捻轉(zhuǎn)血矛線蟲酵母雙雜交cDNA文庫(kù)的構(gòu)建及鑒定

張惠，黃艷，周靜茹，吳飛，童丹妮，陳學(xué)秋，楊怡，馬光旭，杜愛(ài)芳

（浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院動(dòng)物預(yù)防醫(yī)學(xué)研究所，浙江 省動(dòng)物預(yù)防醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310058）

山羊因?qū)Νh(huán)境的適應(yīng)性強(qiáng)而在全球范圍內(nèi)被廣泛養(yǎng)殖。近年來(lái)，全球山羊的養(yǎng)殖數(shù)量估計(jì)超過(guò)10億只，養(yǎng)羊業(yè)對(duì)全球畜牧業(yè)的發(fā)展有著至關(guān)重要的影響[1]。但是，目前山羊的飼養(yǎng)生產(chǎn)仍受到寄生蟲、細(xì)菌和病毒感染的威脅，其中，捻轉(zhuǎn)血矛線蟲（Haemonchus contortus）便是全球養(yǎng)羊業(yè)最大的威脅之一[2]。

捻轉(zhuǎn)血矛線蟲是一種反芻動(dòng)物胃腸道寄生蟲，各種反芻動(dòng)物都對(duì)該蟲易感，其中綿羊和山羊種群的患病率最高[3]。該蟲寄生于羊的皺胃，長(zhǎng)期吸食動(dòng)物血液，并造成羊胃腸道黏膜潰瘍性病變，最終導(dǎo)致消化綜合征和貧血，且受感染的綿羊每天損失的血液可多達(dá)30 mL，動(dòng)物的健康受到嚴(yán)重影響[4]。目前，捻轉(zhuǎn)血矛線蟲病的預(yù)防與控制主要依靠驅(qū)蟲藥來(lái)完成，但該蟲幾乎對(duì)所有種類的驅(qū)蟲藥產(chǎn)生了耐藥性[5]，這使得我們迫切需要開發(fā)疫苗來(lái)對(duì)其進(jìn)行有效防控。因此，捻轉(zhuǎn)血矛線蟲相關(guān)分子機(jī)制的研究對(duì)全球養(yǎng)羊業(yè)及畜牧業(yè)有著重要的意義。除此之外，捻轉(zhuǎn)血矛線蟲具有快速獲得耐藥性的能力，擁有豐富的基因組資源，且在實(shí)驗(yàn)室條件下該蟲所處的不同發(fā)育階段易觀察區(qū)分，并與第五進(jìn)化分支中的其他寄生線蟲聯(lián)系密切，這些優(yōu)勢(shì)使得捻轉(zhuǎn)血矛線蟲有望成為功能和比較基因組學(xué)的模式寄生線蟲[6]。因此，對(duì)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲相關(guān)分子機(jī)制的研究也具有重要的生物學(xué)意義。

