陜西漢中不同產(chǎn)區(qū)泥附子中酯型生物堿類成分的測定

李 凡,田 浩,馬 杰,田文博,王衛(wèi)鋒,李莎莎,張景霞,李 芳*

1.陜西省中醫(yī)藥研究院,西安 710003;2.陜西佛緣中藥產(chǎn)業(yè)集團股份有限公司洋縣分公司,洋縣 723300;3.漢中市杰豐養(yǎng)殖專業(yè)合作社,漢中 723100;4.西安國際醫(yī)學(xué)中心有限公司,西安 710119

附子為毛茛科植物烏頭（Aconitum carmichaelii Debx.）的子根。6 月下旬至8 月上旬采挖,除去母根、須根及泥沙,習(xí)稱“泥附子”。附子在臨床上應(yīng)用廣泛,能夠回陽救逆、補火助陽、散寒止痛,用于治療亡陽虛脫、肢冷脈微、心陽不足、胸痹心痛、虛寒吐瀉、皖腹冷痛、腎陽虛衰、陽痿宮冷、陰寒水腫、陽虛外感、寒濕痹痛,有“回陽救逆第一品”之稱。2020年版《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）一部[1]對烏頭堿、次烏頭堿和新烏頭堿3種雙酯型生物堿進行限量檢查,對苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿等單酯型生物堿進行含量測定,以保證藥材的質(zhì)量和安全性。陜西省漢中市是泥附子的原產(chǎn)區(qū)和主產(chǎn)區(qū)之一,種植歷史悠久,產(chǎn)量大。產(chǎn)自漢中的泥附子于2009年獲得國家地理標志產(chǎn)品保護。泥附子需經(jīng)炮制后方可入藥。由于泥附子不易保存,課題組實地采集了產(chǎn)自陜西漢中4個縣（區(qū)）的15批泥附子樣品,采用超高效液相色譜法（ultra performance liquid chromatography,UPLC）同時對樣品中6種酯型生物堿的含量進行測定,為進一步的研究奠定基礎(chǔ)。

3)將原有的藥劑塑料管改為鋼管，減弱草酸、TL-1和P86對管道的腐蝕作用，在配制TL-1的攪拌桶上加裝蓋板，防止蒸汽和粉塵對人體的危害。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters Acquity H-CLASS 型超高效液相色譜儀（UPLC Empower TM3色譜工作站、PDA檢測器）,ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（50 mm×2.1 mm,1.7μm）,電子分析天平（型號BT25S,d=0.01 mg,BS210S,d=0.1 mg）,均購自北京賽多利斯天平有限公司;FOEA26810D型純水機（德國Millipore公司）;KH-300DE型數(shù)控超聲波清洗機（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）;電熱恒溫水浴鍋（上海醫(yī)療器械五廠）;RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）。

1.2 試藥

6種對照品均購自克洛瑪科技有限公司:苯甲酰新烏頭原堿,批號CHB180310,質(zhì)量分數(shù)≥98%;苯甲酰烏頭原堿,批號CHB180309,質(zhì)量分數(shù)≥98%;苯甲酰次烏頭原堿,批號CHB180307,質(zhì)量分數(shù)≥98%;烏頭堿,批號CHB180408,質(zhì)量分數(shù)≥98%;新烏頭堿,批號CHB180311,質(zhì)量分數(shù)≥98%;次烏頭堿,批號CHB180524,質(zhì)量分數(shù)≥98%。乙腈（HPLC級,美國TEDIA公司）;色譜用水為娃哈哈純凈水;其他試劑均為分析純,均購自西安化學(xué)試劑廠。

泥附子樣品由課題組于2020年6月下旬至8月上旬在陜西省漢中地區(qū)實地采集,經(jīng)王衛(wèi)鋒主任藥師鑒定為毛茛科植物烏頭（Aconitumcarmichaelii Debx.）的子根,樣品信息見表1。

