脂質(zhì)體前列腺素E1對重癥肺炎大鼠炎性介質(zhì)的調(diào)控機制

趙 申,李俊杰

湖北文理學(xué)院附屬醫(yī)院/襄陽市中心醫(yī)院兒科,襄陽 441000

重癥肺炎是指肺炎患者出現(xiàn)嚴重低氧血癥、急性呼吸衰竭,需要通氣支持或者出現(xiàn)低血壓和休克等循環(huán)衰竭表現(xiàn)[1]。由于病菌的入侵往往會引起機體的炎癥反應(yīng),適當?shù)难装Y因子表達能夠加快患者機體對病菌的清除速度,但重癥肺炎會造成機體產(chǎn)生大量的促炎因子,過度激活機體的炎癥反應(yīng),最終導(dǎo)致以細胞自身性破壞為特征的全身炎癥反應(yīng)綜合征（systemic inflammatory response syndrome,SIRS）[2-3]。脂質(zhì)體前列腺素E1（liposome prostaglandin E,lip-PGE1）為花生四烯酸的衍生物,是一種抗炎因子[4]。袁科等[5]研究表明,lip-PGE1 可減輕重癥肺炎大鼠的炎癥反應(yīng),可能與調(diào)節(jié)CD4+、CD25+調(diào)節(jié)性T細胞表達有關(guān)。本文旨在研究lip-PGE1對重癥肺炎大鼠炎性介質(zhì)的影響,并初步分析其作用機制,從而為重癥肺炎患者的治療提供理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

BX46型光學(xué)顯微鏡、BX53型熒光顯微鏡,均購自日本Olympus公司;iMark型酶標儀（美國BioRad公司）;DYCZ-24K型雙板垂直電泳儀、DYCP-40C型半干式碳板轉(zhuǎn)移槽,均購自北京六一生物科技有限公司。

1.2 試藥

前列腺素E1（比法爾,國藥準字H20000721,批號20181208,廣東香山堂制藥有限公司）;白細胞介素-6（interleukin-6,IL-6,批 號12100-550）、IL-1β（批號18421-125）和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factorα,TNF-α,批 號22300-150）酶聯(lián)免疫吸附（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）試劑盒均購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司;核因子κB（nuclear factorκB,NF-κB）P65（批號8596）、磷酸化P65（p-P65,批號9250）、NF-κB抑制蛋白（NF-κB inhibitory protein,IκB,批號2265）、p-IκB、Toll樣受體4（toll-like receptor 4,TLR4,批號5230）和髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88,MyD88,批號1655）蛋白一抗均購自美國Abcam 公司。

1.3 細胞與動物

肺炎克雷伯菌由中國科學(xué)院微生物研究所提供;SPF級6～8周齡SD 大鼠45只,雄性,體質(zhì)量200～240 g,購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司,動物許可證號SCXK（京）2020-0005。飼養(yǎng)溫度20～25℃,相對濕度50%～65%,自由攝食、飲水,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進行實驗。

2 方法

2.1 動物分組及模型建立

選取45只雄性SD 大鼠,隨機分為對照組、模型組和脂質(zhì)體前列腺素E1（lip-PGE1）組,每組15只,模型組和lip-PGE1組采用氣管穿刺肺炎克雷伯菌液法制做重癥肺炎模型。方法:大鼠術(shù)前禁食12 h,腹腔注射水合氯醛麻醉處理,切開頸部皮膚,鈍性分離皮下組織,暴露上段氣管,用注射器穿刺氣管緩慢滴入0.25 mL 新鮮配制的肺炎克雷伯菌液（含菌量為1.2×109cfu·mL-1）,使大鼠保持直立位約20 s,以保證菌液均勻分布于肺,6 d后觀察到大鼠表現(xiàn)出呆滯和呼吸急促,經(jīng)HE 染色觀察到肺部組織損傷嚴重,伴有大量的炎性細胞浸潤,提示重癥肺炎大鼠模型構(gòu)建成功[6],對照組以等量生理鹽水替代。

2.2 藥物干預(yù)