蛋白質(zhì)是生物體的重要組成部分和功能單位，探究蛋白質(zhì)功能是研究生物體分子機(jī)制的基礎(chǔ)。深入探究蛋白互作機(jī)制將更有助于理解蛋白質(zhì)的功能，從而尋找關(guān)鍵蛋白，發(fā)現(xiàn)新藥物靶標(biāo)、診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。酵母雙雜交（yeast two-hybrid,Y2H）系統(tǒng)是一種用于分析體內(nèi)蛋白質(zhì)間相互作用（protein-protein interaction,PPI）的方法，由FIELDS等在1989年開發(fā)[7]。Y2H的建立基于對(duì)真核生物調(diào)控轉(zhuǎn)錄起始過(guò)程的認(rèn)識(shí)，細(xì)胞起始基因轉(zhuǎn)錄需要有反轉(zhuǎn)錄激活因子的參與。反轉(zhuǎn)錄激活因子例如酵母轉(zhuǎn)錄因子GAL4 在結(jié)構(gòu)上是組件式的，往往由2個(gè)或2 個(gè)以上在結(jié)構(gòu)上可以分開，但在功能上又相互獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，比如DNA結(jié)合功能域（DNA binding domain, DNA-BD）和DNA 激活結(jié)構(gòu)域（DNA activation domain,DNA-AD），這些結(jié)構(gòu)域在物理上是分離的，但當(dāng)這2個(gè)結(jié)構(gòu)域非常接近時(shí)，就會(huì)激活轉(zhuǎn)錄表達(dá)[8-10]。在酵母雙雜交系統(tǒng)中，編碼“誘餌”蛋白的cDNA 被克隆至DNA-BD 載體中構(gòu)建DNA-BD/X融合蛋白，進(jìn)一步編碼待測(cè)試蛋白的cDNA被克隆至DNA-AD載體中構(gòu)建AD/Y融合蛋白。如果這2 種表達(dá)的蛋白質(zhì)在酵母中相互作用，BD 和AD 就會(huì)緊密接近，從而激活報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄?；诖?，該系統(tǒng)還可用于篩選文庫(kù)以鑒定一種或多種特定蛋白間的相互作用，極大地促進(jìn)了蛋白質(zhì)相互作用研究的發(fā)展[11-12]。

為了進(jìn)一步探究捻轉(zhuǎn)血矛線蟲致病的分子機(jī)制，本研究將篩選互作蛋白作為新的突破口，擬構(gòu)建捻轉(zhuǎn)血矛線蟲酵母cDNA 文庫(kù)，為深入研究該蟲的蛋白互作機(jī)制以及篩選互作蛋白質(zhì)提供工具，并為其相關(guān)分子機(jī)制研究以及疫苗的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 蟲株、菌株和質(zhì)粒

捻轉(zhuǎn)血矛線蟲L3 期幼蟲來(lái)自本實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期傳代培養(yǎng)的H. contortus浙江株（Zhejiang strain, ZJ株），Y2H Gold和Y187菌株來(lái)自上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司。

1.2 試劑和儀器

文庫(kù)構(gòu)建試劑盒（MatechmakerTMLibrary Construction & Screening Kit）購(gòu)于美國(guó)Clontech 公司；聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物回收試劑盒（QIAquick PCR Purification Kit）購(gòu)于德國(guó)Qiagen 公司；文庫(kù)檢測(cè)試劑盒（Advantage 2 Polymerase Mix）購(gòu)于美國(guó)Clontech 公司；雙鏈特異性核酸酶（duplex-specific nuclease,DSN）購(gòu)于俄羅斯Evrogen公司；DNA分子標(biāo)志物（DL2000 Marker）購(gòu)于日本TaKaRa 公司；Centrifuge 5418R 臺(tái)式離心機(jī)購(gòu)于德國(guó)Eppendorf公司；MyCycler-PCR 儀購(gòu)于美國(guó)Bio-Rad 公司；HE-120電泳儀和2500凝膠成像儀購(gòu)于上海天能科技有限公司；THZ-C恒溫振蕩器購(gòu)于江蘇省蘇州培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；DNP-9052電熱恒溫培養(yǎng)箱購(gòu)于上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；SW-CJ-2D 超凈工作臺(tái)購(gòu)于江蘇省蘇州凈化設(shè)備有限公司；NanoDrop 2000 紫外分光光度計(jì)購(gòu)于美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司；一次性平皿購(gòu)于美國(guó)Corning 公司；各型號(hào)芯片/離心管/TriZol 試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。

