石油污染對蘆葦根際細菌群落組成和多樣性的影響

潘 林,曹 瑞,焦德志

(齊齊哈爾大學生命科學與農(nóng)林學院，抗性基因工程與寒地生物多樣性保護黑龍江省重點實驗室，161006，黑龍江齊齊哈爾)

隨著世界經(jīng)濟的不斷增長，石油的需求日益增加；然而，在石油生產(chǎn)和運輸過程中因意外導致的石油泄露會對環(huán)境造成嚴重的破壞[1]，并通過污染地下水系等間接方式危及人類健康[2]。石油中黏度較大的烴類化合物進入土壤后可導致土壤板結(jié)，并且石油中的大量疏水性化合物阻礙植物對水的吸收，影響植物生長發(fā)育，破壞植物根部固土作用，最終導致水土流失。石油可以增加土壤有機質(zhì)含量，提高土壤碳氮元素的比值，然而石油中的碳元素與土壤原本的碳和植物光合作用所需要碳不同，因此雖然石油可以給土壤提供大量的碳元素，但依舊會造成土壤營養(yǎng)失調(diào)[3]。有學者在比較石油污染土壤理化性質(zhì)影響時發(fā)現(xiàn)，石油污染能增加土壤中有機碳含量、pH、碳氮和碳磷比值，而總氮含量與電導率無顯著變化[4]。石油污染能促進土壤中具有降解石油烴能力的真菌、細菌等微生物的生長，提高其在土壤中的豐度和多樣性[5]。石油污染也會對土壤微生物的活性和數(shù)量有一定抑制作用，降低植物叢植菌根真菌的產(chǎn)孢能力[6]。這主要與石油污染物的組成和土壤中微生物群落結(jié)構(gòu)有關[7]。石油污染會改變土壤營養(yǎng)成分的組成，會導致與硝化作用有關和厭氧類微生物數(shù)量降低，使有氧硝化細菌豐度升高。石油污染也會對固氮細菌和放線菌產(chǎn)生較大的影響[8-9]。

蘆葦是濕地的重要植被，具有很強的抗逆性，并且是防治水土流失，用于濕地修復的主要植物材料。蘆葦在適應高度異質(zhì)性生境的過程中，其形態(tài)、生理、生活史策略等會發(fā)生改變，形成不同的生態(tài)型[10]。植物根際微生物可以通過固氮、解磷、降解土壤有害物質(zhì)、抑制土壤中病原菌等方式促進植物生長，幫助植物抵抗毒害物質(zhì)脅迫[11]。蘆葦根系可以改善根際土壤物理性質(zhì)和孔隙度，增加土壤滲透性和水源涵養(yǎng)能力[12]。

筆者以扎龍濕地蘆葦及其原位土壤為材料，采用盆栽方式人工模擬石油污染，利用高通量測序技術分析和比較蘆葦根際土壤中微生物的群落組成，揭示蘆葦根際微生物群落結(jié)構(gòu)的以及對石油污染的響應，有助于完善石油污染下蘆葦-根際微生物-土壤三者的之間相互作用的生態(tài)學理論，并為蘆葦在石油污染土壤中維持根系固土能力和恢復水土調(diào)控技術提供科學依據(jù)。

1 研究區(qū)概況

蘆葦根莖和土壤于采自扎龍濕地(E 124°9′1″、N 47°17′18″)，樣地年均氣溫3.2 ℃，年日照時間2 700～3 000 h，平均地溫4.9 ℃。石油來自大慶油田。

2 材料與方法

2.1 模擬石油污染

實驗設計3個處理組，石油質(zhì)量分數(shù)分別為T1(3 g/kg)、T2(6 g/kg)、T3(12 g/kg)，對照組CK(0 g/kg)，按照土壤質(zhì)量(15 kg)稱取石油于燒杯中，加入適量石油醚，使石油完全溶解后，混勻后置于塑料花盆中，加入1 L水，靜置24 h，每盆橫向定植5條新鮮蘆葦根莖。培養(yǎng)60 d后，采用抖根法收集蘆葦根際土壤，一部分4 ℃保存，用于土壤理化性質(zhì)的測定，另一部分-20 ℃保存，用于高通量測序。

2.2 蘆葦根際土壤理化性質(zhì)的測定

將采集的土壤風干后，研磨，過2 mm篩，土壤pH值、銨態(tài)氮、有效鉀和速效磷含量采用土壤養(yǎng)分分析儀(比色法)測定，有機質(zhì)質(zhì)量分數(shù)利用重鉻酸鉀稀釋熱法測定[13]。