造模成功后,lip-PGE1組尾靜脈注射1μg·kg-1的lip-PGE1[7],連續(xù)注射5 d,對照組和模型組分別注射等量的生理鹽水,藥物注射后7、9和11 d采集大鼠肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid,BALF）進行炎癥因子和細胞數(shù)量檢測,再處死大鼠采集肺組織,進行病理染色觀察和相關(guān)蛋白表達水平的檢測。

2.3 檢測項目

2.3.1 大鼠BALF的收集與細胞計數(shù) 將2 mL無菌生理鹽水注入大鼠氣管,輕輕按摩左肺30 s后,抽回灌注液體,再灌注該液體,重復(fù)3次后,將灌入的液體抽出,此為1 次灌洗完畢。收集3 次灌洗后的BALF,使用層干紗布過濾后,以1 500 r·min-1離心15 min,取上清液待測。收集經(jīng)過濾的BALF 細胞沉淀,調(diào)整密度為1×109個·L-1,采用細胞計數(shù)板對總細胞進行計數(shù),再取200μL 細胞進行Diff-quick染色,于光鏡下計數(shù)中性粒細胞。

2.3.2 BALF 中IL-6、IL-1β和TNF-α水平的檢測取大鼠BALF,參照ELISA 試劑盒說明書操作,檢測BALF中IL-6、IL-1β和TNF-α的含量。

2.3.3 HE染色觀察大鼠肺組織病理變化 取藥物注射后第11天的大鼠肺組織用中性甲醛溶液固定24 h后,石蠟包埋切片,經(jīng)HE 染色,在光鏡下觀察肺組織病理變化。

2.3.4 蛋白印跡檢測肺組織相關(guān)蛋白的表達 取藥物注射后第11天的大鼠肺組織約200 mg,加入放射免疫沉淀法（radio immunoprecipitation assay,RIPA）裂解液,冰上裂解1 h,以12 000 r·min-1離心10 min,分離上清液測定蛋白濃度,水浴變性后,取50μg蛋白進行電泳,蛋白完全分離后再轉(zhuǎn)移至聚二偏氟乙烯（polyvinylidenefluoride,PVDF）膜,取出載有蛋白的PVDF膜,浸于脫脂牛奶,室溫下孵育2 h,接著浸于1∶1 000蛋白一抗,4℃下?lián)u床振蕩過夜,再浸于1∶5 000蛋白二抗,37℃下?lián)u床振蕩1 h,最后添加電化學(xué)發(fā)光法（electro-chemi-luminescence,ECL）試劑進行蛋白顯影。

2.3.5 免疫熒光法檢測NF-κB P65核遷移情況取藥物注射后第11天的大鼠肺組織,用中性甲醛溶液固定24 h后,石蠟包埋切片,脫蠟水化后,置于枸櫞酸緩沖液中高溫抗原修復(fù),添加1∶50 NF-κB P65一抗,4℃下孵育過夜,再滴加相應(yīng)二抗,避光條件下室溫孵育1 h,滴加4′,6-二脒基-2-苯基吲哚[2-（4-amidinophenyl）-6-indolecarbamidine dihydrochloride,DAPI]染液,避光條件下室溫孵育10 min,封片后,于熒光顯微鏡下觀察并拍照,計數(shù)總細胞數(shù)和NF-κB P65核染色陽性細胞數(shù)。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠BALF 中細胞總數(shù)和中性粒細胞數(shù)的比較

藥物注射后的第7、9和11天,模型組、lip-PGE1組BALF 中的細胞總數(shù)和中性粒細胞數(shù)逐漸增加;與對照組相比,模型組大鼠BALF 中的細胞總數(shù)和中性粒細胞數(shù)均顯著增加（P＜0.05）;與模型組相比,lip-PGE1組細胞總數(shù)和中性粒細胞數(shù)均顯著減少（P＜0.05）。結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠BALF中細胞總數(shù)和中性粒細胞數(shù)的比較（,n=5）Tab.1 Comparison of the total number of cells and neutrophils count in BALF among groups（,n=5）