1.3 捻轉(zhuǎn)血矛線蟲總RNA 的提取

總RNA 提取方法參照TriZol 試劑盒（美國(guó)Invitrogen公司）說(shuō)明書進(jìn)行。取適量的H.contortusL3 期幼蟲于200 μL TriZol 試劑中，混勻后放入提前處理好的研磨器[在1‰ 焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate, DEPC）水中浸泡48 h 后高壓滅菌烘干]中，冰浴條件下充分研磨；再加入200 μL 的TriZol 試劑，繼續(xù)研磨，重復(fù)4 遍；然后加入200 μL三氯甲烷，劇烈振蕩15 s，室溫放置10 min，使得RNA 從TriZol 中溶至三氯甲烷中；于4 ℃、1.2×104r/min 條件下離心15 min，將離心后得到的上層透明液體吸取至潔凈微量離心管中，然后加入500 μL異丙醇，吹打混勻，在室溫條件下放置10 min；于4 ℃、1.2×104r/min 條件下離心15 min，棄上清液；最后用75%乙醇（由750 μL 無(wú)水乙醇和250 μL 1‰ DEPC 水配置而成）洗滌RNA 沉淀，去除殘留物；于4 ℃、8 000 r/min 條件下離心5 min，棄上清液；將微量離心管倒扣于濾紙上，并用濾紙吸干沉淀表面水分，待到沉淀由乳白色變成透明時(shí)，立即加入10 μL 1‰ DEPC 溶解RNA，最終獲得捻轉(zhuǎn)血矛線蟲總RNA。

1.4 cDNA 的合成

1.4.1 cDNA 第一鏈合成

使用酵母雙雜交建庫(kù)試劑盒（Make Your Own“Mate&Plate”Library System，美國(guó)Clontech 公司）構(gòu)建出cDNA文庫(kù)，按照說(shuō)明書配制反應(yīng)液，取1 μg總RNA 于PCR 管中，利用試劑盒中的CDS ⅢPrimer Mix將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈。

1.4.2 雙鏈cDNA（double strain cDNA, ds cDNA）擴(kuò)增及純化

使用長(zhǎng)鏈PCR（long-distance PCR,LD-PCR）將上述反應(yīng)生成的cDNA 第一鏈合成ds cDNA，再使用試劑盒中的CHROMA SPINTTM＋TE-400 柱對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行純化，并將純化前后的ds cDNA 進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.5 cDNA 文庫(kù)均一化

將上述構(gòu)建好的cDNA文庫(kù)利用雙鏈特異性核酸酶（DSN）進(jìn)行均一化處理，使得到的cDNA 包含相等濃度的不同基因，以應(yīng)用于cDNA文庫(kù)的構(gòu)建。具體使用cDNA 歸一化試劑盒（俄羅斯Evrogen 公司）進(jìn)行均一化處理，操作步驟如下。

1）雜交：將ds cDNA與2×雜交緩沖液按照說(shuō)明書反應(yīng)體系在PCR管中混勻，共4管；于PCR儀上，在98 ℃條件下放置2 min，隨后迅速轉(zhuǎn)移到68 ℃水浴鍋中放置5 h。

2）DSN消化：在雜交完成前準(zhǔn)備好不同濃度的DSN[l μL DSN 緩沖液和1 μL DSN 混勻，標(biāo)記為1/2 DSN；3 μL DSN緩沖液和1 μL DSN混勻，標(biāo)記為1/4 DSN；7 μL DSN緩沖液和1 μL DSN混勻，標(biāo)記為1/8 DSN；1 μL DSN 緩沖液，標(biāo)記為CK（對(duì)照）]；預(yù)熱DSN 緩沖液至68 ℃；依次加入4 μL 雜交后的cDNA，5 μL 預(yù)熱后的DSN 緩沖液，1 μL DSN 溶液（分別包含DSN、1/2 DSN、1/4 DSN、CK），混勻；4個(gè)PCR 管在68 ℃條件下反應(yīng)25 min；在各管中加入10 μL 2×DSN 終止緩沖液，混勻；室溫放置5 min；于－20 ℃冰箱中保存，備用。

1.6 DSN 消化后2 次PCR 放大

1）第1 次PCR 放大。將消化后產(chǎn)物（DSN、1/2 DSN、1/4 DSN、CK）分別按照說(shuō)明書反應(yīng)體系混勻并標(biāo)記，稍離心后放到已預(yù)熱（95 ℃）的PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性15 s，68 ℃延伸6 min，17 個(gè)循環(huán)；68 ℃延伸5 min。反應(yīng)結(jié)束后從各管中取5 μL 用于瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，根據(jù)電泳結(jié)果，選擇模板進(jìn)行第2次放大。