2.3 蘆葦根際微生物DNA的提取和高通量測序

Illumina Miseq高通量測序由生工生物工程(上海)公司完成，主要步驟為根據(jù)E.Z.N.A.Soil DNA Kit 試劑盒操作步驟提取土壤中微生物總DNA，進行PCR擴增(341F引物：CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTG；805R引物：GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA；擴增條件見圖1),經(jīng)純化回收以及定量混合后進行上機測序。

圖1 PCR擴增反應條件Fig.1 Conditions for PCR amplification

使用FLASH(版本1.2.3)和Prinseq(版本0.20.4)軟件對測序數(shù)據(jù)進行拼接和質(zhì)量控制后，使用R(版本3.2)和MEGAN(版本5.7.1)軟件進行分析。對比數(shù)據(jù)庫為RDP classifier(16s fungal 28s),Silva(16s,18s),Unite。

3 結(jié)果與分析

3.1 對土壤理化性質(zhì)的影響

土壤pH是土壤鹽堿化程度的重要指標之一，土壤中有機質(zhì)、銨態(tài)氮、有效鉀，速效磷等含量與土壤肥力有著密切關系。3種質(zhì)量分數(shù)石油處理60 d后，土壤理化性質(zhì)如表1所示，可知，各處理組(T1-T3)土壤的pH和有效鉀含量與對照組(CK)間差異均未達到顯著水平(P>0.05)，各處理組的銨態(tài)氮、速效磷和有機質(zhì)質(zhì)量分數(shù)的均值分別顯著(P<0.05)高于對照組，分別提高41%、121%和141%。因此，不同質(zhì)量分數(shù)的石油污染對土壤的pH和有效鉀含量影響不大，但顯著提高銨態(tài)氮、速效磷和有機質(zhì)質(zhì)量分數(shù)。

表1 石油污染后土壤的理化性質(zhì)Tab.1 Physicochemical properties of soil after petroleum pollution

3.2 OTU聚類分析

在97%的相似水平下，統(tǒng)計不同石油處理下蘆葦根際土壤中操作分類單元(operational taxonomic units,OTU)數(shù)量，由圖2可知，4個實驗組(CK、T1、T2和T3)的蘆葦根際土壤樣本中分別檢測到3 482、2 844、3 311和3 336個OTU，其中共有的OTU為1 200個，特有的OTU分別為556、412、446和569，分別占CK、T1、T2、T3蘆葦根系土壤樣本總OTU的15.96%、14.48%、13.47%、17.05%。

圖2 不同石油處理后根際細菌OTU韋恩圖Fig.2 OTU Venn profile of rhizosphere bacteria after different treatments of petroleum

3.3 對蘆葦根際細菌Alpha多樣性的影響

通過Illumina Miseq高通量測序分析蘆葦根際細菌alpha多樣性，結(jié)果如表2所示，分別獲得37 688～51 552條序列，OTU數(shù)為2 844～3 482個。Chao1指數(shù)在生態(tài)學中常用來估計物種總數(shù)，Shannon指數(shù)是用來估算樣本中微生物多樣性，Shannon值越大，說明群落多樣性越高。結(jié)果顯示T1處理的蘆葦根際土壤中Chao1和Shannon指數(shù)最低，說明T1處理蘆葦根際土壤中細菌總數(shù)最少，細菌多樣性最低，T3處理的細菌數(shù)和多樣性為最高。

表2 不同石油處理根際細菌Alpha多樣性指數(shù)Tab.2 Comparisons of α-diversity of rhizosphere bacteria after different treatments of petroleum

3.4 對蘆葦根際細菌群結(jié)構(gòu)的影響

蘆葦根際土壤測序共獲得33個門，不同石油處理蘆葦根際土壤門分類水平下菌群組成和豐度情況如圖3所示。Proteobacteria是蘆葦根際土壤的優(yōu)勢菌門，在CK、T1、T2、T3中的相對豐度分別為37.31%、45.97%、46.6%、46.26%。其次為Actinobacteria、Acidobacteria、Gemmatimonadetes、Bacteroidetes、Chloroflexi、Firmicutes、Planctomycetes、Verrucomicrobia在各處理組中這些門的細菌數(shù)合計占各處理組比例分別為50.53%、44.59%、39.5%、45.68%。

圖3 不同石油處理后根際土壤細菌門分類豐度統(tǒng)計Fig.3 Abundance statistics of bacterial phylum classification in rhizosphere soil after different treatments of petroleum