表1 各組大鼠BALF中細胞總數(shù)和中性粒細胞數(shù)的比較（,n=5）Tab.1 Comparison of the total number of cells and neutrophils count in BALF among groups（,n=5）

注:與對照組比較,*P＜0.05;與模型組比較,#P＜0.05。

3.2 各組大鼠BALF中IL-6、IL-1β 和TNF-α 水平的比較

藥物注射后第7、9和11天,模型組和lip-PGE1組BALF 中炎性細胞因子水平逐漸升高;與對照組相比,模型組大鼠BALF中IL-6、IL-1β和TNF-α的水平均顯著升高（P＜0.05）;與模型組相比,lip-PGE1組IL-6、IL-1β和TNF-α的水平均顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠BALF中IL-6、IL-1β 和TNF-α 水平的比較 （,n=5）Tab.2 Comparison of IL-6,IL-1βand TNF-αlevels in BALF among groups （,n=5）

表2 各組大鼠BALF中IL-6、IL-1β 和TNF-α 水平的比較 （,n=5）Tab.2 Comparison of IL-6,IL-1βand TNF-αlevels in BALF among groups （,n=5）

注:與對照組比較,*P＜0.05;與模型組比較,#P＜0.05。

3.3 各組大鼠肺組織HE染色觀察

各組大鼠肺組織HE 染色結(jié)果見圖1。由圖1可見,對照組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)完整,肺泡腔內(nèi)無滲出液且肺泡間隔正常;模型組大鼠肺組織實變,結(jié)構(gòu)消失,肺泡腔內(nèi)可見大量滲出液,肺泡間隔增寬且呈代償性肺氣腫或肺萎縮;lip-PGE1組大鼠肺部結(jié)構(gòu)較為完整,與模型組比較,腔內(nèi)滲出液減少,炎性細胞浸潤程度降低且范圍顯著縮小。

圖1 各組大鼠肺組織HE染色結(jié)果 （×400）Fig.1 HE staining of lung tissues in all groups （×400）

3.4 各組大鼠肺組織相關(guān)蛋白表達水平的比較

與對照組相比,模型組大鼠肺組織p-P65/P65、TLR4和My D88的水平均顯著升高,p-IκB/IκB的水平降低（P＜0.05）;與模型組相比,lip-PGE1 組p-P65/P65、TLR4 和My D88的水平均顯著降低,p-IκB/IκB的水平升高（P＜0.05）。結(jié)果見圖2、表3。

表3 各組大鼠肺組織相關(guān)蛋白表達的比較 （,n=5）Tab.3 Comparison of the expressions of related proteins in lung tissues among groups（,n=5）

表3 各組大鼠肺組織相關(guān)蛋白表達的比較 （,n=5）Tab.3 Comparison of the expressions of related proteins in lung tissues among groups（,n=5）

注:與對照組比較,*P＜0.05;與模型組比較,#P＜0.05。

圖2 蛋白印跡檢測肺組織相關(guān)蛋白的表達水平Fig.2 Expressions of related proteins in lung tissues detected by Western blot

3.5 各組大鼠NF-κB P65核遷移情況的比較

各組大鼠NF-κB P65核遷移情況的比較見圖3。由圖3 可見,對照組、模型組和lip-PGE1 組NF-κB P65陽性細胞數(shù)占比分別為9.21% ±2.14%、56.87%±7.62%、29.63%±8.21%,與對照組相比,模型組大鼠肺組織NF-κB P65陽性細胞數(shù)顯著增加（P＜0.05）;與模型組相比,lip-PGE1組NF-κB P65陽性細胞數(shù)顯著減少（P＜0.05）。結(jié)果見圖3。

圖3 各組大鼠NF-κB P65核遷移情況的比較Fig.3 Comparison of nuclear migration of NF-κB P65 among groups