2）第2 次PCR 放大。按照說(shuō)明書體系混勻，取2 個(gè)PCR 管并依次加入試劑，混勻，分別標(biāo)記為1/4 DSNP2、CKP2，稍離心后放到已預(yù)熱（95 ℃）的PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性15 s，68 ℃延伸6 min，24 個(gè)循環(huán)；68 ℃延伸5 min；反應(yīng)結(jié)束后從各管中取5 μL 用于瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.7 分級(jí)分離純化ds cDNA

固定cDNA大小分餾柱；每個(gè)cDNA樣品使用1個(gè)柱子；待柱子里儲(chǔ)存液流盡，加入800 μL Tris-乙二胺四乙酸-氯化鈉[Tris-ethylenediamine tetracetic acid(EDTA)-NaCl,TEN]緩沖液清洗柱子，確定柱子流速為50～100 μL/min，若流速過(guò)快或者過(guò)慢，則該柱子不可使用，重復(fù)洗滌3次；準(zhǔn)備好3個(gè)1.5 mL離心管，標(biāo)記為1～3號(hào)；將cDNA產(chǎn)物加入柱子，收集過(guò)濾產(chǎn)物于1 號(hào)管；全部滴完后，再加入100 μL TEN 緩沖液，收集過(guò)濾產(chǎn)物于1 號(hào)管；全部滴完后，再加入240 μL TEN 緩沖液，收集過(guò)濾產(chǎn)物于2 號(hào)管；全部滴完后，再加入80 μL TEN 緩沖液，收集過(guò)濾產(chǎn)物于3 號(hào)管；向2/3 管cDNA 中加入1 μL 糖原（20 μg/μL）、500 μL 乙酸鈉（5 mol/L，pH 4.8）、250 μL乙醇（－20 ℃），于－80 ℃條件下靜置30 min；在4 ℃、1.4×104r/min條件下離心25 min，去上清液；加入1 mL 70%乙醇，輕輕洗滌沉淀，在4 ℃、1.4×104r/min 條件下離心25 min，去上清液，并重復(fù)洗滌2次；室溫放置10 min，氣體干燥沉淀；將沉淀放于20 μL去離子水中重新懸浮，于－20 ℃條件下保存。

1.8 轉(zhuǎn)化子的制備與收集

1.8.1 酵母感受態(tài)細(xì)胞的制備

Y187 菌株在酵母浸出粉蛋白胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose, YPD）培養(yǎng)基上劃線，于30 ℃條件下培養(yǎng)2～3 d；挑取直徑為2～3 mm的單克隆于3 mL YPD 培養(yǎng)液中，于30 ℃、250 r/min 條件下培養(yǎng)8 h；從中吸取3～6 μL菌液加入到含有50 mL YPD 培養(yǎng)液的250 mL 錐形瓶中，于30 ℃、250 r/min 條件下培養(yǎng)16～18 h，待D（600 nm）為0.15～0.30時(shí)，將菌液平均分裝到2個(gè)50 mL的離心管中，室溫下以700g離心5 min，去上清液；用新鮮的100 mL培養(yǎng)液重新懸浮菌體，于30 ℃、250 r/min條件下培養(yǎng)，待D（600 nm）為0.40～0.50時(shí)，將菌液平均分裝到2 個(gè)50 mL 的離心管中，室溫下以700g離心5 min，去上清液；加入3 mL 1.1×Tris-EDTA（TE）/LiAc重懸菌體；將菌液放入2個(gè)1.5 mL離心管并吹打均勻，以最大轉(zhuǎn)速離心15 s，去上清液，加入600 μL 1.1×TE/LiAc溶液吹打均勻，備用。