由圖4可知，在屬水平上，根際土壤中測得111屬細菌，其中優(yōu)勢菌(相對豐度大于1%)有23種。優(yōu)勢菌中有些隨著石油質(zhì)量分數(shù)的增加相對豐度上升，例如：Pseudomonas(1.87%～6.34%)、Hydrogenophaga(0.11%～4.49%)、Nitriliruptor(0.58%～1.66%)；有些細菌相對豐度隨石油含量的升高而下降：Exiguobacterium(3.33%～1.88%)、Rhodoligotrophos(2.44%～1.09%)、Citrobacter(2.05%～0.93%)、Aridibacter(1.63%～0.72%)、Azoarcus(2.59%～0.61%)、Gp21(1.62%～0.23%)、Mongoliicoccus(1.48%～0.15%)；Desulfuromonas、Bellilinea相對豐度隨著石油質(zhì)量分數(shù)的升高呈先上升后下降；Gp6，Gp16相對豐度無顯著變化。

圖4 不同石油處理后根際微生物群落結(jié)構(gòu)和相對豐度Fig.4 Community structures and relative abundances of rhizosphere bacteria after different treatments of petroleum

3.5 對蘆葦根際細菌群落Beta多樣性的影響

通過主成分分析(PCA)比較不同質(zhì)量分數(shù)石油污染下蘆葦根際微生物群落Beta多樣性，結(jié)果如圖5所示。其中主成分1(PCA1)可解釋變量為68%，主成分2(PCA2)可解釋變量為11%,可見T1、T2、T3相互距離較近，能夠聚集，CK與其他3組距離較遠，并且隨著加入石油質(zhì)量分數(shù)的增加，各處理組距離CK越來越遠。說明石油是改變各樣本菌群Beta多樣性主要因素，石油處理后的各樣本菌群落多樣性之前表現(xiàn)出相似性，而無石油處理的對照組與處理組存在明顯差異。

圖5 不同石油處理后根際細菌群落組成PCA分析Fig.5 PCA analysis of the microbial community in the rhizosphere after different treatments of petroleum

4 討論

4.1 對土壤理化性質(zhì)的影響

土壤理化性質(zhì)是植物和微生物生存的重要影響因子。土壤的酸堿性對土壤肥力、植物和微生物生長有顯著影響，若土壤pH過低或過高，均會導致土壤結(jié)構(gòu)性變差，使土壤黏重、板結(jié)、水、氣熱不協(xié)調(diào)，不利于耕作和植物生長[13]。石油污染會影響土壤理化性質(zhì)，在研究安塞縣8個類型油井周圍土壤石油污染理化性質(zhì)時發(fā)現(xiàn)，石油污染會導致pH值、速效磷、速效鉀含量顯著降低，有機質(zhì)和銨態(tài)氮含量顯著升高[14]。也有學者人研究發(fā)現(xiàn)，石油污染使土壤有機質(zhì)含量增加，pH降低，而對速效磷，銨態(tài)氮，速效鉀無顯著影響[15]。石油污染引起土壤pH值變化的主要原因與微生物降解石油烴的酸性中間產(chǎn)物有關[16]。本研究土壤屬于堿性較強土壤，經(jīng)過不同質(zhì)量分數(shù)石油污染后，pH值未發(fā)生顯著差異。這可能是分解石油的微生物受到土壤堿性的影響，使分解石油烴的速率低，產(chǎn)生的酸性物質(zhì)較少，而土壤具有一定的緩沖作用，蘆葦根系也具有富集和吸收污染物的能力，因此使得土壤pH未能有顯著變化。不同產(chǎn)地的石油組分存在差異，低硫高氮是中國油田所產(chǎn)石油的主要特點[17]。本實驗結(jié)果顯示銨態(tài)氮和速效磷含量在石油處理后顯著升高，但在不同石油質(zhì)量分數(shù)處理下無顯著差異，有效鉀含量不隨石油質(zhì)量分數(shù)升高而發(fā)生改變。這可能與實驗所用石油組分中富含氮、磷元素，而鉀元素含量較少有關。氮、磷元素是制約石油生物降解速率的關鍵因子之一，微生物通過消耗土壤中的氮、磷營養(yǎng)物質(zhì)提高石油的降解效率，導致銨態(tài)氮和有效磷含量在不同石油質(zhì)量分數(shù)處理下無顯著變化[18-19]。本實驗結(jié)果顯示土壤中有機質(zhì)含量隨著石油質(zhì)量分數(shù)的增加而升高，這是由于石油中含有大量烴類物質(zhì)，當石油進入土壤后，烴類物質(zhì)作為碳源，增加了土壤中有機質(zhì)的含量。