4 討論

目前,對重癥肺炎的治療主要依靠抗生素及一些支持治療,但重癥肺炎的病死率仍較高[8-10],因此,亟待尋找有效的治療藥物。既往研究顯示,lip-PGE1具有強效的抗炎作用,能夠抑制多種組織病理生理損傷[11]。發(fā)生嚴重肺部感染時,病原菌的內(nèi)毒素會刺激中性粒細胞、巨噬細胞和嗜酸性粒細胞等多種細胞在肺內(nèi)聚集,再釋放與炎癥相關(guān)的細胞因子,啟動炎癥反應(yīng)[12]。同時,這些細胞還會釋放氧自由基和脂質(zhì)代謝產(chǎn)物,損害周圍細胞和組織,從而導(dǎo)致肺微血管膜及肺泡上皮的損傷[13]。本研究發(fā)現(xiàn),lip-PGE1組大鼠BALF中細胞總數(shù)和中性粒細胞數(shù)顯著少于模型組。IL-6、IL-1β和TNF-α均是重要的促炎性細胞因子,它們主要由單核細胞和巨噬細胞等免疫細胞和非免疫細胞等分泌,是炎癥的重要介導(dǎo)物質(zhì)[14]。本研究發(fā)現(xiàn),經(jīng)lip-PGE1處理后,大鼠BALF中IL-6、IL-1β和TNF-α的水平降低。同時,病理染色結(jié)果也證實,與模型組比較,lip-PGE1組肺組織結(jié)構(gòu)較為完整,腔內(nèi)滲出液減少,炎性細胞浸潤程度降低且范圍顯著縮小,表明lip-PGE1能有效減少中性粒細胞的數(shù)量,抑制促炎癥因子IL-6、IL-1β和TNF-α的表達,從而減輕大鼠體內(nèi)的炎癥反應(yīng),緩解由肺炎克雷伯菌誘導(dǎo)的肺組織損傷。

TLR4/MyD88/NF-κB 信號通路是調(diào)控炎癥反應(yīng)的重要信號通路之一,病原菌入侵后,與單核巨噬細胞表面的TLR4結(jié)合,募集下游信號分子MyD88,致使IκB發(fā)生自身磷酸化,解離的NF-κB轉(zhuǎn)位進核,誘導(dǎo)單核巨噬細胞合成并分泌大量的炎癥細胞因子（IL-6、IL-1β和TNF-α等）,造成肺損傷[15-17]。WANG Y等[18]通過建立肺炎支原體肺炎小鼠模型,發(fā)現(xiàn)微小RNA-143-3p 過表達可通過抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號通路,改善模型小鼠肺內(nèi)炎癥因子的水平,減少肺泡上皮細胞的凋亡。CHEN L等[19]研究顯示,卵泡素樣蛋白1 可能介導(dǎo)TLR4/NF-κB信號通路,在肺炎鏈球菌感染期間的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。卿蕊等[20]使用肺炎克雷伯菌Fim H 蛋白刺激巨噬細胞,發(fā)現(xiàn)Fim H 蛋白可通過TLR4/NF-κB途徑,誘導(dǎo)巨噬細胞分泌IL-6、IL-1β和TNF-α因子,這可能是肺炎克雷伯菌的潛在致病機制。本研究的結(jié)果顯示,對大鼠氣管穿刺滴注肺炎克雷伯菌菌液后,大鼠肺組織內(nèi)的TLR4/MyD88/NF-κB信號通路被激活,經(jīng)lip-PGE1處理后,p-P65/P65、TLR4和My D88的水平均顯著降低,p-IκB/IκB的水平升高,且NF-κB P65從細胞質(zhì)向細胞核移位的陽性細胞數(shù)也明顯減少,提示lip-PGE1可能通過阻滯TLR4/My D88/NF-κB通路,抑制重癥肺炎大鼠體內(nèi)的炎癥反應(yīng)。

綜上所述,lip-PGE1 可有效抑制重癥肺炎大鼠的炎癥反應(yīng),減輕肺組織損傷,其作用機制可能與阻滯TLR4/NF-κB信號通路有關(guān)。本研究后續(xù)將用信號通路特異激動劑或抑制劑,激活或抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號通路,進一步觀察lip-PGE1 發(fā)揮作用的分子機制。