表1 泥附子的樣品信息Tab.1 Sample information of aconite

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備

精密吸取混合對照品溶液（質(zhì)量濃度分別為180.68、70.24、132.53、549.35、370.45、525.66 μg·mL-1）0.5、1、2、5、7.5、10mL分別置于6個10mL量瓶中,用異丙醇-二氯甲烷（1∶1）定容至刻度,搖勻,制成系列質(zhì)量濃度的混合對照品溶液。按照2.3項下色譜條件測定,各進樣1μL。以質(zhì)量濃度（μg·mL-1）為橫坐標（x）、峰面積為縱坐標（y）,進行線性回歸,繪制標準曲線,得線性回歸方程。結(jié)果見表3。

表2 6種酯型生物堿混合對照品的質(zhì)量濃度Tab.2 Concentration of the 6 kinds of ester-type alkaloids mixed reference substance

2.2 供試品溶液的制備

取S6樣品,按照2.2項下的方法平行制備6份,并按2.3項下色譜條件測定,計算含量。結(jié)果①～⑥號酯型生物堿的平均含量分別為0.009 2%、0.003 7%、0.005 5%、0.025 4%、0.013 6%、0.070 4%,RSD 值分別為0.76%、0.93%、1.04%、0.93%、1.10%、0.94%,表明該方法的重復(fù)性良好。

2.3 色譜條件

取2.1項下混合對照品溶液,按2.3項下色譜條件連續(xù)進樣6次,每次進樣2μL,記錄色譜峰面積,結(jié)果①～⑥號酯型生物堿對照品峰面積的RSD 值分別為0.81%、0.67%、0.77%、0.31%、0.45%、0.79%,表明儀器的精密度良好。

研究還發(fā)現(xiàn)，不同類型學(xué)校學(xué)生的艾滋病知曉率存在差異，中專/高職/高專高于大學(xué)生，反映出艾滋病的宣傳教育在不同類型學(xué)校間實施的不均衡性［14］，覆蓋不夠全面。有研究顯示，學(xué)歷較高的學(xué)生由于更側(cè)重于專業(yè)知識的研究，導(dǎo)致其艾滋病知識掌握情況不及學(xué)歷較低的學(xué)生［15］。提示艾滋病宣傳教育應(yīng)全面覆蓋不同類型學(xué)校、學(xué)歷人群，不斷提高學(xué)生的艾滋病防治知識水平。

圖1 UPLC圖Fig.1 UPLC chromatograms

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密稱取6種酯型生物堿對照品適量,加異丙醇-二氯甲烷（1∶1）制成混合溶液。6種對照品的質(zhì)量濃度見表2。

表3 6種酯型生物堿的線性關(guān)系Tab.3 Linear relationship of the 6 ester-type alkaloids

2.5 精密度實驗

色譜柱:ACQUITY UPLC BEH C18（50 mm×2.1 mm,1.7μm）;流動相:乙腈為流動相A,0.04 mol·L-1乙酸銨溶液（氨水調(diào)pH=10）為流動相B;梯度洗脫:0～5 min,26%A→5～15 min,26%～39%A→15～20 min,39%～45%A→20～25 min,45%～39%A→25～30 min,39%～26%A;柱溫:25℃;對照品進樣量:2μL,供試品進樣量:1μL;檢測波長:235 nm。結(jié)果見圖1。

2.6 重復(fù)性實驗

將實地采集的泥附子樣品洗凈、切片后干燥,粉碎。精密稱取各樣品粉末（過3號篩）2 g,置于錐形瓶中,加入氨試液3 mL,精密加入異丙醇-乙酸乙酯（1∶1）混合溶液50 mL,稱質(zhì)量;超聲處理（功率300 W,頻率40 Hz,水溫低于25℃）30 min,放冷,再稱質(zhì)量;用異丙醇-乙酸乙酯（1∶1）混合溶液補足質(zhì)量,搖勻,過濾;精密量取濾液25 mL,40℃以下減壓回收溶劑至干,精密加入0.5 mL·L-1鹽酸甲醇溶液3mL溶解殘渣,過0.22μm濾膜,取濾液,即得供試液S1～S15。

謝煙客在《俠客行》中是一個十分有意思的人物，青袍短須，容貌清癯，而且還會彈指神通。他是個狂妄傲世、亦正亦邪的世外高人，行事風(fēng)格不能以常理測度，純是一廂情愿憑個人的喜好。武功、性格、脾氣、行事，活脫脫就像是《射雕英雄傳》中黃藥師的翻版?？墒?，當(dāng)我們細讀原文的時候發(fā)現(xiàn)，謝煙客除了名字風(fēng)格和黃藥師比較像以外，其他許多地方實在是不值一提，和我們裝逼界的大佬黃藥師相比，可謂是有云泥之別。

