶點進行標準化處理，獲取相應的基因名稱、基因ID。

1.2 疾病靶點的獲取及疾病-藥物靶點的Venn分析

以“Tumors or cancer of the UTERINE CERVIX”和“Uterine Cervical Neoplasms”為關鍵詞，挖掘genecards（https://www.genecards.org）、OMIM（https://omim.org/）兩大數據庫中的潛在靶點。以Relevance score≥15篩選得到疾病靶點。將疾病靶點與藥物靶點同時導入BioVenn（http://www.biovenn.nl/index.php）獲取交集靶點。

1.3 蛋白質相互作用網格（PPI）的構建和關鍵靶點的分析

將交集靶點導入STRING數據庫（https://string-db.org/）構建PPI網格模型，設置生物種屬為“Homo sapiens”，最低相互作用評分為“highest confidence(>0.900)”。使用Cytoscape3.8.2可視化，利用CytoNCA對網格進行拓撲分析。

1.4 生物功能與通路分析

將交集靶點導入Metascape平臺進行GO功能和KEGG通路分析，在生物信息學平臺（http://www.bioinformation.com .cn/）上繪制GO和KEGG富集分析的氣泡圖進行可視化。

1.5 “藥物-成分-靶點-通路”網格的構建

以3種中藥、34種活性成分和110個交集靶點與顯著富集的20條通路為原數據，應用Cytoscape3.8.2構建“藥物-成分-靶點-通路”網格并隱藏無相互作用的節(jié)點。

1.6 活性成分與靶點的分子對接驗證

利用AutoDock Tools 1.5.6進行分子對接，以驗證其相互作用活性。從TCMSP下載活性成分的mol2格式文件。在PDB數據庫（http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do）中下載核心靶點的3D結構，通過Pymol軟件執(zhí)行去水、加氫等操作。運用AutoDock程序進行分子對接并計算結合能，對接結果采用Discovery studio進行可視化。

2 結果

2.1 復方斑蝥制劑活性成分與藥物靶點的預測

在TCMSP數據庫檢索出斑蝥、黃芪、人參的活性成分，經過OB≥30%和DL≥0.18的限定，再剔除無對應靶點的成分，最終得到34種活性成分。其中斑蝥1種，人參和黃芪各17種，合并去重，最終確定211個藥物靶點，見表1。

表1 斑蝥復方制劑候選化合物信息表

2.2 疾病-藥物靶點的獲取

經GeneCards、OMIM兩大數據庫篩選去重，共獲取1218個宮頸癌相關靶點。疾病-藥物靶點進行韋恩分析后，獲得110個交集靶點，見圖1。

圖1 斑蝥復方制劑藥物靶點與疾病靶點的交集分析

2.3 PPI網格分析

度值越高的靶點越接近同心圓的中心，其體積越大。靶點重要性與度值成正相關，分析十個核心靶點，如表2。TP53度值最高，能與34個靶點相關聯。其次是AKT1，與32個靶蛋白相關聯。

表2 斑蝥復方制劑治療宮頸癌的主要靶點及拓撲參數

2.4 GO和KEGG富集分析

以P≤0.001為參考標準，GO富集分析得到367條生物過程，18項分子功能相關，4項細胞組成相關。圖2列舉了富集最顯著的10個條目。GO分析中生物過程主要涉及對無機物的反應、凋亡信號通路等。細胞組成涉及轉錄調節(jié)因子復合物、受體復合物等。分子功能主要涉及DNA結合轉錄因子結合、細胞因子受體結合等。

圖2 斑蝥復方制劑抗宮頸癌交集靶點的GO功能富集分析

KEGG富集分析以P≤0.01為參考標準，共富集得到256條通路，圖3列舉了P值排名前20的富集通路。人類疾病相關通路、炎癥和免疫相關通路、內分泌代謝通路均參與宮頸癌的病理發(fā)展。癌癥通路，IL-17信號通路，PI3K-Akt信號通路均與較多核心靶點相關聯，推測其在宮頸癌的潛在治療機制中發(fā)揮著重要作用。