1.8.2 Y187 酵母菌株轉(zhuǎn)化

在無(wú)菌、預(yù)冷的1.5 mL 離心管中加入20 μL ds cDNA、6 μL pGADT7-Rec（0.5 μg/μL）、20 μL鯡魚精DNA（載體DNA需提前于100 ℃條件下加熱5 min，以進(jìn)行變性處理），然后立即將試管置于冰水中冷卻，備用。將600 μL感受態(tài)細(xì)胞加入DNA中，輕輕渦旋振蕩混合；加入2.5 mL聚乙二醇/LiAc溶液，輕輕渦旋振蕩混合；于30 ℃條件下溫育45 min，每隔15 min混合一次細(xì)胞；向細(xì)胞中加入160 μL二甲基亞砜，混合后于42 ℃條件下水浴20 min，每隔10 min混合一次細(xì)胞；以700g離心5 min，棄上清液；用3 mL 酵母擴(kuò)增液體培養(yǎng)基重新懸浮，于30 ℃條件下溫育，以240 r/min 搖動(dòng)90 min；以700g離心5 min，棄上清液，用30 mL 0.9%NaCl溶液重新懸浮細(xì)胞。

1.8.3 選擇轉(zhuǎn)化子

在每個(gè)直徑為150 mm平板上鋪300 μL 1.8.2節(jié)轉(zhuǎn)化后的液體，共計(jì)100 塊平板，倒置于30 ℃溫育平板3～6 d直至克隆出現(xiàn)。

1.8.4 收集轉(zhuǎn)化子

于4 ℃條件下冷卻平板3～4 h，每個(gè)平板加入5 mL 冷凍培養(yǎng)基。用無(wú)菌玻璃棒輕輕攪動(dòng)使細(xì)胞進(jìn)入液體，收集所有液體至燒瓶中，混合均勻，計(jì)算細(xì)胞的密度。分別鋪100 μL 按照1×102、1×103、1×104倍稀釋的溶液于直徑為100 mm 的SD/－Leu 平板上，以確定文庫(kù)的滴度；于30 ℃條件下溫育2～3 d直到克隆出現(xiàn)。

1.9 克隆鑒定

挑取克隆，于30 ℃、250 r/min條件下培養(yǎng)過(guò)夜；在室溫下，以1×104r/min 離心2 min，去上清液；用200 μL 0.2%十二烷基硫酸鈉重懸菌液，在室溫下，以1×104r/min 離心2 min，取上清液作為模板進(jìn)行PCR鑒定及電泳檢測(cè)。其中，重組率/%=重組成功數(shù)量/克隆總數(shù)×100。

2 結(jié)果與分析

2.1 捻轉(zhuǎn)血矛線蟲L3 期幼蟲總RNA 的提取與質(zhì)量檢測(cè)

將捻轉(zhuǎn)血矛線蟲L3 期幼蟲研磨后使用TriZol法提取總RNA，一共提取了7個(gè)樣品，標(biāo)記為1～7。如圖1 所示，樣品5 的條帶最亮，可看到清晰的28S rRNA 和18S rRNA 條帶，且28S rRNA 和18S rRNA長(zhǎng)度之比為2，經(jīng)NanoDrop 2000紫外分光光度計(jì)測(cè)定其總RNA 質(zhì)量濃度為1 157 ng/μL，D（260 nm）/D（280 nm）=1.96，說(shuō)明其總RNA 質(zhì)量和純度較高，滿足構(gòu)建文庫(kù)的要求，故選取樣品5的總RNA用于下一步實(shí)驗(yàn)。

圖1 捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的總RNAFig.1 Total RNA extracted from H.contortus

2.2 cDNA 擴(kuò)增合成和均一化處理結(jié)果

對(duì)cDNA進(jìn)行雜交、DSN消化以及2次放大后得到均一化的ds cDNA。如圖2 所示，均一化后的ds cDNA均勻分散，沒(méi)有特定片段的不均勻富集。此外，其長(zhǎng)度范圍與非均一化的ds cDNA基本相似。