與分站功能類似，主站功能主要包括查詢統(tǒng)計功能、人機界面以及分析管理等功能。其中采集功能主要是利用子站的通信情況，對IED設(shè)備的自檢、動作、正常運行以及相應(yīng)的數(shù)據(jù)進行收集，查詢功能主要是對日常設(shè)備運行情況的統(tǒng)計與檢索。人機交互功能可以通過GIS等技術(shù)進行定位，確保全部定位可以在地圖中完成。

2.7 穩(wěn)定性實驗

精密稱取6份已知①～⑥號酯型生物堿含量的S6樣品1.0 g,分別精密加入2.1項下混合對照品溶液2 mL,再按照2.2項下的方法制備供試品溶液,按2.3項下色譜條件進行測定,計算①～⑥號酯型生物堿的加樣回收率,結(jié)果見表4。由表4可見,該方法的回收率較高。

2.8 回收率實驗

取S6樣品,按2.3項下色譜條件分別在0、2、4、6、8、12 h測定,結(jié)果①～⑥號酯型生物堿峰面積的RSD值分別 為1.10%、0.92%、0.79%、1.08%、0.77%、1.14%,表明樣品在12 h內(nèi)的穩(wěn)定性良好。

表4 6種酯型生物堿回收率的實驗結(jié)果Tab.4 Results of recovery rate of the 6 ester-type alkaloids

表4 （續(xù)） 6種酯型生物堿回收率的實驗結(jié)果Tab.4 （Continued）Results of recovery rate of the 6 ester-type alkaloids

2.9 含量測定

取2.2 項下制備的S1～S15供試品溶液,按照2.3項下色譜條件進行測定,記錄峰面積。采用外標法計算陜西省漢中市不同產(chǎn)區(qū)附子樣品中6種酯型生物堿的含量。結(jié)果見表5。

3 討論

本實驗建立了同時測定泥附子中6種酯型生物堿含量的UPLC法。藥材的質(zhì)量主要是由其化學(xué)成分決定的,不同產(chǎn)地甚至同一產(chǎn)地不同個體間化學(xué)成分具有變異性。陜西省漢中地區(qū)地勢復(fù)雜,地形特點為南低北高,漢中市內(nèi)有平壩、丘陵和山地3種地貌,平壩海拔為500～600 m,地勢平坦,土壤肥沃;丘陵海拔為601～800 m,地勢起伏較大;山區(qū)是秦嶺南坡形成的淺山和中山地區(qū),地勢較為復(fù)雜,海拔在701～2 038 m。由于不同經(jīng)度、緯度海拔差距較大,故4個產(chǎn)區(qū)樣品中所含的6種酯型生物堿的含量均有明顯差異,體現(xiàn)了不同產(chǎn)地泥附子“同種異質(zhì)”的客觀性。下一步應(yīng)在漢中泥附子地理標志產(chǎn)品保護范圍內(nèi)擴大樣品的采集區(qū)域,并增加采集的數(shù)量,進行更深入的比較研究。

本研究在已有文獻的基礎(chǔ)上[2-21],不斷優(yōu)化色譜條件,最終將色譜條件確定為乙腈為流動相A,0.04 mol·L-1乙酸銨溶液（氨水調(diào)pH=10）為流動相B,0～5 min,26%A,5～15 min,26%～39%A,15～20 min,39%～45%A,20～25 min,45%～39%A,25～30 min,39%～26%A;柱溫為25℃。

(3) 模具制造取得了一定的成功，但是由于新模塊的加入，在模具防銹，機械元件潤滑等尚有不足之處，需要不斷完善，模具刃磨時需要增加防護措施。

4 結(jié)論

本研究采用UPLC法進行檢測,靈敏度高,分離度好,檢測速度快,大大減少了試劑用量。在該檢測條件下,附子6種酯型生物堿各峰的分離度良好,操作簡便、重復(fù)性好,為泥附子的進一步炮制以及生品與炮制品的比較研究提供了依據(jù)。