4.2 對蘆葦根際土壤中細菌多樣性的影響

細菌是土壤中重要組成部分，細菌的生長情況是評價土壤健康狀態(tài)和生態(tài)學的重要指標。Illumina Miseq高通量測序可以更深層次地了解土壤中細菌群落結(jié)構(gòu)及豐度。因此，常應用于分析土壤樣品中微生物群落的多樣性。結(jié)果顯示，不同程度石油處理土壤中OTU豐度和細菌多樣性隨著石油質(zhì)量分數(shù)的增加呈先下降后上升趨勢。石油進入土壤后，為土壤提供豐富的碳源，增加了細菌的代謝底物，但是有些高分子石油烴對細菌也有一定危害作用，使細菌群落發(fā)生改變。因此，輕度石油污染的毒性導致非石油耐受細菌群落豐度下降，并且無法為石油耐受菌生長提供足夠的碳源，導致總體細菌群落豐度降低。隨著石油污染程度的增加，高質(zhì)量分數(shù)的石油彌補了石油耐受菌生長碳源的不足，促進了石油耐受菌的生長，導致細菌豐度逐漸升高。這與初金美等人研究結(jié)果相似[20]。

4.3 對蘆葦根際土壤細菌群落結(jié)構(gòu)的影響

不同種類的細菌對石油污染的耐受能力存在差異，因此分析土壤中細菌種群結(jié)構(gòu)能更加深入了解石油污染對蘆葦根際土壤細菌演化過程和耐受石油的優(yōu)勢菌屬。由實驗結(jié)果可知，石油污染改變了蘆葦根際土壤中細菌群落的組成。Proteobacteria在土壤中占有絕對優(yōu)勢并且隨著石油污染程度的升高，其相對豐度增加。這不僅與Proteobacteri作為細菌中最大的一門有關，還因為Proteobacteri中Alphaproteobacteria和Betaproteobacteria具有潛在的降解石油作用，而且Alphaproteobacteria和Gammaproteobacteria面對石油污染時會表現(xiàn)處很強的“阻抗”和“回彈能力”[21]，更能適應石油污染并且利用石油烴進行代謝和繁殖。在屬水平上，蘆葦根際土壤細菌主要由23種優(yōu)勢菌控制，其相對比例隨著石油污染程度而發(fā)生改變。Pseudomonas和Hydrogenophaga是高效降解石油烴能力的菌屬，已被人們在石油污染區(qū)域或自然環(huán)境中被分離出來[21-23]。在本文結(jié)果中，Pseudomonas和Hydrogenophaga相對比例隨著石油污染的加劇而升高，說明該這2種細菌能在自身免于石油毒害的同時還能以石油中有機物為代謝底物，進行大量繁殖。另外還有研究表明Pseudomonas具有明顯的植物根際效應，在植物根際區(qū)域能顯著提高該細菌活性和數(shù)量[24]。Exiguobacterium、Rhodoligotrophos、Citrobacter、Aridibacter、Azoarcus、Gp21、Mongoliicoccus的相對豐度與石油含量呈負相關，石油污染影響其生長和繁殖。Desulfuromonas和Bellilinea相對豐度在石油含量較低時升高，但是當石油含量升高時下降。導致其下降的原因可能與其對石油敏感性有關。

5 結(jié)論

1)石油污染可以改變土壤中部分理化性質(zhì)，使土壤中銨態(tài)氮、速效磷和有機質(zhì)含量顯著升高，最高分別上升了41%、121%和141%，而pH值，有效鉀含量無顯著變化。

2)石油污染對蘆葦根際土壤細菌多樣性有影響。α多樣性分析顯示，隨著石油污染程度的增加，蘆葦根際細菌豐度和多樣性指數(shù)逐漸升高。β多樣性分析顯示無石油添加的對照組與石油處理組具有差異。

3)石油污染改變蘆葦根際土壤細菌群落組成，而不同的類型的細菌對石油的敏感程度不同。石油污染促進了Pseudomonas和Hydrogenophaga的生長，抑制Exiguobacterium、Rhodoligotrophos、Citrobacter、Aridibacter、Azoarcus、Gp21、Mongoliicoccus的生長。輕度石油污染會對Desulfuromonas和Bellilinea的生長有促進作用，重度石油污染抑制其生長。