圖2 cDNA及均一化ds cDNA質(zhì)量檢測(cè)Fig.2 Quality test of cDNA and normalized ds cDNA

2.3 cDNA 均一化效率驗(yàn)證

用18S rRNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，結(jié)果如圖3 所示。產(chǎn)物經(jīng)電泳后用Tanon GIS 軟件分析灰度，結(jié)果顯示均一化后的cDNA 豐度比非均一化時(shí)下降95%以上。

圖3 cDNA均一化效率檢測(cè)Fig.3 Efficiency test of cDNA normalization

2.4 捻轉(zhuǎn)血矛線蟲文庫(kù)的建立及滴度測(cè)定

將pGADT7-Rec 和分離純化后的ds cDNA 轉(zhuǎn)化Y187 酵母感受態(tài)細(xì)胞，涂板培養(yǎng)后獲得捻轉(zhuǎn)血矛線蟲Y2H文庫(kù)。如圖4所示，經(jīng)過(guò)1×104倍稀釋后文庫(kù)菌液在平板上共長(zhǎng)出約350 個(gè)克隆。經(jīng)計(jì)算，文庫(kù)滴度大于3.5×107CFU/mL。收集所有轉(zhuǎn)化子，得到捻轉(zhuǎn)血矛線蟲酵母cDNA文庫(kù)。

圖4 cDNA文庫(kù)滴度鑒定Fig.4 Test of cDNA library titer

2.5 捻轉(zhuǎn)血矛線蟲cDNA文庫(kù)插入片段鑒定結(jié)果

從SD/－Leu平板上隨機(jī)挑取24個(gè)SD/－Leu單菌落進(jìn)行PCR鑒定。結(jié)果（圖5）顯示，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度主要集中在1 000～2 000 bp 之間，平均長(zhǎng)度1 000 bp，文庫(kù)重組率為100%。以上結(jié)果表明，cDNA文庫(kù)質(zhì)量合格，可用于后續(xù)酵母雙雜交篩選實(shí)驗(yàn)。

圖5 cDNA文庫(kù)重組率和插入片段cDNA長(zhǎng)度Fig.5 Recombinant rate of cDNA library and the inserted cDNA length

3 討論

目前研究蛋白質(zhì)間相互作用（PPI）的方法有很多，例如免疫共沉淀、GST-Pull down 技術(shù)、雙分子熒光互補(bǔ)以及熒光共振能量轉(zhuǎn)移等。但是，這些方法都只能單個(gè)驗(yàn)證PPI，并不適用于大規(guī)模篩選。而Y2H 系統(tǒng)不僅可以單個(gè)驗(yàn)證PPI，還可以從大量蛋白質(zhì)中篩選出相互作用的蛋白質(zhì)，且Y2H系統(tǒng)更加靈敏，除了能檢測(cè)到穩(wěn)定的PPI外，還能檢測(cè)到微弱而短暫的PPI。但Y2H 也有PPI 發(fā)生率較高的假陽(yáng)性缺點(diǎn)[13]，因此在經(jīng)過(guò)初篩之后，還需進(jìn)行一對(duì)一雜交驗(yàn)證及反交驗(yàn)證。除此之外，構(gòu)建一個(gè)質(zhì)量合格的cDNA 文庫(kù)對(duì)于Y2H 篩選至關(guān)重要，這與總RNA 提取的純度和完整性密切相關(guān)[14]。本研究使用CHROMA SPINTM＋TE-400 柱純化ds cDNA，排除了小片段，避免其在后續(xù)試驗(yàn)中產(chǎn)生不必要的干擾[15]。