2.5 “藥物-成分-靶點-途徑”網絡分析

藥物-成分-靶點-途徑網絡如圖4所示。據網格分析，主要靶點為PTGS2、PTGS1、HSP90AA1、RELA、AKT1等。槲皮素作用于76個靶點，是復方斑蝥制劑治療宮頸癌最主要的活性成分。癌癥途徑和PI3K-Akt信號通路是最主要的兩個信號通路。暗示出斑蝥復方制劑治療宮頸癌的多組分、多靶點、多通路特點。

2.6 分子對接

“藥物-成分-靶點-通路”網格圖中度值排名靠前的6種活性成分與PPI網格中度值較高的7個靶點進行分子對接，結果見圖6。一般認為，結合能越低，分子結構越穩(wěn)定。對接結果顯示，β谷甾醇與HSP90AA1的結合能最低，為-6.13KJ?mol-1。其次是JUN和異鼠李堿，結合能為-5.86KJ?mol-1。β谷甾醇和芒柄花素與多個靶點均有較好的結合能力，JUN和HSP90AA1是結合能力最顯著的靶點。分子對接構象和相互作用見圖5。

圖6 結合自由能的熱圖

3 討論

斑蝥復方制劑多由斑蝥、人參、黃芪、剌五加等中藥組成，臨床已使用多年。斑蝥在古代已有使用，但其毒性甚大，應用受到限制[6]。如今先進的現代技術使得斑蝥復方制劑的抗腫瘤效果得到了廣泛的認同[7-9]。

臨床研究表明，斑蝥素可減弱Hela宮頸癌細胞遷移和侵襲[10]，宮頸癌患者應用復方斑蝥膠囊聯合化療，能顯著提高患者生命質量[11]等。本研究運用網絡藥理學方法，初步探討斑蝥復方制劑各成分在機體分子層面的生物靶點，推測藥物的效應機制，闡釋其抗宮頸癌的作用機制。

本研究選擇了斑蝥復方制劑中的斑蝥，人參，黃芪三味主要藥物進行分析，推測槲皮素、山奈酚、β谷甾醇等為治療宮頸癌的核心成分。槲皮素（Quercetin）具有良好的抗腫瘤活性[12]，可不同程度地抑制宮頸癌Hela細胞增殖，且呈時間和濃度依賴性[13-14]。山奈酚（Kaempferol）能抑制ERK/MAPK通路和PI3K-AKT通路誘導腫瘤細胞凋亡[15-16]，這也與本研究結論相映襯。而β谷甾醇（beta-sitosterol）能通過介導AMPK、PTEN和HSP90發(fā)揮抗腫瘤作用[16]，其抗宮頸癌的栓劑已經用于臨床[17]。

本研究得到了斑蝥復方制劑治療宮頸癌的核心靶點，包括TP53、HSP90AA1等。李志強等研究發(fā)現TP53的表達特點在宮頸癌的術后復發(fā)中有重要的預測價值[18]。同時TP53調控通路中P53基因單核苷酸多態(tài)性與HPV相關宮頸癌遺傳易感性相關[19-20]。本研究顯示，兩大網格中HSP90AA1均具有很高的度值，其與多個活性成分均有較低的結合能。研究表明，宮頸癌組織中檢測到高水平的Hsp90[21]，且抑制Hsp90可有效誘導宮頸癌細胞凋亡[22]。

通過GO功能和KEGG通路富集分析，本研究發(fā)現靶點參與多種生物過程來抑制宮頸癌細胞的增殖、分化，促進細胞凋亡。KEGG通路主要富集于癌癥相關途徑、IL-17信號通路、PI3K-Akt信號通路。Simone Punt指出Tregs和IL-17+細胞數量少與宮頸癌特異性生存率低相關[23]，Th17細胞和IL-17在高危HPV感染中，可起到增強免疫力的作用[24]。而PI3K/AKT/mTOR途徑被認為是一個有前途的抗癌治療靶點，在病毒/宿主細胞串擾中起關鍵作用[25]。

本研究運用網絡藥理學方法探討了斑蝥復方制劑治療宮頸癌的活性成分、靶點以及作用機制，為后續(xù)斑蝥復方制劑治療宮頸癌的分子機制及新藥的開發(fā)提供新的思路。但由于數據庫的數據在不斷更新，部分數據尚不全面，不能覆蓋所有中藥、靶點、通路。所以本研究結論尚有一定的局限性，其具體機制還需更深入的研究。