cDNA文庫(kù)應(yīng)用廣泛，可用于篩選通路上、下游互作蛋白，也可用于篩選功能調(diào)節(jié)蛋白，還可用于篩選轉(zhuǎn)錄因子等。Lü 等[16]利用艾美耳球蟲Y2H cDNA文庫(kù)篩選出了鈣依賴性蛋白激酶（EtCDPK4）的8 種互作蛋白，并進(jìn)一步闡明了鈣依賴性蛋白激酶CDPK 在鈣通道中的作用；ZHAO 等[17]使用環(huán)形泰勒蟲宿主動(dòng)物牛的B 細(xì)胞Y2H cDNA 文庫(kù)，篩選出了與環(huán)形泰勒蟲半胱氨酸蛋白酶TaCP 相互作用的宿主蛋白CRBN 和Ppp4C，發(fā)現(xiàn)這2 種蛋白參與了包括泛素化調(diào)節(jié)、DNA 修復(fù)、細(xì)胞凋亡和核內(nèi)小核糖核蛋白顆粒剪接過(guò)程在內(nèi)的許多細(xì)胞反應(yīng)過(guò)程，且TaCP 還可能參與調(diào)節(jié)信號(hào)傳導(dǎo)途徑和細(xì)胞增殖；YANG 等[18]基于煙草K326 的cDNA 文庫(kù)，篩選了硝酸還原酶基因（NIA1和NIA2）啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄因子，其鑒定出的轉(zhuǎn)錄因子為植物硝酸還原酶的研究提供了理論支持?；诖?，為了研究與捻轉(zhuǎn)血矛線蟲滯育、蛻皮、免疫等相關(guān)蛋白質(zhì)的分子機(jī)制，本課題組利用本研究中構(gòu)建完成的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲cDNA 文庫(kù)進(jìn)行相關(guān)互作蛋白的篩選工作，目前已篩選并鑒定出了一些與之具有相互作用的蛋白，并正在進(jìn)行更加深入的研究。

在過(guò)去的一段時(shí)間里，有幾種捻轉(zhuǎn)血矛線蟲抗原的研究已經(jīng)取得了顯著的進(jìn)展[19-21]。目前，Barbervax?WormVax疫苗已在澳大利亞獲得了商業(yè)使用許可[22]，此疫苗包含2種來(lái)自捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的天然完整腸膜蛋白（H11和H-gal-GP），但該疫苗組合需要反復(fù)接種才能刺激高抗原特異性和長(zhǎng)效循環(huán)抗體水平，因而在大規(guī)模應(yīng)用中存在一些弊端。雖然注射疫苗是一種十分有效的控制寄生蟲的策略，但是寄生蟲的廣泛遺傳變異和免疫調(diào)節(jié)特性阻礙了疫苗的開發(fā)[23]。因此，全球研究人員一直致力于通過(guò)開展相關(guān)分子機(jī)制的研究，開發(fā)可有效對(duì)抗捻轉(zhuǎn)血矛線蟲感染的疫苗靶標(biāo)，并對(duì)候選疫苗的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行深入探究，以研發(fā)出一種有效、安全和耐用的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲疫苗。隨著分子生物學(xué)、免疫學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的不斷發(fā)展，尋找成分明確且特異性強(qiáng)的重組抗原已成為研究捻轉(zhuǎn)血矛線蟲病抗原以及疫苗的一個(gè)重要方向，應(yīng)用cDNA 文庫(kù)篩選便是發(fā)現(xiàn)新抗原的快速、有效途徑[24-25]。同時(shí)，還可以利用cDNA文庫(kù)篩選目前具有較好免疫效果的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲抗原互作蛋白，做成二聯(lián)苗，進(jìn)一步提高免疫效果。

綜上所述，捻轉(zhuǎn)血矛線蟲cDNA 文庫(kù)的建立對(duì)于篩選功能已知的重要蛋白的互作蛋白，揭示其參與的生物過(guò)程的分子機(jī)制以及研發(fā)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲疫苗都具有重要意義。

4 結(jié)論

本研究成功構(gòu)建了重組率為100%，插入片段平均長(zhǎng)度為1 000 bp，工作液細(xì)胞密度大于3.5×107CFU/mL 的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲酵母cDNA 文庫(kù)，可以用于篩選與特定誘餌蛋白存在相互作用的蛋白，探究未知基因功能，完善已知基因的功能驗(yàn)證，為進(jìn)一步了解捻轉(zhuǎn)血矛線蟲相關(guān)分子機(jī)制及研發(fā)抗捻轉(zhuǎn)血矛線蟲疫苗奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。